Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Общая характеристика флавоноидов и их гликозидов 10
1.1.1. Классификация флавоноидов 10
1.1.2. Биосинтез флавоноидов 26
1.1.3. Гликозиды флавоноидов 30
1.1.4. Ацилированные флавоноиды 32
1.1.5. Спектральные методы исследования флавоноидов 33
1.1.6. Химические методы исследования флавоноидов 41
1.2. Структурное разнообразие и биологическая активность фенольных соединений Equisetum arvense L. и Equisetum silvaticum L 44
1.3. Флавоноиды Pseudosophora alopecuroides L 56
1.4. Заключение к литературному обзору 61
Глава 2. Обсуждение результатов исследований 63
2.1. Флавоноиды Equisetum silvaticum L 65
2.2. Флавоноиды и диэфиры фталевой кислоты из надземной части Equisetum arvense L 82
2.2.1. Диэфиры фталевой кислоты 82
2.2.2. Флавоноиды Equisetum arvense L 86
2.3. Флавоноиды Pseudosophora alopecuroides L 97
Глава 3. Экспериментальная часть 106
3.1. Методы исследования 106
3.2. Флавоноиды из Equisetum silvaticum L 107
3.3. Флавоноиды и фталаты надземной части Equisetum arvence L 114
3.3.1. Производные фталевой кислоты надземной части Equisetum arvence L 114
3.3.2. Флавоноиды надземной части Equisetum arvence L 115
3.4. Флавоноиды надземной части Pseudosophora alopecuroides L 118
3.5. Флавоноиды корней Pseudosophora alopecuroides L 120
Выводы 123
Литература 124
- Гликозиды флавоноидов
- Химические методы исследования флавоноидов
- Флавоноиды и диэфиры фталевой кислоты из надземной части Equisetum arvense L
- Флавоноиды надземной части Equisetum arvence L
Введение к работе
Актуальность темы. Исследование природных метаболитов растительного происхождения - одна из важнейших задач фитохимии. Растения являются неиссякаемым источником разнообразных и уникальных по структуре соединений, обладающих широким спектром фармакологической активности. Среди важнейших классов природных соединений, обуславливающих лечебный эффект лекарственных растений, значительное место занимают флавоноиды. Широкий спектр биологического действия и малая токсичность ставят их в ряд соединений, перспективных в плане создания новых лечебных средств. Многочисленные исследования показали, что препараты, созданные на основе флавоноидов являются высокоэффективными противоопухолевыми, противовоспалительными, антибактериальными средствами, обладают антиоксидантными свойствами, снижают риск заболеваний сердечно-сосудистой системы и, что ценно, имеют низкую токсичность.
Объектами нашего исследования являются растения Equiselum arvense /..(хвощ полевой) и Equiselum sylvaticum L. (хвощ лесной), а также Pseudosophora alopecuroides L. (ложнософора лисохвостная). Эти представители флоры богаты флавоноидами различных групп.
Хвощ полевой и хвощ лесной распространены почти на всей территории России, кроме пустынных районов и Крайнего Севера. Встречаются на песчаных лугах, в пойменных лесах, в зарослях кустарников, в посевах, а также в лесной зоне России, Украины, Беларуси. Широко применяются в народной, а хвощ полевой и в официальной медицине.
Ложнософора лисохвостная - трудноискоренимый карантинный сорняк, произрастающий по влажным местам - берегам рек и оросительных каналов, среди тугайных растений, реже в степях и пустынях. Распространена в Малой Азии, Афганистане, Тибете, в европейской части России, на Кавказе, в Западной Сибири, Казахстане, в Крыму, в Средней Азии.
На сегодняшний день на фармацевтическом рынке создан ряд лекарственных препаратов, обладающих широким спектром фармакологического действия на основе экстрактов хвоща полевого, а также ложнософоры лисохвостной.
В частности, препарат "Марелин", препарат "Хвощ полевой" компании "Биола", косметический гель "Миллениум", который питает, укрепляет коллагеновые волокна соединительной ткани, играет очень важную роль в придании эластичности кожи. БАД "Уролизин" изготовлен ООО "Биолит", г.Томск является источником флавоноидов. Суммарный флавоноидный препарат "Фланорин" из корней с корневищами ложнософоры лисохвостной на различных моделях экспериментального гепатита показал высокую лечебную активность, превосходящую соответствующий эффект известных лекарственных препаратов. Поэтому изучение флавоноидов указанных выше растений, произрастающих в различных регионах, выделение и изучение их химической структуры и биологической активности, разработка способов получения относится к актульным задачам.
