Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 14
1.1. Красные водоросли - источник биологически активных соединений 14
1.2. Фотосинтетические пигменты красных водорослей 15
1.3. Факторы, влияющие на содержание фотосинтетических пигментов красных водорослей 20
1.4. Химическая структура полисахаридов красных водорослей 23
1.5. Особенности структурного анализа полисахаридов красных водорослей 27
1.5.1. Химические методы 28
1.5.2. Физико-химические методы 30
1.5.2.1. ИК-спектроскопия с Фурье-преобразованием 30
1.5.2.2. Спектроскопия 13СЯМР 33
1.5.2.3. Спектроскопия ЯМР 36
1.5.3. Ферментативные методы 37
1.6. Физико-химические свойства полисахаридов красных водорослей 40
1.7. Факторы, влияющие на качественные и количественные характеристики полисахаридов 44
1.8. Области использования полисахаридов красных водорослей 51
1.9. Биологическая активность полисахаридов 53
2. Результаты и обсуждение 57
2.1. Фотосинтетические пигменты красной водоросли A. flabelliformis 57
2.1.1. Факторы среды обитания водоросли 57
2.1.2. Пигментный состав водоросли A. flabelliformis в зависимости от факторов среды ее обитания 59
2.2. Полис ахаридный состав водоросли A. flabelliformis (карпо спорофит) в зависимости от факторов среды ее обитания 64
2.2.1. Содержание сухого вещества и общего растворимого белка в талломах А. flabelliformis 65
2.2.2. Количественный и качественный состав полисахаридов 67
2.3. Комплексное выделение фикобилипротеинов и полисахаридов водоросли А. flabelliformis 72
2.3.1. Выделение фикобилипротеинов и полисахаридов 73
2.3.2. Фракционирование фикобилипротеинов 75
2.3.3. Химический и структурный анализ полисахаридов 76
2.4. Структура полисахарида, выделенного из стерильной формы A. flabelliformis
2.4.1. Выделение, фракционирование и химический анализ полисахаридов... 78
2.4.2. Структурный анализ желирующего полисахарида 80
2.4.2.1. ИК-Фурье спектроскопия 80
2.4.2.2. Спектроскопия 1Я и 13С ЯМР 81
2.4.2.3. МАЛДИ масс-спектрометрия 85
2.5. Структура и свойства полисахарида, выделенного из репродуктивной (карпоспорофит) формы A. flabelliformis 91
2.5.1. Выделение и фракционирование полисахаридов ионообменной хроматографией 91
2.5.2. Очистка полисахарида от белка 94
2.5.3. Структурный анализ суммарного полисахарида методом ИК-Фурье спектроскопии 96
2.5.4. Фракционирование и химический анализ полисахаридов из А. flabelliformis 97
2.5.5. Структурный анализ желирующего полисахарида ИК- и ЯМР спектроскопией 98
2.5.6. Мягкий кислотный гидролиз полисахарида из A. flabelliformis 101
2.5.7. Масс-спектрометрический анализ продуктов ферментативного гидролиза полисахарида из A. flabelliformis 106
2.6. Биологическая активность полисахаридов из стерильной и репродуктивной форм A. flabelliformis Ill
2.6.1. Антикоагулирующая активность полисахаридов A. flabelliformis Ill
2.6.2. Влияние полисахаридов A. flabelliformis на образование АФК 113
3. Экспериментальная часть 115
3.1. Водоросли 115
3.2. Определение сухого вещества водоросли 115
3.3. Выделение фотосинтетических пигментов 115
3.3.1. Экстракция ФБП 0,1 М фосфатным буфером (метод 1) 115
3.3.2. Экстракция ФБП 1,5% водным раствором нитрата натрия (метод 2) 116
3.3.3. Выделение хлорофилла а и каротиноидов 116
3.3.4. Идентификация фотосинтетических пигментов 117
3.4. Выделение и фракционирование полисахаридов 118
3.5. Основные аналитические методы 118
3.6. Мягкий кислотный гидролиз 121
3.7. Ферментативный гидролиз 121
3.8. Определение молекулярной массы 122
