Содержание к диссертации
Введение
1. Определение внутримолекулярных расстояний в белках методом флуоресценции 8
1.1. Диполь-дипольный резонансный перенос энергии 9
1.1.1. Теоретические основы 9
1.1.2. Зависимость переноса энергии от ориентации донора и акцептора 12
1.1.3. Подбор донорно-акцепторных пар и способы их введения в биополимер 25
1.1.4. Примеры определения внутримолекулярных расстояний по переносу энергии 34
1.2. Обменно-резонансное и нерезонансное гашение флуоресценции. Определение расстояния меаду флуорофором и тушащей группой 45
1.2.1. Тушение ароматических флуорофоров имин-оксильными радикалами 45
1.2.2. Тушение флуоресценции остатков триптофана функциональными группами белка 48
2. Структура триптшан-содержащего фрагмента нейротоксинов. токсин-рецепторное взаимодей ствие 54
2.1. Нейротоксины короткого типа 54
2.1.1. Флуоресценция нейротоксинов и их моноацетильных и моноспин-меченых производных 56
2.1.2. Влияние рН на флуоресценцию нейротоксинов и их производных 59
2.1.3. Тушение флуоресценции нейротоксина II и его моноацетильных производных ионами иода 66
2.1.4. Поляризация флуоресценции и вращатель ная релаксация нейротоксина II 69
2.1.5. Флуоресценция тринитрофенильного и монодансильных производных нейротоксина II. Перенос энергии 72
2.2. Нейротоксины длинного типа 84
2.2.1. Спектры кругового дихроизма 85
2.2.2. Флуоресценция остатков триптофана в нейротоксинах длинного типа 88
2.2.3. Тушение флуоресценции триптофанилов в длинных нейротоксинах акриламидом и йодидом калия 90
2.2.4. Влияние рН на флуоресценцию 93
2.2.5. Флуоресценция и ЕД-спектры монодансильных производных нейротоксина I 98
2.3. Взаимодействие нейротоксина II с ацетилхолиновым рецептором 105
2.3.1. Спектральные свойства солюбилизированного ацетилхолинового рецептора и его комплексов с флуоресцентно-мечеными производными нейротоксина II 107
2.3.2. Равновесные параметры связывания ней ротоксина II и его производных с солюбилизированным рецептором 114
3. Экспериментальная часть 119
3.1. Материалы, аппаратура и методы измерений. 119
3.2. Определение межхромофорных расстояний 124
3.3. Расчет констант диссоциации и стехиометрии токсин-рецепторных комплексов 125
Выводы 129
- Обменно-резонансное и нерезонансное гашение флуоресценции. Определение расстояния меаду флуорофором и тушащей группой
- Нейротоксины длинного типа
- Взаимодействие нейротоксина II с ацетилхолиновым рецептором
- Определение межхромофорных расстояний
Введение к работе
Одной из узловых проблем физико-химической биологии является изучение молекулярных основ возникновения и распространения нервного импульса. Современные достижения в этой области в значительной мере определяются исследованиями строения и функционирования ацетилхолинового рецептора ( AChR ), выделяемого из электрических органов рыб. AChR представляет собой гликопротеин, локализованный на постсинаптической мембране, состоит из пяти субъединиц и имеет молекулярный вес около 270000 /1-3/. Изучение рецептора едва ли могло быть успешным без такого эффективного инструмента исследования, каким являются полипептидные нейротоксины постсинаптического действия из яда змей. Нейротоксины образуют чрезвычайно прочные комплексы с AChR , блокируя связывание агонистов /4,5/. В результате в рецепторе уже не могут индуцироваться специфические процессы, которые в норме приводят к увеличению К+ - На* проницаемости постсинаптической мембраны /6,7/. Благодаря этим свойствам, постоинаптические нейротоксины находят широкое применение как для выделения и тестирования чистоты препаратов рецептора, так и для изучения его структуры и механизма действия.
Нейротоксины постсинаптического действия из яда змей представляют собой небольшие белки с молекулярным весом 7000-8000. По длине полипептидной цепи и количеству внутримолекулярных ди-сульфидных связей они подразделяются на короткие (60-62 аминокислотных остатка, 4 дисульфидных связи) и длинные (71-74 остатка, 5 дисульфидных мостиков) нейротоксины /8,9/. Высокая степень гомологии первичной структуры и сходство фармакологического дейст- вия служат важными аргументами в пользу подобия их пространственной организации. Поэтому выяснение особенностей строения отдельных представителей этого класса белков служит основой познания структуры токсинов в целом.