Целью данной работы является исследование химического состава флавоноидов и фталатов растений Equisetum arvense L., Equisetum sylvaticum L. и Pseudosophora alopecuroides L.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
- систематическое исследование качественного и количественного состава
флавоноидов и фталатов растений Equisetum sylvaticum L., Equisetum arvense L. и
Pseudosophora alopecuroides L.;
- разработка методики фракционирования, разделения и выделения флавоноидов и
фталатов из растительного сырья;
- идентификация и установление химического строения полученных веществ.
Основные положения, выносимые на защиту
результаты разработки методики выделения, разделения и очистки флавоноидов трех изученных видов растений:
результаты изучения химического состава флавоноидов и фталатов надземных частей хвоща полевого и хвоща лесного, произрастающих на территории ХМАО- Югры;
результаты изучения химического состава флавоноидов надземной части и корней ложнософоры лисохвостной;
- результаты сравнительного исследования состава флавоноидов двух видов
хвощей и выявление различий в их качественном и количественном содержании;
- результаты обнаружения новых источников флавоноидов (леспедин, вексибинол),
обладающих высокой биологической активностью.
Научная новизна. В результате настоящей работы проведено систематическое исследование качественного и количественного химического состава флавоноидов и других компонентов хвоща лесного, хвоща полевого и ложнософоры лисохвостной.
Из изученных растений выделены 24 индивидуальных соединений, в том числе 22 флавоноида и 2 производных фталевой кислоты. Из хвоща лесного выделено новое природное вещество - кверцетин-3-0-а-Ь-рамнопиранозил-4'-0-Р-0-глюкопиранозид, структурную формулу которого установили, используя различные химические превращения и современные физико-химические методы анализа.
Впервые в растениях рода Equisetum /,. обнаружены флавоноиды кемпферол-3-O-P-D-галактопиранозил-7-О-а-І.-рамнопиранозид, кемпферол-3,7-ди-0-а-1.-рамнопиранозид, лютеолин-4'-0-Р-0-глюкопиранозид. Кемпферол-З-О-рутинозил-7-О-а-Ь-рамнопирано-зид из хвоща полевого выделен впервые.
Установлено наличие фталатов в представителях рода Equisetum /.. Из надземной части Equisetum arvense L. выделены и идентифицированы диизооктифталат и бис(2-этил-гексил) фталат.
Проведен сравнительный анализ флавоноидов двух изученных видов хвощей и выявлено различие в их химическом составе. В хвоще лесном обнаружены гликозиды флавонолов кемпферола и кверцетина, тогда как в хвоще полевом наряду с гликоэидами вышеуказанных соединений найдены производные флавонов: апигенин, лютеолин и его гликозиды. Различие в химическом составе двух видов хвоща может быть использовано в хемосистематике видов и должно быть учтено при стандартизации травы хвоща полевого.
Изучены флавоноиды надземной части ложнософоры лисохвостной, из которой впервые выделены глаброл, изобавахин, инермин, генистеин, а из корней - софорафлава-нон I.
Практическая значимость работы состоит в разработке методики выделения веществ, в том числе ранее не описанных, из надземных частей хвоща лесного, хвоща полевого и ложнософоры лисохвостной, а также выявлении соединений с ценными фармакологическими свойствами. Леспедин, выделенный из хвоща лесного, обладает значительным гипоазотемическим действием, вексибинол, полученный из корней ложнософоры лисохвостной, запатентован в Японии в качестве противоязвенного препарата.
С целью рационального использования надземной части ложнософоры лисохвостной - отхода производства препарата "Фланорин" - изучены фенольные соединения надземной части ложнософоры лисохфостной. Выделенные нами флавоноиды входят в состав действующих компонентов вышеуказанного препарата и могут служить дополнительным источником флавоноидов при производстве "Фланорина". Проведенное исследование вносит значительный вклад в изучение химического состава хвоща лесного, хвоща полевого и ложнософоры лисохвостной.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, тезисы 7 докладов на Всероссийских и Международных конференциях.