3.8.1. Вискозиметрический метод 122
3.8.2. Молекулярные массы низкомолекулярных (НМ) производных полисахаридов 122
3.9. Очистка полисахарида от белка 123
3.9.1. Обработка полисахарида протеазой из Streptomyces caespitosus 123
3.9.2. Очистка полисахарида от белка по методу Севага 123
3.10. Хроматографические методы 123
3.10.1. Ионообменная хроматография на ДЕАЕ-целлюлозе 123
3.10.2. Гельпроникающая хроматография на биогеле Р-10 124
3.10.3. Адсорбционная хроматография на фосфате кальция 124
3.10.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) 124
3.10.5. Хромато-масс-спектрометрия 125
3.11. Физические методы анализа 125
3.11.1. ИК-спектроскопия 125
3.11.2. Спектроскопия ЯМР 125
3.11.3. Масс-спектрометрия 125
3.12. Биологическая активность полисахаридов 126
3.12.1. Антикоагулирующая активность 126
3.12.2. Влияние полисахаридов на образование активных форм кислорода (АФК) 127
3.13. Измерение параметров условий обитания водоросли 128
3.14. Статистический анализ 128
4. Выводы 130
5. Список литературы
- Факторы, влияющие на качественные и количественные характеристики полисахаридов
- Полис ахаридный состав водоросли A. flabelliformis (карпо спорофит) в зависимости от факторов среды ее обитания
- Фракционирование и химический анализ полисахаридов из А. flabelliformis
- Гельпроникающая хроматография на биогеле Р-10
Факторы, влияющие на качественные и количественные характеристики полисахаридов
R-фикоэритрины (R-ФЭ) - белки красного цвета с максимумом поглощения от 498 до 568 нм. В красных водорослях существует два спектральных типа R-ФЭ. Один из них содержит два пика поглощения при 498 и 565 нм и плечо поглощения при 540 нм в видимой области. Другой содержит три пика поглощения при 498, 540 и 565 нм. Первая модель R-ФЭ была названа R-ФЭ типа I, а вторая - R-ФЭ типа II [13]. R-ФЭ состоит из трех типов субъединиц: а ( 20 кДа), Р ( 20 кДа) и у ( 30 кДа) с молекулярной структурой (аР)6у и имеет молекулярную массу 240 кДа [44]. а-субъединица R-ФЭ содержит только две хромофорных группы фикоэритробилина (ФЭБ), в то время как Р- и у-субъединицы помимо ФЭБ содержат фикоуробилин (ФУБ) (рис. 1). При этом Р-субъединица включает два ФЭБ и один ФУБ, тогда как у-субъединица - три ФЭБ и два ФУБ. Сравнительные исследования R-ФЭ из 30 видов красных водорослей, принадлежащих семействам Bangiophyceae и Florideophyceae, показали, что R-ФЭ типа I содержится в одноклеточных красных водорослях, тогда как R-ФЭ типа II характерен для многоклеточных красных водорослей [45].
Фикоцианины - сине-голубые белки с максимумами поглощения от 585 до 630 нм. R-фикоцианин (R-ФЦ) имеет основной максимум поглощения при 615 нм, а также второстепенный максимум поглощения при 555 нм. Второстепенный максимум появляется благодаря наличию ФЭБ хромофоров в Р-субъединице, в дополнение к фикоцианобилиновым (ФЦБ) хромофорам. Молекулярная структура R-ФЦ - (аР)з, молекулярная масса составляет ПО кДа. а-субъединица R-ФЦ содержит одну хромофорную группу ФЦБ, тогда как Р-субъединица - по одному ФЦБ и ФЭБ. Благодаря присутствию в молекуле R-ФЦ ФЭБ, он обладает более пурпурной окраской, чем чисто голубой С-ФЦ, и флуоресцирует красным цветом [46].
Аллофикоцианины - синие белки с максимумами поглощения от 585 до 650 нм. Известно несколько форм АФЦ. Наиболее схожие из них имеют максимум поглощения при 650 нм. АФЦ несет только ФЦБ хромофор по одному на каждой субъединице. Он сохраняет а- и Р-субъединицы с очевидной структурой (оф)з и имеет светло-голубую окраску [43, 47].