К 1983 г. установлены аминокислотные последовательности более чем 60 нейротоксинов /9/ и к тому же для многих из них получены селективно меченые производные. Благодаря этому появляется возможность на таком обширном ряде сравнительно простых белков проследить в деталях за тем, как при одинаковой пространственной организации и общем механизме действия, индивидуальные особенности аминокислотной последовательности отражаются на кон-формационной лабильности, равновесной динамике нативной структуры и биологической активности.
В Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР в течение ряда лет химическими и физическими методами проводятся комплексные исследования конформации нейротоксинов в растворе и топографии токсин-связывающего участка ацетилхолинового рецептора из электрического органа ската Torpedo maimorata. Настоящая работа является частью этих исследований и посвящена установлению расположения функционально важных остатков лизина и триптофана в нейротоксинах короткого и длинного типа из яда кобр Naja nigricollis , JTaja naja oxiana Haja naja siamensis, а также изучению взаимодействия нейротоксина короткого типа к. п. oxiana с ацетилхолиновым рецептором. Исследование проводилось методами флуоресцентной спектроскопии в сочетании с круговым дихроизмом и УФ-спектроскопией. Выбор флуоресценции как ведущего метода обусловлен прежде всего тем, что флуоресценция выделяется среди методов спектроскопии электронных переходов разно- образием параметров, отражающих структурно-функциональное состояние объекта исследования. Кроме того, рекордная чувствительность флуоресценции позволяет работать с низкими концентрациями белков, что весьма существенно при иззгчении токсин-рецепторного взаимодействия.
Обменно-резонансное и нерезонансное гашение флуоресценции. Определение расстояния меаду флуорофором и тушащей группой
Свойства нитроксильных радикалов как тушителей объясняются несколькими причинами /42/. Грин, Сингер и Парке /148/ исследовали зависимость скорости тушения флуоресценции ряда ароматических углеводородов ди-третбутил-нитроксидом в растворах различной вязкости. Они установили, что тушение происходит тогда, когда молекулы флуорофора и радикала сближаются на расстояние примерно равное сумме их радиусов 4-6 А. Так, пирен и антрацен пол- о ностью тушатся радикалом при расстоянии 4+0,2 и 6+0,2 А, соответственно. Анализируя полученные результаты и литературные данные, Грин с соавт. заключили, что главная причина тушения состоит в том, что в присутствии парамагнитного тушителя запрещенные переходы между возбужденными уровнями флуорофора становятся более вероятными вследствие обменно-резонансного взаимодействия флуорофора с радикалом. В принципе, тушение возможно и за счет диполь-дипольного резонансного переноса энергии. Однако, молярные коэффициенты поглощения иминоксильных радикалов в области 250-700 нм, где лежат спектры флуоресценции, очень низки и фёрстеровский радиус о не превышает 5 А. Все же в некоторых случаях, когда радикал находится в неполярном окружении и благодаря этому имеет заметное поглощение, тушение может отчасти происходить за счет диполь-дипольного резонанса /149/. Лондон и Фейгенсон /150/, изучая тушение дифенилгексатриена, 2+ п-терфенила, грамицидина А и Са АТФ-азы спин-меченым фосфати- дилхолином, показали, что в мембранах тушение носит статический характер и исчезает, если флуорофор и спин-меченый фосфолипид разделены хотя бы одной молекулой фосфолипида. Дистанция наи- большего сближения флуорофора и радикала составила I0-II А, что о совпадает со средним латеральным расстоянием 8-II А между центрами соседних молекул фосфолипидов /151/. Одним из основных приложений метода тушения спиновыми метками является определение локализации флуоресцирующих групп относительно поверхности мембраны. Луизетти и соавт. /152/ измеряли тушение хлорофилла а, включенного в модельные мембраны, спин-мечеными производными стеариновой кислоты. Молекулы кислоты имели нитроксильные группы, связанные с 5, 12 и 16-ым атомами углерода ацильной цепи. Кроме того, использовались епин-меченые аналоги андростана и холестана. Расстояние спин-меток до поверхности мембраны в этих молекулах приблизительно известно /153/.