Материалы диссертации докладывались на II Международной научно-практической конференции «Science and Education» (Мюнхен, Германия, 2012); V Всероссийской конференции с международным участием «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2012); Всероссийской школы-конференции с международным участием «Химия биологически активных веществ» «ХимБиоАктив-2012» (Саратов. 2012); VIII Международной научно-практической конференции "Теория и практика современной науки» (Москва, 2012); Первой Российской конференции по медицинской химии» (Москва, 2013); IX Всероссийской конференции "Химия и медицина" с Молодежной школой (Уфа-Абзаково, 2013); VI Всероссийской конференции "Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2014).
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 141 страницах машинописного текста, включает 5 таблиц, 20 рисунков, 9 схем и 192 литературных ссылок.
Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту.
Глава I содержит сведения о классификации, биосинтезе и методах установления строения природных флавоноидов, а также аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по современному состоянию исследований флавоноидов и фенольных соединений растений. Обобщены и систематизированы сведения по изучению химического состава, фармакологической активности и применению в медицинской практике данных растений.
В главе 2 представлена характеристика изученных растений, результаты химических исследований выделенных флавоноидов и фталатов.
В главе 3 экспериментальной части приведены методы исследований, способы выделения, очистки, физико-химические характеристики флавоноидов и фталатов изученных растений.
Результаты, полученные при проведении исследований, представлены в таблицах и на рисунках, которые приведены в тексте диссертации.
Личный вклад автора. Соискателем был выполнен анализ литературы по теме исследования, разработаны методические подходы к исследованию, проведена экспериментальная работа, анализ и интерпретации полученных результатов. Написаны статьи и подготовлены доклады на конференциях.
Гликозиды флавоноидов
Особенностью строения антоцианидинов является наличие свободной валентности у кислорода в пирановом кольце. Благодаря положительному заряду антоцианидины в кислом растворе ведут себя как катионы и образуют соли с кислотами, в щелочном растворе — как анионы и образуют соли с основаниями. В зависимости от рН среды изменяется и окраска. Они придают растительным тканям разнообразную окраску — от розовой до черно-фиолетовой. Окраска антоцианов объясняется особенностями их строения — числом и расположением гидроксильных и метоксильных групп и способностью образовывать комплексы с ионами металлов [23-26,28]. Антоцианидины обычно встречаются в природе в виде гликозидов антоцианов, причем наиболее типичным является цианидин (3,5,7,3 ,4 пентагидроксиантоцианидин) (6). В растениях встречаются также дельфини-дин (3,5,7,3 ,4 ,5 -гексагидроксиантоцианидин) (8), мальвидин (3,5,7,4 -тетра-гидрокси-3 ,5 -диметоксиантоцианидин) (10) и др. Встречаются соединения с семи гидроксильными группами [25,28]. Метилирование гидроксилов еще больше увеличивает разнообразие оттенков. R, X он на _ + XXR2 HO f\ AAJL-Rj UL s чОН сг \ OGlc СГ он ОН пеларгонидин R!=R2=OH (5) пеларгонии R!=R2=OH (11) цианидин R,=OH, R2=H (6) цианин Rj=OH, R2=H (12) пеонидин R,=ОСH3, R2=H (7) пеонин R]=OCH3, R2=H (13) дельфинидин R,=R2=OH (8) дельфин R!=R2=OH (14) петунидин Ri=OCH3, R2=OH (9) петунии R!=OCH3, R2=OH (15) мальвидин Rj=R2=OCH3 (10) мальвинин R,=R2=OCH3 (16) Базовой структурой флаванонов является система 2,3- дигидро-4Н-1-бензопиранона-4, содержащая фенильный заместитель в положении С-2 [29-31]. Они имеют один хиральный центр (С-2) и теоретически могут существовать в форме двух изомеров и одного рацемата. Для природных флаванонов, как правило, характерна 28-конфигурация хирального атома углерода С-2 и экваториальное положение фенильного кольца В [23,32].
Флаваноны в отличие от флавона не имеют двойной связи между углеродами С-2 и С-3. Их УФ-спектры имеет один интенсивный максимум поглощения при 289 нм. Флаваноны не содержат хромофоров, поэтому не имеют окраски. В присутствии щелочей кольцо флаванонов раскрывается и образуются халконы. В кислой среде халконы превращаются в флаваноны. Многие природные флаваноны представляют собой бесцветные оптически активные (часто левовращающие) вещества. Они встречаются как в свободном виде, так и в виде гликозидов. Одной из наиболее распространенных групп флаванонов являются соединения, содержащие пренильные, гераниль-ные, лавандулильные и другие терпеноидные заместители, которые могут быть присоединены к ароматическому ядру флаванона как через кислород, так и непосредственно С-С-связью [23-25, 29-31].