ФБП обладают яркой окраской и интенсивной флуоресценцией, поэтому находят широкое применение в иммунофлуоресцентной диагностике, проточной цитометрии и других биологических исследованиях. Они весьма перспективны в косметической и пищевой промышленности, где преимущество использования натуральных красителей перед синтетическими достаточно очевидно [13]. Помимо этого, ФБП проявляют разнообразную биологическую активность [48]. Установлено, что ФЦ и АФЦ оказывают разрушительный эффект на свободные радикалы кислорода, а также реагируют с другими видами окислителей [15, 16, 17]. Было показано, что ФЦ, выделенный из спирулины, подавляет процесс перекисного окисления липидов в клетках живых организмов, являющийся одной из причин разрушения мембран, и ингибирует аллергические реакции организмов [19]. Установлено, что ФЦ обладает антикоагулирующей [18] и антивирусной активностями [49] и может применяться в качестве терапевтического средства в лечении заболеваний, вызванных стрессом. В последние годы рассматривается возможность применения ФБП в качестве противоопухолевых препаратов [13].
Хлорофиллы - магнийзамещенные производные порфирина - природные пигменты, которые придают зеленую окраску наземным растениям и водорослям и являются основными компонентами процесса фотосинтеза. По своему химическому строению хлорофилл близок к пигменту крови человека -гемоглобину (рис. 2) [50]. Функциональное значение основных элементов структуры хлорофилла заключается в следующем: сопряженные двойные связи ответственны за избирательное поглощение световой энергии; центральный атом магния стабилизирует структуру молекулы, участвует в образовании ассоциатов молекулы хлорофилла с другими пигментами, белками, липидами, фосфолипидами и другими компонентами хлоропласта; фитол способствует ориентации молекул хлорофилла определенным образом в мембране. Фитол не участвует в поглощении света, но влияет на этот процесс, меняя ориентацию порфиринового ядра хлорофилла [51].
Хлорофилл а, присутствующий в клетках красных водорослей, имеет максимум поглощения при 664 нм [52] и характеризуется лабильностью к действию различных физических и химических факторов, в том числе повышенной температуры и света [51].
Каротиноиды относятся к числу химических соединений, широко распространенных в растительном и животном мире. По своей химической природе каротиноиды представляют собой изопреноиды - чрезвычайно обширную группу веществ, молекулы которых состоят из различного числа звеньев изопрена С5Н8. Каротиноиды содержат 8 звеньев изопрена и являются тетратерпенами. Для соединений этого класса характерна система сопряженных двойных связей, а на каждом конце молекулы наличие замещенного циклогексенового (иононового) кольца (рис. 3). Эти кольца могут быть одинаковыми, как в ликопине, Р-каротине, или разными, как в а-каротине, лютеине и эхиненоне [53].
Фотосинтезирующие организмы, в частности красные водоросли, являются динамическими системами, способными реагировать на изменения окружающей среды. Эти изменения затрагивают структуру фикобилисом, их светопоглощающую способность и способность к переносу энергии [43]. Адаптивные перестройки, происходящие в водорослях в ответ на изменение параметров среды обитания (освещение, температура, концентрация биогенных элементов в морской воде) для поддержания жизнеспособности растений, сопровождаются изменениями в количестве и соотношении пигментов светособирающего комплекса [24, 26]. В связи с этим, изучение содержания фотосинтетических пигментов в процессе адаптивных перестроек водорослей позволяет оценить возможные механизмы, регулирующие продуктивность водорослей в течение их вегетационного периода, и представляет как фундаментальный, так и прикладной интерес.
Несмотря на то, что накопление пигментов в талломах водоросли определяется целым набором факторов, основными параметрами среды, влияющими на количественный состав пигментов, являются освещение и температура воды. При попадании в условия высокой освещенности растению необходимо акклиматизироваться, избегая при этом ингибирования фотосинтеза и разрушения фотосинтетического аппарата [25], тогда как при низкой освещенности водоросли должны поглотить как можно больше света для сохранения своей жизнеспособности. В регуляции этих процессов участвуют фикобилипротеины и каротиноиды.