Тушение было максимальным для I (3,12) стеарата, на основании чего заключили, что порфириновое кольцо располагается вблизи полярной области мембраны. В последующем исследовании Луизетти и др. /154/ сравнили тушение хлорофилла и двух флуоресцентных зондов, пиренбутановой и пирендодекановой кислоты, в фосфолипид-ных везикулах спин-мечеными аналогами стеариновой кислоты. Тушение пиренбутановой кислоты, в которой ароматический хромофор располагается ближе к поверхности, было, как и в случае хлорофилла, максимальным I (3,12) стеаратом. Хайх и др. /155/ проверяли тушение грамицидина А, включенного в димиристоил фосфатидилхолиновые мультибислои с помощью того же набора спин-меченых аналогов стеариновой кислоты. Флуоресценция остатков триптофана сильнее всего тушилась I (3,12) стеаратом, что указывает на расположение ароматических остатков ближе к поверхности мембраны. Уэрнер и Ньгохаус /156/ определяли локализацию остатков лизина в липид-связанном предшественнике пептидогликана из staphylococcus aureus . Для этого пептидогликан, не имевдий собственной флуоресцирующей группы, был дансилирован по остатку лизина. Тушение оказалось максимальным в тех олучаях, когда радикалы располагались вблизи поверхности мембраны. Еще одной иллюстрацией определения расположения флуорофора в мембране служит изучение локализации ионофорного антибиотика 2+ А 23187 и его Са т комплекса в озвученных модельных везикулах /149/. Тушение осуществляли спин-мечеными жирными кислотами. Было показано, что А 23187 и его Са -комплекс локализованы в гидрофобной зоне мембраны. Описанные выше исследования демонстрируют возможности метода тушения спиновыми метками для определения локализации флуоро-фора в мембране. Тушение белковой флуоресценции иминоксильными радикалами может быть общим методом определения параметров белок-липидного взаимодействия и типов фосфолипидов, непосредственно контактирующих с мембранным белком /157-159/. При решении подобных задач, метод тушения флуоресценции выгодно отличается от ЭПР, ЯМР и калориметрии тем, что флуоресценция тушится только иммобилизованными на белке фоефолипидами и полностью отсутствует фоновый сигнал (кроме светорассеяния) от остальной части липидов. Следует, однако, указать, что при интерпретации экспериментальных данных вводится ряд допущении. Например, предполагается, что единственное отличие между тушащими зондами - это расстояние нитроксильного радикала до поверхности мембраны. Однако, некоторые другие свойства, которые потенциально могут влиять на тушениє, также изменяются от зонда к зонду. Анализ причин, могущих привести к ошибочной интерпретации, дан в обзоре Лондона /42/. Одна из причин состоит в том, что практически ничего не известно о влиянии взаимной ориентации нитроксильного радикала и флуорофора на тушение последнего. 1.2.2. Тушение остатков триптофана функциональными группами белка. Остатки триптофана присутствуют в подавляющем числе белков. Флуоресценция индольного хромофора триптофановых остатков сильно зависит от характера микроокружения, что позволяет рассматривать их, как естественные флуоресцентные метки белков.
Для того, чтобы лучше представить факторы, влияющие на триптофановую флуоресценцию, были изучены спектральные свойства большого числа модельных соединений индола. Подробные сводки данных по этим соединениям приведены в обзорах Лонгворта /43/ и 5урштейна /44а/. Было установлено, что все ионогенные группы белка, а также амидная группа и группы, содержащие атомы серы, способны тушить флуоресценцию индольного хромофора и были предложены механизмы объясняющие тушение. Согласно любому из них требуется определенное взаимное расположение индольного кольца и группы-тушителя. К сожалению, в большинстве случаев об относительном расположении флуорофора и тушителя известно только число атомов, их разделяющих (см., например, /160,164/). Первыми систематическими исследованиями геометрии пары индольное кольцо -тушитель являются, по-видимому, работы Шинитского и сотр. Ими был синтезирован ряд линейных и циклических пептидов и депсипеп-тидов, содержащих остатки триптофана и гистидина /162,163/. Было показано, что протонированное имидазольное кольцо является эффективным тушителем триптофановой флуоресценции. Сопоставление результатов исследования модельных соединений с данными по тушению флуоресценции остатков триптофана в лизоциме имидазолом и его производными при рН ниже рК имидазольного кольца /164/ позволило предположить, что тушение связано с образованием нефлу-оресцирующего комплекса с переносом заряда между индольным кольцом и имидазолий-катионом. Недавно, Шопова и Генов /165/ показали на примере субтилизина, что такое взаимодействие может действительно иметь место в белках. При рН-титровании субтилизина Uovo в области рН 4-12 ими было обнаружено тушение флуоресценции в диапазоне от 5 до 7. Спектры БД, а также положение максимума и полуширина полосы флуоресценции белка не зависели от рН в этом интервале, указывая на отсутствие конформационных превращений. Следовательно тушение обусловлено непосредственным взаимодействием индольного и имидазольного колец. Анализ рентгено-структурных данных показал,, что в субтилизине Hovo пространственно сближены остатки His2 8 и Trp241 . Боковые цепи этих остатков расположены параллельно друг другу на расстоянии около о 3,5 А (рис. 12),на основании чего заключили, что наиболее вероятный механизм тушения - образование комплекса с переносом заряда (сдвиг электронов индольного хромофора в сторону протониро-ванного имидазольного кольца).
