Введение к работе
Актуальность проблемы. ДНК-метилтрансферазы (МТазы) присутствуют в различных организмах, от бактерий до растений и животных. Одним из типов МТаз являются С5-МТазы, которые переносят метильную группу на атом углерода С5 остатка цитозина, образуя 5-метилцитозин. Донором метильной группы выступает кофактор S-аденозил-ь-метионин (AdoMet), который в ходе реакции превращается в 8-аденозил-ь-гомоцистеин (AdoHcy). В прокариотах МТазы функционируют, главным образом, как компоненты систем рестрикции-модификации, осуществляющих защиту клетки от проникновения чужеродной ДНК. В высших организмах метилирование ДНК играет ключевую роль в регуляции различных клеточных процессов, таких как транскрипция и импринтинг генов, эмбриональное развитие, репарация ДНК, конденсация хроматина. Отклонения от нормального уровня метилирования в клетках млекопитающих (как гипо-, так и гиперметилирование) связаны с возникновением рака. Показано, что первичные структуры МТаз млекопитающих в С-концевой части имеют высокую степень гомологии со структурой прокариотических С5-МТаз. В связи с этим, представляется важным изучение прокариотических С5-МТаз, которые могут служить моделями для изучения механизмов метилирования у млекопитающих.
Бензо[а]пирен (В[а]Р) является одним из полициклических ароматических углеводородов-загрязнителей, широко распространенных в окружающей среде. В организмах, подверженных воздействию В[а]Р, отмечено образование множественных мутаций, что в конечном итоге приводит к возникновению рака. Сам В[а]Р не является биологически активным, однако, при попадании в клетку он метаболизируется с образованием весьма реакционноспособных диолэпоксидов, которые могут ковалентно присоединяться к ДНК. При этом преимущественно модифицируются остатки гуанина с образованием стереоизомерных (+1-)-цис- и (+/-)-mpaHC-aHtnu-B[a]P-N2-dG аддуктов. Известно, что (+)- и (-)-mpaHC-aHinu-B[a]P-N -dG аддукты плохо поддаются репарации. Вследствие этого, они могут вызывать нарушение функционирования различных ферментов, взаимодействующих с ДНК, в том числе МТаз. Однако на сегодняшний день молекулярный механизм действия В[а]Р-повреждений на С5-МТазы не изучен.
Одним из объектов настоящей работы стала прокариотическая МТаза Hhal. Она узнает в ДНК последовательность GCGC и метилирует внутренний остаток цитозина участка узнавания (подчеркнут). M.Hhal является одной из наиболее изученных С5-МТаз: для нее разрешена пространственная структура и достаточно подробно изучен механизм действия. Это явилось предпосылкой выбора M.Hhal в качестве модельного фермента для изучения влияния В[а]Р-повреждений ДНК на метилирование.
Другим объектом работы стала M.SssI - уникальная прокариотическая МТаза, которая, как и эукариотические ферменты, узнает в ДНК последовательность CG. Благодаря этой особенности, M.SssI может служить прекрасной моделью для изучения метилирования ДНК эукариотическими ферментами. Этот фермент был обнаружен еще в 1985 году, однако на сегодняшний день он практически не изучен. В частности, нет данных о пространственной структуре и практически отсутствуют данные о механизме действия M.SssI. Известна первичная структура фермента, а также методом футпринтинга определены несколько функциональных групп ДНК, образующих контакты с ферментом. В нашей лаборатории методом компьютерного моделирования по гомологии была построена модель комплекса M.SssI-flHK-AdoHcy. Однако до сих пор функционального анализа аминокислотных остатков M.SssI не проводилось.
Цель работы. Целью работы явилось изучение влияния (+)- и (-)-транс-анти-В[а]Р-ЛГ-dG аддуктов на функционирование ДНК-метилтрансферазы Hhal, а также определение функционально значимых аминокислотных остатков M.SssI.
В работе решались следующие задачи: 1) определение влияния стереоизомерии В[а]Р-./V -dG аддукта и его локализации в ДНК на различные стадии реакции метилирования ДНК МТазой Hhal; 2) выбор аминокислот, предположительно существенных для функционирования M.SssI и сайт-направленный мутагенез гена sssIM с целью получения мутантных форм M.SssI; 3) изучение влияния вводимых аминокислотных замен на связывание и метилирование ДНК МТазой SssI и определение участия выбранных аминокислот в основных стадиях реакции метилирования.
Научная новизна и практическая ценность. В настоящей работе впервые был изучен молекулярный механизм действия В[а]Р на функционирование модельной прокариотической МТазы Hhal. Было изучено связывание и метилирование МТазой Hhal аналогов субстрата, содержащих (+)- и (-)-транс-анти-В[а]Р-Ы -dG-аддукты вместо остатков гуанина участка узнавания. Получены значения констант диссоциации комплексов M.Hhal с В[а]Р-ДНК, на основании которых установлено, что связывание ДНК при введении модификации ухудшается в 3.5-100 раз в зависимости от локализации и стереоизомерии аддукта. На основании анализа каталитических констант показано, что метилирование ДНК, содержащей В[а]Р-аддукты, затруднено или практически блокировано в зависимости от локализации аддукта в участке узнавания. Высказаны предположения о том, что в зависимости от положения В[а]Р-аддукта в участке узнавания и его стереохимии могут нарушаться как контакты каталитической петли M.Hhal (в частности, остатка Пе86) с малой бороздкой ДНК, так и контакты «узнающего» домена (в частности, остатков Ser252 и Gly256) с большой бороздкой ДНК. С учетом сходства первичных структур
прокариотических МТаз и каталитических доменов МТаз млекопитающих, можно предполагать, что повреждение ДНК В[а]Р будет оказывать похожее действие на метилирование в случае эукариотических организмов.
Далее, в работе с помощью метода сайт-направленного мутагенеза были получены конструкции для продукции мутантов M.SssI, содержащих единичные замены ряда аминокислот. Впервые были получены мутантные ферменты, содержащие замены остатков, предположительно участвующих в узнавании ДНК (К297А, N299A, S300G/P и S317A), стабилизации переходного комплекса с «выпетленным» остатком цитозина (S145A, Q147L, V188A, R232A и T313A/D/H) и катализе (Е186А и R230A). Было изучено связывание и метилирование ими ДНК. Показано, что остатки Glul86 и Arg230 играют важнейшую роль в катализе. Обнаружено, что остатки Serl45, Glnl47, Arg232 и Т313 участвуют в «выпетливании» цитозина из двойной спирали и стабилизации промежуточного комплекса, а Ser317 может участвовать в узнавании ДНК-мишени. Таким образом, впервые получены результаты, позволяющие достаточно детально описать механизм реакции метилирования ДНК МТазой SssI, а также подтверждена компьютерная модель этого фермента.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано две статьи. Результаты работы были представлены на международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004» и «Ломоносов-2005» (Москва, 2004 и 2005 г.г.), 31-м международном конгрессе FEBS (Стамбул, 2006 г.), международной конференции «Биокатализ-2007» (Санкт-Петербург, 2007 г.) и IV-м съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008 г.).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы (120 ссылок). Материал иллюстрирован 34 рисунками и 3 таблицами.