На данный момент исследования, посвященные влиянию различных факторов на содержание пигментов красных макроводорослей, весьма немногочисленны. В отдельных экспериментах показано, что при увеличении интенсивности света увеличивается содержание некоторых каротиноидов в клетках и талломах водоросли. Показано, что апикальные части талломов Laurencia pinnatifida [58] и Gracilaria compressa [59], подверженные действию ФАР высоких интенсивностей, содержат высокие концентрации каротиноидов. Длительное пребывание водных растений при повышенной интенсивности света (неодинаковой для разных видов) приводит к уменьшению содержания фотосинтетических пигментов [60]. На примере красной водоросли L. pinnatifida показано, что высокие интенсивности падающего света понижают содержание ФБП на единицу ее биомассы [58]. Подобные результаты получены на морской красной водоросли Palmaria palmata [61]. Водоросль Gracilaria lemaneiformis, растущая на глубине, содержит в 2-3 раза больше ФЭ и хлорофилла а, чем водоросль, произрастающая в верхних слоях воды [62]. Предполагается, что у водоросли Gracilaria domingensis, произрастающей в Бразилии, увеличение количества ФБП при уменьшении освещенности связано с оптимизацией поставки световой энергии, а, следовательно, и скорости фотосинтеза [25, 63]. В то же время, высокий уровень ФАР способствует увеличению содержания каротиноидов, что может быть связано с непосредственной их функцией как фотопротекторов фотосинтетического аппарата водоросли [63]. Аналогичная обратно пропорциональная зависимость между содержанием ФБП и освещенностью отмечена и для водорослей P. palmata и Devaleraea ramentacea, произрастающих у берегов Норвегии [24].
Известно, что фотоны УФ излучения, особенно УФ-Б часть спектра, действуют на биологические процессы на всех уровнях их организации от молекулярного до экосистемного, в первую очередь, нарушая функцию белок-синтетического аппарата [64]. В последнее время достаточно большое количество работ показывает, что увеличение УФ радиации вызывает многочисленные повреждения ДНК, белков, замедляет рост растений, а также может снижать фотосинтетическую активность, как водорослей, так и фитопланктона, изменять соотношения фотосинтетических пигментов [64]. Так, было показано, что в результате совместного длительного воздействия ФАР и УФ на водоросли Laurencia catarinensis и Palisada flagellifera происходило значительное снижение ФБП и наблюдались изменения в структуре тилакоидных мембран [65].
Полис ахаридный состав водоросли A. flabelliformis (карпо спорофит) в зависимости от факторов среды ее обитания
Пигменты были выделены из замороженных в жидком азоте и хранящихся при -80С талломов водоросли A. flabelliformis (10 см, однородный цвет), собранной в феврале-декабре 2009 г. в естественных местах обитания в Амурском заливе (мыс Красный) с глубины 2 м. Все собранные водоросли были представлены репродуктивной формой (карпоспорофитами). Экстракцию фикобилиновых пигментов проводили охлажденным 0,1 М фосфатным буфером (рН 6,8), а хлорофилла а и каротиноидов - охлажденным 90% ацетоном. Идентификацию пигментов проводили спектральным методом по максимумам поглощения, характерным для ФЭ в области 565 нм, ФЦ - 615 нм, АФЦ - 650 нм, хлорофилла а - 664 нм, каротиноидов - 480 нм. Содержание фикобилинов рассчитывали по формуле (1), хлорофилла а и каротиноидов - по формулам (2) и (3) соответственно, представленным в главе «Экспериментальная часть». Все полученные данные были обработаны статистически с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA и многорангового LSD-теста, а также расчета коэффициента Спирмена. На протяжении всего периода исследования доминирующим пигментом в ряду фикобилипротеинов у A. flabelliformis был фикоэритрин, содержание которого колебалось от 55 до 70% в зависимости от сезона (рис. 6). Доля аллофикоцианина составляла 20-35% суммы красных пигментов, а фикоцианина - не превышала 15%. В целом диапазон содержания фотосинтетических пигментов A. flabelliformis в течение года был подобен отмеченному ранее для красных водорослей Японского моря [26, 213].
Сезонные изменения содержания хлорофилла а (Хл а) и каротиноидов (Кар) в талломах A. flabelliformis из Японского моря
В течение вегетационного периода A. flabelliformis максимальное содержание ФБП зарегистрировано для образцов водоросли, собранных в мае-июне (рис. 6), что связано, по всей вероятности, с резким снижением интенсивности света в период высокой повторяемости пасмурных дней поздней весной и в первую половину лета (табл. 5). Хлорофилл а является одним из основных фотосинтетических пигментов красных водорослей. Повышение содержания хлорофилла а и каротиноидов до максимальных годовых значений наблюдалось в период с декабря до начала апреля, когда было отмечено существенное снижение интенсивности света подо льдом зимой и ранней весной (табл. 5, рис. 7).