Нейротоксины длинного типа
До последнего времени наиболее детальная информация о структуре в растворе и кристалле имелась лишь для нейротоксинов короткого типа (см. обзоры /169,173,8,9/). Рентгеноструктурный анализ длинного токсина из яда Uaja naja siameneis ( ST ) /177/ показал, что укладка его полипептидной цепи сопоставима с найденной для эрабутоксина 6 /167-170/, являющегося представителем токсинов короткого типа. Исследования методом ШДР нескольких нейротоксинов длинного типа /176-179,216-218/, а также их химически модифицированных производных /176-178/ подтверждают, что ход полипептидной цепи и расположение функционально важных остатков исследованных токсинов в растворе соответствует в основных чертах той же картине, которая была получена для ST в кристаллическом состоянии. Следует, однако, отметить, что кристаллы были выращены при рН 2,0-2,8 из раствора, содержащего 2-метил--2,4-пентандиол. Кристаллизация гомологичного нейротоксина I из яда Naja naja oxLana ( NT-I ) из ацетатного буфера, содержащего изопропанол, сопровождалась по данным КР-спектроскопии /194/ изменением конфигурации по крайней мере одной из пяти дисульфид-ных связей. В данном разделе работы представлены результаты исследования влияния рН раствора и химической модификации на конформацию ST и кт-1 . Аминокислотные последовательности этих токсинов, а также их производные, в которых в идентифицированные участки молекул введены ацетильная группа, спиновая и флуоресцентные метки, были показаны на рис. 13. П.2.1. Спектры кругового дихроизма нейротоксинов. . Спектры ST были получены в интервале рН 2,0-7,5, а для Нт-1 - в интервале 4,0-7,5 (рис. 20). Для ST нижней границей было выбрано то значение рН, при котором выращивали кристаллы этого бежа в работе /171/. В диапазоне рН 2,0-7,5 изменения полосы ароматических хромофоров (250-310 нм) ST не превышают точности измерений, тогда как в области поглощения пептидных хромофоров (190-250 нм) видны отчетливые, хотя и небольшие отличия (рис. 20). Величина рК, найденная из рН-зависимости эллиптичности полосы 227 нм (см. рис. 21), равна 5,4+0,1.
Поскольку по данным ЯМР /176-179/ единственной ионогенной группой ST , которая титруется в интервале рН 4-7, является имидазольное кольцо His22 наблвдаемые изменения Щ вызваны ионизацией этого остатка. В NT-I , также имеющем единственный остаток гистидина, но в С-концевом фрагменте молекулы (рис. 13), изменений в КД-спектре в том же диапазоне рН не обнаруживается (рис. 20). Отсутствие изменений в спектре NT-I является косвенным подтверждением того, что в случае ST таковые не обусловлены различием вкладов в КД нейтральной и ионной форм имидазольного кольца. Кроме того, постоянство амплитуды длинноволновой полосы ароматических хромофоров (250-310 нм, см. рис. 20) при рН-титровании позволяет предположить, что главная причина влияния рН на вид спектра в области 250-190 нм обусловлена не изменением вклада боковых цепей остат- ков тирозина или триптофана в наблюдаемый суммарный спектр. По-видимому, в ЭР в ответ на снижение рН от 7,5 до 4,0 происходит конформационный переход. При этом относительное содержание регулярных и неупорядоченной форм во вторичной структуре ST , рассчитанное на основании спектров КД по методу /219,220/, изменяется незначительно (в пределах 7%). Вклад антипараллельной -структуры составляет 26+3%, что хорошо согласуется с данными рентгено-структурного анализа ST /171/. Выполненные недавно ЯМР исследования ST /177-179/ и токсина В ftaja naja /218/ подтверждают, что ионизация остатка His22 практически не затрагивает вторичную структуру токсинов, однако оказывает заметный эффект на микроокружение этого остатка. П.2.2. Флуоресценция остатков триптофана в нейро-токсинах длинного типа. Параметры флуоресценции длинных нейротоксинов и производных ST представлены в табл. 8. Полосы флуоресценции обоих токсинов при возбуждении светом с длиной волны воз(5 297 нм имеют максимум и полуширину, характерные для поверхностных остатков триптофана /43,44/, и близки к тем значениям, которые были отмечены для коротких нейротоксинов OL и NT-II (см. табл. 4, рис. 