Нарингенин Ri=H, R.2=OH (19) Эриодиктиол Ri=R2=OH (20) Рис. 1.3. Наиболее распространенные флаваноны Флаванонолы (дигидрофлавонолы) отличаются от флаванонов наличием ОН группы при С-3 и, подобно катехинам, содержат два ассиметри-ческих атома углерода в молекуле (С-2 и С-3). Базовой структурой флаванонов является система 2,3-дигидро-4Н-1-бензопиранона-4, содержащая фе-нильный заместитель в положении С-2. Для подавляющего большинства природных флаванонолов известна 2R,ЗR-кoнфигypaция, соответствующая транс-форме с экваториальным положением заместителей у хиральных атомов С-2 и С-3 [23,24,32]. Например, дигидрокверцетин (23) из лиственницы сибирской является 2R,3R-CTepeoH30MepoM с траяс-диаксиальным положением атомов водорода Н-2 и Н-3 и соответственно диэкваториальным положением фенильного кольца у атома С-2 и гидроксильной группы у атома С-3. Два других z/wc-стереоизомера — (2S,3R) и (2R,3S) — между собой соотносятся как энантиомеры. Они очень лабильны и поэтому в растениях не накапливаются в больших количествах. К настоящему времени из растительных источников выделены все изомеры дигидрокверцетина в гликозилированной форме. z/wc-Стереоизомеры дигидрокверцетина менее стабильны и достаточно легко эпимеризуются в соответсвующие транс-изомеры. Процесс эпи-меризации подобен процессу халкон-флаванон изомеризации. Например, в кислой среде гетероциклическое кольцо дигидрокверцетина (23) раскрывается с образованием халкон-подобного соединения, а при замыкании цикла может меняться конфигурация атома С-2 по сравнению с исходной (схема 1.1
Эпимеризация в ряду стереоизомеров дигидрокверцетина по С-2 УФ-спектры флаванонолов имеет один интенсивный максимум поглощения при 289 нм. Флаванонолы не содержат в себе хромофоров, поэтому не имеют окраски. В растениях наиболее распространены пинобанк-син (21), аромадендрин (дигидрокемпферол) (22), таксифолин (дигидроквер-цетин) (23) (Рис. 1.4.). [29-31]. НО он о Пинобанксин R]=R2=H (21) Аромадендрин R]=OH; R2=H (22) Таксифолин R!=R2=OH (23) Рис.1.4. Наиболее распространенные флаванонолы Флавоны - обширная группа соединений растительного происхождения [23-25,33-40]. Флавоны содержат двойную связь в гетероциклическом кольце между С-2 и С-3. Вследствие этого они довольно стабильны и имеют желтую окраску. Базовой структурой флавонов является конденсированная система бензольного кольца и у-пирона, т.е. система 4Н-1-бензопиранона-4, содержащая фенильный заместитель в положении 2. Правилами ИЮПАК разрешено также использование тривиального названия флавона как 2-фенил-4Н-1-хроменон-4 (или 2-фенилхромон-4).
Множество флавоноидных соединений носят прочно укоренившиеся тривиальные названия, связанные с родовыми или видовыми названиями их растительных источников [23,38-40]. Обнаруживают флавоны в основном в надземных частях растений в период бурного роста и цветения. Из корней эти соединения также выделяют, хотя и не в таких больших количествах. Наиболее часто в растениях встречаются апигенин (5,7,4 - тригидроксифлавон) (27), лютеолин (5,7,3 ,4 -тетрагидроксифлавон) (29) и другие (Рис. 1.5.). Многие природные флавоны представляют собой метилированные, О- и С-пренилированные, метилендиокси-, пирано- и фуранофлавоны, флавон-кума-риновые гибриды, а также структуры с различными комбинациями перечисленных заместителей [33-40].
Новые 2 ,5 -замещенные флавоны обнаружены в основном у видов семейства Asterасеае [37,40]. Также большое количество новых флавонов было выделено из растений семейств Lamiaceae и Rutaceae. Это в основном довольно необычные пента- и гексазамещенные флавоны (от полностью гидроксилированных, до пента- и гексаметоксифлавонов). Небольшое количество новых соединений рассматриваемой группы обнаружено в растениях семейств Fabaceae и Mimosaceae [36,37].
