Введение к работе
Актуальность проблемы. Рибосома представляет собой нуклеопротеид, основной функцией которого является перевод информации, закодированной в мРНК, в белок при помощи тРНК. В состав бактериальной рибосомы входят две субчастицы, которые состоят из рибосомной РНК и рибосомных белков. Рибосомная РНК содержит множество модифицированных пуклеотидов, которые располагаются преимущественно в функционально-важных частях рибосомы. Наиболее часто встречающимися модифицированными нуклеотидами рРНК является псевдоуридин и нуклеотиды, метилированные по различным положениям гетероциклического основания или по 2' положению рибозы. Функция некоторых модифицированных пуклеотидов заключается в обеспечении устойчивости бактерий к антибиотикам за счет изменения участка связывания антибиотика в рибосоме. Функция модифицированных пуклеотидов в рРНК Escherichia coli, не придающих клетке устойчивость к антибиотикам, изучена слабо. Модификацию рРНК бактерий производят специализированные ферменты - рРНК-метилтрансферазы и псевдоуридинсинтазы, каждая из которых специфична для одного или нескольких модифицированных пуклеотидов. Модификация рРНК происходит на разных стадиях сборки субчастиц рибосомы. Существуют ферменты, специфичные к рРНК, к промежуточным интермедиатам сборки и к уже собранным субчастицам. На сегодняшний день модифицирующие рРНК ферменты слабо изучены, хотя они могут играть важную роль в процессе сборки рибосомы. Исследование субстратной специфичности и кинетических характеристик ферментов, модифицирующих рРНК, необходимо для понимания процесса сборки и функционирования рибосомы.
В данной работе мы использовали штамм с делецией гена rsmD, в котором отсутствует метилирование G966 в 16S рРНК. Это позволило охарактеризовать субстратную специфичность, кинетические свойства и область связывания рРНК метилтрансферазы RsmD с 30S субчастицами рибосомы Escherichia coli, а также изучить фенотип клеток, лишённых этой модификации.
Цель работы.
-
Исследовать комплексообразование рРНК метилтрансферазы RsmD с различными субстратами.
-
Определить кинетические характеристики рРНК метилтрансферазы RsmD.
-
Изучить активный центр связывания SAM рРНК метилтрансферазы RsmD.
-
Исследовать область связывания рРНК метилтрансферазы RsmD с 30S субчастицами рибосомы.
Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе данной работы была охарактеризована рРНК метилтрансфераза RsmD. Оказалось, что фермент специфично модифицирует 30S субчастицы рибосомы, не взаимодействуя с 16S
рРНК и 70S субчастицами рибосомы. Модификация происходит на последнем этапе сборки субчастиц, до включения в инициацию трансляции. Целевой для RsmD нуклеотид G966 располагается в Р-участке рибосомы, однако его роль в процессе трансляции ещё не ясна. Модификация данного положения для рибосомы происходит более эффективно, чем взаимодействие с тРНК и мРНК. Только наличие инициаторных факторов позволяет мРНК и тРНК вытеснить метилтрансферазу RsmD из комплекса с 30S субчастицей.
Метилтрансфераза RsmD образует устойчивый комплекс с 30S субчастицами, константа диссоциации данного комплекса на два порядка ниже, чем для других рРНК метилтрансфераз. Оказалось, что и каталитические свойства метилтрансферазы RsmD отличают её от остальных рРНК метилтрансфераз. RsmD на три порядка быстрее других рРНК метилтрансфераз модифицирует 30S субчастицы рибосомы. Возможно, это связано с необходимость модифицировать данный нуклеотид в Р-участке рибосомы в ограниченный промежуток времени между окончанием сборки 30S субчастиц и инициацией трансляции. Взаимодействие метилтрансферазы с субчастицами не влияет на процесс инициации, так как после модификации метилтрансфераза теряет способность взаимодействия с субчастицами.
Метилтрансфераза RsmD относится к группе ферментов, в основе строения которых укладка Россмана. Домен связывания SAM имеет стандартные для данной группы мотивы - 58DxFxGxG и п DPPF. Метилтрансфераза RsmD образует прочный комплекс с SAM. Активный центр RsmD необычно устойчив к мутациям консервативных аминокислот. Для инактивации оказалось необходимым заменить 3 аминокислоты активного центра, тогда как для других подобных ферментов одиночные мутации соответствующих аминокислот приводят к инактивации метилтрансфераз. Методом химического пробинга была определена область 16S рРНК, участвующая в связывании RsmD, что позволило построить модель взаимодействия RsmD с 16S рРНК.
Изучение рРНК метилтрансфераз важно для понимания механизмов появления антибиотикорезистентности. Во многих случаях появление устойчивых к антибиотикам штаммов обусловлено появлением специфических метилтрансфераз, модифицирующих рибосомную РНК. Также возможно, что некоторые рРНК метилтрансферазы, не несущие функцию защиты от антибиотиков, служат природным резервуаром для эволюции генов устойчивости к антибиотикам.
В рамках данной диссертационной работы охарактеризована метилтрансфераза RsmD, модифицирующая гуанозин, расположенный в Р-участке рибосомы.
Апробация работы. Материалы диссертации многократно обсуждали на семинарах лаборатории химии рибонуклеопротеидов кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ им. Ломоносова; докладывали на конференциях: XV Международная Научная Конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2008» МГУ имени Ломоносова.
Москва, Россия. Апрель 8 - 12, 2008; Международная конференция ((Рибосомы» 2010. Орвието, Италия. Май 3-7, 2010; Международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». Москва, Россия. Ноябрь 17-19, 2010.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 115 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы. Материал иллюстрирован 67 рисунками и 10 таблицами. Библиографический указатель включает 121 цитированную работу.