15). Максимум излучения моноацетильного производного bys2 (jic)ST сдвинут на 5 нм в коротковолновую область по сравнению с натив-ным ST и, кроме того, квантовый выход этого производного понижен на ВО/о. Спектр КД моноацетильного производного в области пептидных хромофоров не отличается от спектра нативного токсина. /178/, то есть ацетилирование не влияет на вторичную структуру ST и значит наблюдаемые изменения флуоресценции не связаны с нарушением конформации токсина. В производном ST , в котором по -аминогруппе остатка Lys2 присоединена спиновая метка, квантовый выход снижен в 8 раз по сравнению с самим ST (табл. 8). Сильное тушение флуоресценции инвариантного Тгр29 иминоксильным радикалом, присоединенным к -аминогруппе остатка Lys27 , наблюдалось также в моноспин-меченом производном нейротоксина короткого типа ит-II (табл. 4). Этот эффект был объяснен сближенностью боковых цепей остатков Ьув27 и Tip29 до расстояния 4-6 А . Очевидно, что и в токсине длинного типа, ST , так же как и в коротких боковая цепь Lys является одной из групп, формирующих микроокружение индольного флуорофора. Подтверждением этому служат данные по тушению флуоресценции длинных токсинов нейтральными и заряженными внешними тушителями. П.2.3.
Тушение флуоресценции триптофанилов.-в длинных нейротоксинах акриламидом и йодидом калия. График тушения флуоресценции Lys27(Ac)ST йодидом калия, представленный в координатах Шгерна-Фольмера,имеет значительно меньший наклон, чем подобный график для нативного токсина (рис. 22, табл. 8), то есть ацетилирование остатка лизина приводит к снижению доступности индольного кольца иодид-иону. Причина снижения доступности кроется в ликвидации заряда боковой цепи Lys27 поскольку графики тушения ST и Ъув2 (Ас)БТ нейтральным тушителем, акриламидом, совпадают (рис. 22). Таким образом, боковая цепь остатка Lysfcl вносит доминирующий вклад в зарядовое окружение инвариантного остатка триптофана и входит, очевидно, в непосредственное окружение индольного кольца. Дополнительную информацию о локальном окружении триптофани-лов при исследовании методом тушения дает сопоставление дифферен- циальных спектров затушенных остатков триптофана с первоначальным спектром флуоресценции белка. В случае ST и Lys27(Ac)ST дифференциальные спектры флуоресценции, возникающие по мере добавления тушителей, совпадают по положению максимума и полуширине с первоначальным спектром белка или его производного. Дяя тгт-1 , напротив, разностный спектр затушенных акриламидом или йодидом триптофановых остатков сдвинут на 2 нмв красную область по сравнению с суммарным излучением нейротоксина в отсутствие тушителя (рис. 23). Очевидно, в нт-1 один из двух триптофанилов имеет более длинноволновую полосу эмиссии и более эффективно тушится. Таковым вероятнее всего является остаток ТгрЗЗ , который находится в участке центральной петли, имеющем конформацию уз-изгиба /І7І-І74/. При таком расположении индоль-ное кольцо ТгрЗЗ оказывается в более полярном и быстро релак-сирующем окружении и, следовательно, более доступно молекулам растворителя и низкомолекулярным растворенным веществам (молекулам тушителя), чем боковая цепь инвариантного триптофана, локализованного в уз-структурном фрагменте. П.2.4. Влияние рН на флуоресценцию. Исследование рН-зависимости флуоресценции ит-l , ST и Lys27(Ac)ST позволяет получить дополнительные сведения о функциональных группах, находящихся по соседству с остатками триптофана или опосредованно влияющих на их микроокружение. В щелочной области рН наблюдается снижение флуоресценции (рис. 24), связанное с титрованием ионогенннх групп, поскольку из кривой рН-зависимости я-метиламида ацетил-L-триптофана следует, что непосредственно гидроксил-ионы тушат флуоресценцию индольного флуорофора при рН выше 10. В диапазоне рН 7-Ю в нейро- токсинах титруются аминогруппы и фенольные кольца остатков тирозина. Известно, что аминогруппа является более эффективным тушителем в нейтральной форме, а боковая цепь остатка тирозина в ионной форме /44а/. В ST фенольный гидроксил остатка Туг2-5 имеет рК 11,3-11,4 /176,178/ (по другим данным выше 12 /179/).