Химические методы исследования флавоноидов
Кольцо С несет большую информацию о принадлежности молекулы к той или иной группе флавоноидов. Как отмечалось выше, протон Н-3 флавонов резонирует при 6,3 м.д. (синглет), протон Н-2 изофлавонов (13-расположение к С=0 группе) - в области 7,60-7,88 м.д., а такой же протон у флаванонов резонирует в виде двух дублетов в области около 5,2 м.д. как результат взаимодействия протона Н-2 с двумя протонами Н-3.
Чаще других в природе встречаются флавоны с флороглюциновым типом замещения кольца А, т.е. в виде 5,7-диоксипроизводных, поэтому протоны Н-6 и Н-8 во флавонах и флавонолах резонируют в виде двух дублетов в области 6,0-6,7 м.д. с характерной для мета-положений константой спин-спинового взаимодействия равной 2,4-2,7 Гц. Сигналы протонов Н-8 прописываются в более слабом поле по сравнению с сигналами протонов Н-6: для флавонов, изофлавонов и флавонолов сигнал Н-6 прописывается при 6,0-6,2; Н-8 - при 6,3-6,5; для флаванонов и дигидрофлавонолов Н-6 - при 5,75-5,95; Н-8 - при 5,90-6,10 м.д.
Наличие углеводного фрагмента в положении С-7 вызывает сдвиг сигналов протонов в слабое поле на 0,2-0,3 м.д. У всех флавонолов и дигидрофлавонолов с 5,7-диоксигруппировкой протоны Н-6 и Н-8 прописываются в более сильном поле, чем у соответствующих флавонов и флавонолов. Для изофлавонов очень характерным является сигнал протона при С-2. Он проявляется в виде синглета в слабом поле при 8,5-8,7 м.д. (при использовании растворителя ДМСО-с16) [75,76,78]. Сигнал протона при С-3 у флавонов проявляется также в виде синглета, однако в более сильном поле (6,3-6,4 м.д.) по сравнению с Н-2 изофлавонов, что обусловлено большей электронной плотностью при Н-3. Протон при С-5 у 5-дезоксифлавонов, флавонов и флавонолов дает дублет (J=8-9), обусловленный орто-взаимодействием с Н-6, со значением химического сдвига 7,8-8,2 м.д. [75,76,78]. Протоны при С-6 и С-8 у 5,7-дизамещенных флавоноидов дают дублеты (в результате взаимного мета-взаимодействия) при 5,7-6,9 м.д., причем сигнал Н-8 расположен в более слабой области по сравнению с таковым Н-6.
В случае совместного присутствия протонов при С-5, С-6 и С-8 сигнал Н-6 проявляется в виде квартета (J=8,0-9,0 и J=l,8-2,5 Гц) при 6,7-7,4 м.д. Такой характер сигнала обусловлен одновременным орто- и мета-взаимодействием с Н-5 и Н-8. Сигнал Н-8 проявляется в виде дублета в несколько более слабом поле, чем Н-6. Замещение в кольце В сказывается на характере сигналов незамещенных ароматических протонов. Так, в спектрах 4 -ОН и 4 -О-замещенных флавоноидов сигналы протонов при С-2 и С-6 проявляются в виде единого дублета при 7,3-7,5 м.д. (J=8,0-9,0 Гц). Аналогичный характер имеют сигналы протонов при С-3 и С-5 : они также проявляются в виде дублета при 6,8-7,1 м.д. (J=8,0-9,0 Гц). В спектрах 3 ,4 -диоксизамещенных флавоноидов сигнал протона Н-5 резонирует в виде дублет-дублетного сигнала или уширенного дублета около 6,7-7,1 м.д. с КССВ 8,5 Гц, а сигналы протонов Н-2 и Н-6 - в области 7,2-7,9 м.д. При этом сигнал протона Н-2 имеет константу спин-спинового взаимодействия 2,5 Гц, а сигнал протона Н-6 прописывается в виде квартета с константами 2,5 и 8,5 Гц.
При интерпретации ПМР-спектра сахарной части важным моментом является определение величины окисного цикла углеводного остатка, а также конфигурации гликозидного центра.