Подобные данные были получены ранее для красных водорослей черноморского побережья [214, 215]. Такая реакция пигментного аппарата морских растений относится к разряду адаптивных в ответ на понижение интенсивности света [216]. Однако не исключено, что повышенное содержание каротиноидов у А. flabelliformis в холодное время года (рис. 7) является приспособлением не только к низкой интенсивности света, но и к пониженной температуре воды (табл. 5, 6). Накопление каротиноидов, участвующих в защите фотосинтетического аппарата от фотоокисления, показано ранее для некоторых морских макроводорослей и высших растений при акклимации к низким и отрицательным температурам [217, 218].
Значения коэффициента корреляции Спирмена, характеризующего связь между содержанием фотосинтетических пигментов у A. flabelliformis и факторами среды в феврале-декабре 2009 г. Пигмент Температура воды ФАР ФЭ 0,305 -0,539 ФЦ -0,112 -0,799 АФЦ -0,150 -0,373 Хл а -0,308 -0,601 Кар -0,601 -0,657 Кар/Хл а -0,507 -0,428 ФЭ/Хл а 0,258 0,071 ФЭ/ФЦ -0,569 0,542 Примечание: ФЭ - фикоэритрин, ФЦ - фикоцианин, АФЦ - аллофикоцианин, Хл а -хлорофилл а, Кар - каротиноиды. Достоверные значения влияния факторов среды на содержание пигментов и их соотношение при Р 0,05 ( ), Р 0,01 ( ), Р 0,001 ( ) отмечены жирным шрифтом.
Во второй половине апреля, а также в июле-сентябре у A. flabelliformis было зарегистрировано достоверное (LSDest, Р 0,05) 2-3-кратное уменьшение содержания фотосинтетических пигментов до минимальных годовых значений (рис. 6, 7). По-видимому, это связано с тем, что после длительного периода подо льдом или в условиях пасмурной погоды с мая до второй половины июля водоросли, адаптированные к низкой освещенности, подвергались воздействию высоких интенсивностей солнечной радиации (табл. 5). Рассчитанные коэффициенты корреляции Спирмена, характеризующие взаимосвязь между содержанием пигментов и факторами среды, свидетельствуют о достоверной отрицательной корреляции между ФАР и содержанием пигментов в талломах водоросли (табл. 6). Аналогичное снижение уровней ФБП и хлорофилла а ранее также наблюдали у арктических красных водорослей Palmaria palmata и Devaleraea ramentaceae при попадании макрофитов под воздействие высоких интенсивностей ФАР и ультрафиолетовой (УФ) радиации сразу после таяния льда [24]. Снижение концентрации пигментов под действием высоких интенсивностей света в летний период также отмечали у некоторых зеленых и красных водорослей умеренных широт [219, 220, 221, 222]. Такая реакция пигментного аппарата растений может носить адаптивный характер и быть направленной на защиту реакционных центров и электронно-транспортной цепи от избытка падающего света [223]. Известно, что такие адаптивные перестройки происходят достаточно быстро и занимают от 4 до 6 дней [216, 224]. С другой стороны, высокие интенсивности солнечной радиации, особенно УФ-Б, могут оказывать повреждающее действие на пигментный комплекс водорослей, изменяя соотношения фотосинтетических пигментов или вызывая их обесцвечивание и повреждение мембранных липидов [60]. Действительно, в периоды высокой освещенности в Амурском заливе (июль-сентябрь) наблюдалось снижение соотношения Кар/Хл а (рис. 8), которое является потенциальным биоиндикатором фотоокислительных повреждений в клетках растений при действии сильного света [225]. Отмечена отрицательная корреляция (Спирмен тест, Р 0,05) между ФАР и соотношением Кар/Хл а (табл. 6). Таким образом, в апреле и с августа по сентябрь наблюдается снижение концентрации ФБП, хлорофилла а и каротиноидов у А. flabelliformis, что, скорее всего, является результатом подавления фотосинтетической активности водорослей.