Взаимодействие нейротоксина II с ацетилхолиновым рецептором
Никотиновый ацетилхолиновый рецептор ( AChR ) локализован на поетсинаптической мембране, функция его заключается в преобразовании "химического" сигнала - связывание нейромедиатора (ацетилхолина, никотина), в электрический - изменение трансмембранного потенциала /1-3/. Связывание рецептором молекул ацетилхолина приводит к открытию канала, через который за время жизни его в открытом состоянии ( 1 мсек) успевает пройти 10 ионов натрия, что и служит причиной деполяризации постсинапти-ческой мембраны /6,7/. В настоящее время основным объектом исследования является AChR , выделяемый из электрических органов скатов Torpedo и угря Electrophorus , поскольку концентрации рецепторного белка в электрических тканях этих рыб на два-три порядка выше, чем в других известных объектах. Никотиновый ацетилхолиновый рецептор из электрических органов рыб представляет собой субъединичный белок состава ос2уз -5" /173,225-228/. Каждая из субъединиц является гликопротеином и имеет молекулярный вес ос 50200, р 53681, у 56279 и 5 57565 (/9/ и ссылки там). Ограниченный протеолиз мембрано-связанного рецептора /229,230/, химическая модификация /231,232/ и иммунологические исследования /233-235/ показали, что все субъединицы являются трансмембранными. Методами рассеяния нейтронов и рентгеновского излучения /236-238/ и электронной микроскопии /173,237,239-241/ установлено, что молекула рецептора напоминает по форме воронку длиной П0 А и диаметром около 85 А, которая ориентирована перпендикулярно поверхности мембраны и выступает из нее во внеклеточное о пространство на 50-55 А /173,240/. Центральная полость, заключающаяся между субъединицами, служит, возможно, ионным каналом. Для объяснения влияния нейромедиаторов на функциональное состояние AChR было выдвинуто предположение о глобальных отличиях в структуре рецептора в состояниях с открытым и закрытым каналом /173,240/. Нейротоксины из яда змей способны образовывать чрезвычайно прочные комплексы с AChR (константа диссоциации 10 - 10" М), конкурентно ингибируя связывание молекул медиаторов ( AChR имеет два участка связывания агонистов и нейротоксинов) и препятствуя тем самым открыванию ионного канала.
Поэтому при изучении структуры и механизма функционирования AChR важную роль играют исследования взаимодействия рецептора с нейротоксинами и их химически модифицированными производными (см., например,/4,5,176, 177,240,242-253/). В настоящей работе для изучения топографии связывания нейротоксинов короткого типа с ацетилхолиновым рецептором из электрического органа ската Toipedo maimorata были использованы моно-дансильные производные Leu1(Dns)NT-II и Lys27(Dns)NT-II . ІЇ.З.І. Спектральные свойства оолюбилизированного ацетил-холинового рецептора и его комплексов с флуоресцентно-мечеными производными нейротокоина II. Положение максимума (329+1 нм) и полуширина (50+1 нм) полосы флуоресценции оолюбилизированного AChR (рис. 27) указывают на то, что основной вклад в излучение дают остатки триптофана, находящиеся в гидрофобном окружении /43,44/. Квантовый выход равен 0,10+0,01, т.е. практически совпадает со среднестатистической величиной 0,11 для внутренних остатков триптофана в белках /446/. Положение максимума триптофановой флуоресценции в исследованном нами препарате оолюбилизированного AChR (рис. 27) совпадает с найденными для мембрано-связэнного рецептора /255/, что свидетельствует о подобии микроокружения остатков триптофана рецепторного белка в солюбилизированном состоянии и в мембране. Расчет вторичной структуры оолюбилизированного в 0,025% Тритоне Х-100 рецептора, выполненный нами на основании спектров КД (рис. 28) по методу /219,220/, показал, что в АСШ содержится 30$ а-спиральных участков, 185 уз-формы, уз-изгибы присутствуют в количестве 14$, остальные 38$ приходятся на неупорядоченную форму. Ацетилхолиновый рецептор из Torpedo nobeliana солюбилизированный в эмульфогене ВС-720, содержал 34% а-спиралей, 29+3$ /Э-структуры и 37+3$ клубкообразной формы /256/. Определение вторичной структуры на основании анализа формы полосы Амид І в спектре комбинационного рассеяния реконструированного АСЪВ. выявило следующее соотношение регулярных и неупорядоченной форм; ос-спиралей - 25-39$, /з -формы - 34$, р, -изгибов - 16$ и клубка - 10-24$ /257/. Существование, причем довольно протяженных, ос-спиральных сегментов в мембрано-связэнном рецепторе было предложено на основании электроно-микроскопических данных /173,240/. Таким образом, можно полагать, что солюбилизация не слишком сильно искажает структуру AChR , ж данные по связыванию нейро-токсинов с высокоочищенным солюбилизированным рецепторным белком справедливы и для рецептора в его нативном мембрано-связанном состоянии. Добавление Lys27(Dns)NT-ii приводит к понижению интенсивности И КОРОТКОВОЛНОВОМУ СДВИГУ ПОЛОСЫ флуореСЦеНЦИИ AChR Разностный спектр погашенных остатков триптофана не совпадает с суммарным излучением рецепторного белка (рис. 27), хотя имеет положение максимума (332 нм) и полуширину (48 нм), также характерные для внутренних триптофаншгов. Несовпадение дифференциального спектра с "прямым" говорит о том, что связывание токсина понижает квантовый выход флуоресценции не всех остатков триптофана рецептора, а только тех, которые приближены к участку связывания нейротоксина.