В спектрах ПМР сигналы протонов фуранозной формы проявляются в области более слабого поля по сравнению с протонами пиранозы, что позволяет однозначно установить характер сахарного цикла. Что же касается конформационных изомеров, то их идентифицируют по характеру сигнала аномерного протона. Так, константа спин-спинового взаимодействия (КССВ)
J=7-8 Гц свидетельствует о том, что аномерный протон является экватори альным, а углеводный остаток имеет -конфигурацию. В то же самое время значение КССВ J=2-3 Гц свидетельствует об аксиальном расположении аномерного протона и, соответственно, а-конфигурации гликозидного центра сахара [/J,/о, ol,ozj. Метод ядерно-магнитного резонанса углерода С позволяет идентифицировать атомы углерода агликона и гликозидной части, установить число атомов углерода, связанных с фенольными гидроксиль-ными группами, определить характер гликозидной связи (С- или О-гликозид), а также выявить все функциональные группы, связанные с кольцами молекулы и с сахарной частью [76,83,84]. Т Т / СТА Л Тї На основании сравнительного изучения параметров спектров "С Жг агликона и его гликозида можно установить место присоединения углеводного остатка в гликозидах. Гликозилирование фенольных ОН-групп обуславливает диамагнитный сдвиг атома углерода, связанного с кислородной функцией и парамагнитный сдвиг орто- и иора-углерода. Так, при гликозилиро-вании 7-ОН группы величина сильнопольного сдвига С-7 составляет 1,4-2,0 м.д., а величина слабопольного сдвига углеродных атомов в орто- (С-6 и С-8) и иора-положениях (С-10) составляет 0,5-1,0 и 1,5-1,8 м.д. соответственно. При гликозилировании фенольной ОН-группы в положении С-4 наблюдается почти такой же сдвиг [83,84].
Флавоноиды и диэфиры фталевой кислоты из надземной части Equisetum arvense L
Хвощ лесной — Equisetum sylvaticum (L.) — это многолетнее травянистое растение высотой до 60 см. Растет во влажных, затененных местах: тенистых, сырых лесах, кустарниковых зарослях, в ольшанниках, вблизи водоемов, по берегам лесных рек [95,96,136]. Стебель прямостоячий, округлый, тонкий, с полостью внутри, снаружи бороздчатый. Весенние (спороносные) стебли сначала светлые, позже, после созревания спор, приобретают зеленую окраску. Летние стебли бесплодные. Споры созревают в апреле и мае.
Растительное сырье заготавливали летом в 2009 году на территории Сургутского района. Воздушно-сухую надземную часть экстрагировали пятикратно 85%-этиловым спиртом при комнатной температуре. Затем экстракт разделили на близкие по полярности фракции, обрабатывая последовательно петролейным эфиром, хлороформом, этилацетатом, н-бутанолом.
Индивидуальные соединения из полученных фракций выделили методом колоночной хроматографии на силикагеле.
Элюированием колонки с этилацетатной фракцией надземной части хвоща лесного системой этилацетат-этанол (98:2) было получено вещество 32 состава С НюОб , М 268, которое представляет собой светло-желтые кристаллы с т.пл. 268-270С.
УФ-спектр данного соединения имеет максимумы поглощения при длине волны 266, 369 нм, что характерно для флавонолов [17,74-76]. Добавление ионизирующих и комплексообразующих добавок к спиртовому раствору вещества при снятии УФ-спектра приводит к следующим эффектам: с NaOH наблюдается батохромный сдвиг полосы I на 46 нм и полосы II на 15 нм, что свидетельствует о наличии фенольных гидроксильных групп в молекуле, с СНзСООЫа — батохромный сдвиг полосы I на 18 нм и полосы II на 8 нм, следовательно, гидроксильная группа в положении 7 свободна.
В ИК-спектре вещества 32 присутствуют полосы валентных колебаний гидроксильных групп (3323-3277 см" ), карбонил у-пирона (1662 см ), ароматических С=С - связей (1591см ).
В спектре ПМР вещества, снятом в ДМБО-ёб, проявляются сигналы протонов 3,5,7,4 - тетразамещенного флавонола (8н, м.д.): 6.19 (1Н, д, 2.0 Гц, Н-6), 6.44 (1Н, д, 2.0 Гц, Н-8), 6.93 (2Н, д, 8.9 Гц, Н-3 , 5 ), 8.05 (2Н, д, 8.9 Гц, Гц, Н-2 ,6 ), 12.49 (1Н, уш.с, 5-ОН).
В спектре ЯМР-13С проявляются сигналы атомов углерода исследуемого соединения (ДМБО-о б, 5, м.д.): 146.68 (С-2), 135.55 (С-3), 175.79 (С-4), 160.60 (С-5), 98.09 (С-6), 163.81 (С-7), 93.36 (С-8), 156.06 (С-9), 102.92 (С-10), 121.55 (С-11), 115.33 (С-2 ), 129.39 (С-3 ), 159.08 (С-4 ), 129.39 (С-5 ) 115.33 (С-6 ).
Непосредственным сравнением с подлинным образцом (ИК-спектр, ТСХ в системе 2), а также сравнением спектральных данных и физико-химических свойств с литературными сведениями, соединение 32 идентифицировали с 3,5,7,4 -тетрагидроксофлавоном (кемпферолом) [153,154]. HCL j\ JO-. OH он о (32) Вещество 93 состава СгіНгоОц, т.пл. 209-211С, масс-спектр (m/z): 286 (М+ агликона). В ИК-спектре соединения 93 наблюдаются полосы колебаний при 3440-3290 (ОН группы), 1679 (С=0 у-иирона), 1618, 1521 (ароматических С=С связей), 1100-1000 см" (С-0 связи гликозидов). УФ-спектр данного соединения имеет максимумы поглощения при -тах 264, 352 нм, что характерно для 3-О-замещенных флавонолов [17,74-76].
С ацетатом натрия наблюдается батохромный сдвиг полосы II на 7 нм и полосы І на 19 нм, что свидетельствует о наличии свободной 7-ОН группы. При добавлении АІСІз полосы I и II претерпевают батохромный сдвиг на 56 и 9 нм соответственно. Таким образом, изучением УФ-спектров флавоноида 93, снятых с добавлением ионизирующих и комплексообразующих реагентов, установлено наличие свободных фенольных гидроксильных групп в положениях 5,7 и 4 флавонового ядра [17,74-76].
В спектре ПМР вещества 93, снятом в ДМ80-СІ6, проявляются сигналы ароматических протонов 3,5,7,4 — тетразамещенного флавонового ядра: Н-6 (6.14 м.д., уш.с), Н-8 (6.36 м.д., уш. с), Н-2,6 (8.00 м.д., д, 9.0 Гц) и Н-3,5 (6.86 м.д., д, 9.0 Гц), аномерного протона Н-1 (5.43 м.д., д, 7.5 Гц) и других протонов углеводного остатка (3.05-3.55 м.д., м). Сигнал протона хелатной 5-ОН группы проявляется при 12.61 м.д. в виде уширенного синглета.
Из данных ИК- и Н-ЯМР-спектров следует, что рассматриваемое вещество относится к гликозидам. В результате кислотного гидролиза вещества 93 получили кемпферол (3,5,7,4 —тетрагидроксифлавон) состава С15Н10О6, М+286, А,тах 269, 373 нм, т.пл.269-271 С и D-глюкозу.
Флавоноиды надземной части Equisetum arvence L
Экстракция и выделение веществ надземной части. Высушенную и измельченную надземную часть (2,7 кг) ложнософоры лисохвостной экстрагировали при комнатной температуре 5 раз хлороформом. Соотношение массы сырья к объему растворителя сотавляет 1:5. Объединенный хлороформный экстракт (0,5 л) отгоняли, густой остаток растворяли в горячем этаноле, разбавили водой в соотношении 1:1 и выпавший осадок отделяли фильтрованием. Фильтрат сгущали в вакууме, остаток (56,0 г) высушивали и хроматографировали на колонке (140 х 10 см) с силикагелем (1120 г) в градиентной системе растворителей хлороформ-гексан. Собирали фракции по 100 мл.
При элюировании колонки смесью хлороформ-гексан (70:30) выделили 0,16 г глаброла 142. При дальнейшем элюировании колонки смесью хлороформ-гексан (80:20) получили 0,23 г изобавахина 143, увеличив содержание хлороформа до 85%, выделили 0,25 г инермина 160. Элюированием колонки смесью хлороформ-гексан (95:5) и дальнейшей перекристаллизацией из 70%-ного этанола получили 0,45 г генистеина 69.