Тушение обусловлено, по крайней мере отчасти, переносом энергии с остатков триптофана рецептора на дансиль-ную метку токсина, на что указывают следующие наблюдения: а) добавление аналогичного количества нативного NT-її не изме няет интенсивности флуоресценции рецептора; б) относительное увеличение интенсивности флуоресценции Dns - метки в комплексе по сравнению со свободным токсином значительно больше при переходе от длины волны возбуждения 330 нм, где погло щает только дансильный хромофор, к длине волны 298 нм, где пог лощают также остатки триптофана (рис. 29, табл. 1.0.). Помимо возрастания интенсивности наблюдается также коротковолновый сдвиг максимума флуоресценции Dns -метки, что указывает на переход дансильного флуорофора в более гидрофобное окружение /105/. Этот вывод согласуется с тем, что за счет переноса энергии тушатся именно внутренние остатки триптофана. Важно отметить, что коротковолновый сдвиг полосы до 545 нм, а также перенос энергии наблюдались нами и при образовании комплекса Lye2 (Dns)NT-ii с мембрано-связэнным рецептором. При добавлении производного, дансилированного по х-аминогруппе, к солюбилизированному рецептору полярность микроокружения метки, судя по неизменности положения максимума и амплитуды полосы флуоресценции, не отличается от таковой в свободном токсине (табл. 10). Из сказанного следует, что аминогруппы нейро-токсина различаются по степени контакта с поверхностью рецептора. Связывание Leu1(Dns)NT-li с рецептором обнаруживается по небольшому ( 30$) увеличению интенсивности дансилъной флуоресценции при возбуждении на 298 нм, то есть в условиях, когда возможен перенос энергии с триптофанилов рецептора на Dns -метку, а также по возрастанию поляризации флуоресценции (табл. 10). Для обоих монодансильных производных степень поляризации флуоресценции в буфере составляет 0,09-0,11 и увеличивается до 0,20-0,23 в комплексе (табл. 10). Время жизни возбужденного состояния дансилъной метки в производном Lys27(Dns)NT-il равно 7,4 не и при комплексообразовании должно возрастать пропорционально квантовому выходу в 1,5 раза, то есть до II не. В отсутствие броуновского вращения дансилъной метки предельное значение степени поляризации флуоресценции PQ = 0,34 /59/. Используя приведенные выше значения Т и Р и величину времени вращательной релаксации солюбилизированного ацетилхолинового рецептора р = 1170 нсек /254/, можно, в соответствии с уравнением Перрена, показать, что Р дансилъной метки в токсин-рецепторном комплексе должно быть не ниже 0,31. Поскольку квантовые выходы дансилъной флуоресценции ПРОИЗВОДНЫХ Lys27(Dns)NT-II И Leu1(Dns)NT-II близки, очевидно, и величины времени жизни флуоресценции в ука- занных производных не могут сильно различаться.