Глаброл (142). С25Н28О4, М+ 392, т.пл. 136-137 С, [а]о -39,2 (с 1,13 метанол); тах288, 311 (перегиб) нм, (lg є 4,05; 3,77); +СНзСОСЖа 257, 284, 324, 330; +СНзСЖа 295, 329, 333; +А1С1з 287, 312; ИК-спектр (см ): 3390 (ОН), 1661 (С=0), 1602, 1587, 1517 (ароматические С=С-связи). Масс-спектр, (%): М+ 392 (93), 377 (5), 349 (70), 337 (18), 205 (36), 204 (30), 189 (16), 188 (20), 149 (100), 133 (40). Спектр Н-ЯМР см. в тексте.
Диацетилглаброл (142а). К раствору 15 мг глаброла в 1 мл пиридина добавляли 2 мл уксусного ангидрида и выдерживали в течении 1 часа. Реакционную смесь разбавили холодной водой, выпавший осадок отделили фильтрованием, высушивали и перекристаллизовали из метанола. Получили 13 мг диацетата с т.пл. 107-108С. Н-ЯМР (CDCI3): 2,24 (6Н, с, 2 х Аг ОСОСНз).
Дициклоглаброл (1426). К раствору 24 мг глаброла в 4 мл метанола добавили 2 мл концентрированной хлористоводородной кислоты и кипятили на водяной бане 3 часа. Реакционную смесь разбавили водой и экстрагировали эфиром (3 раза по 25 мл). Эфирное извлечение промыли водой, высушили безводным сульфатом натрия, фильтровали, упарили досуха. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем в бензоле. Получили 14 мг кристаллического вещества с т.пл. 126-128 С, А,тах 277, 309 нм (lg 4,15; 3,80). Н-ЯМР-спектр (CDCI3, 5н, м.д.): 1,25 [с, 2 х С(СНз)г], 1,53-1,90 (м, 2 х Аг-СНг-СНг), 2,63 (т, 65 Гц, 2 х Аг-СНг-СНг), 2,67-2,96 (м, 2Н-3), 5,27 (дд, 11,5 и 5,0 Гц, Н-2), 6,2-7,78 (Н-5,6, Н-2 ,5 ,6 ). Изобавахин (143). С20Н20О4, М+ 324, т.пл. 204-205 С, [а]о -45,8 (этанол); Х.тах 287, 312 нм (lg 3,91; 3,78); +СНзСО(Жа 288, 337; +СНз(Жа 290, 348; +А1С1з 290, 311. Масс-спектр, (%):М+ 324 (77), 309 (5), 281 (68), 269 (20), 256 (75), 205 (19), 204 (21), 189 (21), 149 (100), 120 (32). Спектр Н-ЯМР см. в тексте.
Инермин (160). С16Н12О5, М+ 284, [ot]o -211,4 (этанол), т.пл. 179-180 С; УФ-спектр: А,тах 282, 288, 309 нм; lg є 3,55; 3,61, 3,74. Спектр Н-ЯМР см. в тексте.
Метиловый эфир инермина (22 ). Раствор 25 мг инермина в 15 мл безводного хлороформа обрабатывали эфирным раствором диазометана и смесь оставили в холодильнике на 5 ч. Процесс метилирования повторяли два раза. После упаривания растворителей и перекристаллизации из этанола получили 17 мг монометилового эфира с т.пл. 134-135 С. УФ-спектр: 281, 287, 311 нм. Н-ЯМР-спектр (CDCI3): 3,79 м.д. (с, -ОСНз). Генистеин (5,7,4 -тригидроксиизофлавон, 69). С15НЮО5, М+ 270, т.пл. 299-302 С; УФ-спектр: Хтгх 263, 329 нм (lg є 4,42; 3,81); +СНзСОСЖа 272, 323; +А1С1з 271, 369; +А1С1з/НС1 272, 370; +СНзОЫа 275, 328; ИК-спектр (см ): 3425, 1656, 1618, 1575, 1510, 1360, 1310, 1180, 1048. Масс-спектр: М+ 270 (100), 153 (69), 152 (36), 124 (11), 118 (20). Спектр Н-ЯМР см. в тексте. Триацетат генистеина (69а). Из 20 мг генистеина ацетилированием смесью 1 мл пиридина с 2 мл уксусного ангидрида получили 16 мг триаце-тильного производного с т.пл. 208-210 С, М+ 396.