Определение межхромофорных расстояний
Эффективность резонансного диполь-дипольного переноса энергии рассчитывали по понижению квантового выхода флуоресценции донора: а также по сенсибилизации флуоресценции акцептора (для дансиль-ных аналогов) /52/: нилов в нативном токсине и соответствующем Dns - или Тпр -меченом производном; р и s.A - спектры поглощения (в единицах молярных коэффициентов экстинкции) дансилированного белка и соответственно дансильной метки (спектр модельного соединения Dns-beu )» "А - корректированный спектр возбуждения акцептора, нормированный по интенсивности со спектром поглощения дансилированного белка при 330 нм. Для того, чтобы исключить ошибку, вносимую переносом энергии с остатков тирозина, расчет Е выполняли для интервала длин волн возбуздения 290-300 нм. Расстояние, разделяющее донор и акцептор находили из уравнения: Критический радиус переноса энергии рассчитывали из соотношения (4). Показатель преломления среды принимали равным 1,5, как рекомендуется для спектральной области, в которой поглощают ароматические аминокислоты /50/. III.3. Расчет констант диссоциации и стехиометрии токсин-рецепторных комплексов. В соответствии с законом действия масс константа диссоциации комплекса определяется из уравнения: где [т] , [н] и [TR] - равновесные концентрации соответственно нейротоксина (Т), ацетилхолинового рецептора (R ) и токсин-рецепт орного комплекса ( TR ). Равновесные концентрации связаны с общими концентрациями токсина и рецептора в растворе соотношениями: где подстрочные индексы о и b означают полную концентрацию и концентрацию связанного токсина и рецептора. Если в рецепторном белке имеется п мест связывания токсина, тогда где ос - степень заполнения токсином связывавдих участков ре цептора. В соответствии с кривой титрования рецептора производ ным bys2 (Dns)HT-ll (рис. 29) степень связывания мошю определить как: Величина д F измерялась в двухлучевом режиме и представ ляет собой превышение интенсивности флуоресценции дансильной мет ки в производном Lys27(Dns)NT-ll , добавленном к раствору AChR , по сравнению с флуоресценцией этого производного в бу фере с детергентом (предварительные измерения показали, что Тритон Х-100 в концентрации 0,025% не влияет на флуоресценцию bys27bns)NT-ll ). Значения л F находили из зависимое- ти 1/ДР от 1/[т]0 , экстраполируя график до пересечения с осью ординат, как рекомендуется в работе /264/. Переходя от равновесных концентрации к общим, выражение для Kd можно переписать в следующем виде: Отсвда: линеен и имеет наклон, равный и , а по оси ординат отсекает отрезок, равный отношению константы диссоциации к общей концен трации рецептора, Kd/ [RJ0 . Аналогичное выражение было предложено в работе /265/ для определения Kd и п из кривых спектрофотометрического титрования. Константы связывания нативного NT-ІІ и производного Lys2 (АС)нт-п определяли по вытеснению флуоресцентно-меченого производного Lys2I7(Dns)HT-ii из комплекса с рецептором.
Кривую вытеснения представляли в линейных координатах, аналогичных тем, которые были использованы в работе /4/: где х означает нативный токсин либо его нефлуоресцирующее производное, т- монодансильное производное, TR и XR обозначают соответствующие токсин-рецепторные комплексы. Если к раствору рецептора добавлены одновременно флуоресцентно-меченый нейротоксин и нативный токсин (или его производное без флуоресцентной метки), тогда для констант диссоциации можно записать выражение: Значения Kd и [TR] находили, как описано выше для титрования рецептора монодансильным производным нт-и Расчет констант диссоциации и числа мест связывания из графиков в линейных координатах проводили с помощью программируе--мого микрокалькулятора ЇЇР-55 (США.); коэффициент линейной регрессии лежал в пределах 0,95-0,99. 1. Методами флуоресценции и Щ проведено исследование пост-синаптических нейротоксинов из яда кобр и ряда их селективно модифицированных производных. Показано, что введение меток не искажает структуру токсинов, благодаря чему флуоресцентно меченые производные могут служить адекватной моделью нативных белков при изучении токсин-рецепторного взаимодействия. 2. Установлено взаимное расположение боковых цепей функционально важного фрагмента -Lys26-Lys27rp28rp29- в молекуле нейротоксина II Naja naja oxiana и показано, что оно находится в соответствии с /з-структурной конформацией этого участка центральной петли нейротоксинов. Боковые цепи остатков Ьуа27И Тгр29 в нейротоксине длинного типа из яда Naja naja siamensis , также о как и в коротком нейротоксине II сближены до расстояния 4-6 А. 3. Нейротоксин II и его производные, модифицированные по остаткам Leu1 и bys27 , связываются с солюбилизированным рецептором в соотношении 2:1. Константы диссоциации токсин-рецеп-торных комплексов лежат в диапазоне от 0,3-КГ8 М (для нативного токсина) до.7 10"8 М(для производного Lys27(Dns)NT-II ) . 4. Боковые цепи функционально-инвариантных для коротких токсинов остатков Lys27 и Тгр29 при образовании токсин-рецепторного комплекса взаимодействуют с поверхностью рецептора, при-чем флуоресцентная метка на остатке Lyscl попадает в гидрофобное окружение. Флуоресцентная метка, связанная с к -концевым остатком нейротоксина II, напротив, контактирует с участком рецептора, содержащим полярные группировки.