Фракционирование и химический анализ полисахаридов из А. flabelliformis
Для получения предварительных данных о структуре полисахарида из карпоспорофита A. flabelliformis был использован метод ИК-Фурье спектроскопии. Полученный спектр полисахарида был сопоставлен со спектрами каррагинанов с известными предельными структурами. В ИК-спектре исследуемого полисахарида наблюдаемая интенсивная полоса поглощения в области 1240-1250 см" (рис. 22) указывает на присутствие значительного количества сульфатных групп (-S=0 ассиметричная вибрация) [123]. Полоса поглощения при 932 см" характерна для 3,6-ангидрогалактозы (С-0 вибрация), а при 849 см" относится к вторичной аксиальной сульфатной группе при С-4 1,3-связанного остатка P-D-галактозы, что позволяет предположить присутствие в полисахариде звеньев к-каррагинана [243]. Полоса поглощения при 805 см" (рис. 22), характерная для вторичной аксиальной сульфатной группы при С-2 1,4-связанного остатка 3,6-ангидро-а-Б-галактозы, может указывать на наличие в структуре полисахарида дисахаридных звеньев i-типа [126]. Кроме того, в ИК-спектре сульфатированного галактана наблюдается небольшое плечо при 890 см" , относящееся к несульфатированным остаткам галактозы (С-Н вибрация), что характерно для 0- и а-типов каррагинанов [123].
Известно, что разные типы каррагинанов образуют гели при добавлении к ним солей определенных металлов, проявляя при этом высокую специфичность к ним. Согласно литературным данным к-каррагинан обладает специфичностью к ионам калия, тогда как і-каррагинан - к ионам кальция [8]. В связи с этим исследуемый галактан, который, как показано выше, содержит звенья к- и і-каррагинанов, фракционировали на желирующий (СаСЬ-нерастворимый) и нежелирующий (СаС12-растворимые) полисахариды 4% СаС12, как описано в экспериментальной части [37]. Выход и состав этих фракций представлен в таблице 14. Как видно из таблицы 14, исследуемый полисахарид представлен в основном желирующей фракцией, выход которой составил около 19%. Молекулярная масса этого полисахарида, рассчитанная на основании данных вискозиметрии, составила 250 кДа.
Согласно химическому анализу, основными моносахаридами желирующего полисахарида являются галактоза и 3,6-ангидрогалактоза, а ксилоза и глюкоза присутствуют в незначительных количествах (табл. 14). Интересно отметить, что желирующий полисахарид содержит в 2 раза больше сульфатных групп, чем нежелирующий. Подобные результаты ранее были получены для других представителей семейства Phyllophoraceae. Так, количество сульфатных групп в желирующих полисахаридах из водорослей Gymnogongrus griffithsiae [208] и G. torulosus [27] было в 3,2 и 1,8 раз больше, чем в нежелирующих соответственно. В то же время в случае галактана, выделенного из Т. crinitus (Tichocarpaceae), нежелирующий полисахарид имел большую степень сульфатирования, чем желирующий [93].
Как видно из таблицы 14, нежелирующий полисахарид из A. flabelliformis характеризуется высоким содержанием глюкозы и ксилозы. Наличие глюкозы в исследуемых образцах может быть обусловлено присутствием в клеточной стенке водоросли флоридного крахмала [1]. Высокое содержание ксилозы было также определено в нежелирующих полисахаридах из G. griffithsiae [208] и G. torulosus [27]. Предполагается, что ксилоза в полисахаридах может присутствовать либо за счет ксилана, соэкстрагируемого с галактаном [1], либо в качестве единичных остатков ксилозы, замещающих гидроксильные группы галактана [81, 83].
Для идентификации желирующего полисахарида из карпоспорофита А. flabelliformis и отнесения его к определенному типу каррагинанов использовали методы ИК-Фурье и ЯМР спектроскопии. Полученный спектр был сопоставлен со спектрами известных структур каррагинанов. ИК-спектр желирующего полисахарида (рис. 23) аналогичен спектру суммарной фракции полисахаридов (рис. 22), согласно которому исследуемый полисахарид представляет собой в основном t/к-каррагинан и содержит остатки несульфатированной галактозы. к soo
Анализ спектров ЯМР исследуемого полисахарида подтверждает данные ИК-спектроскопии (рис. 24, табл. 18). Химические сдвиги соотнесенных сигналов в спектрах ХН и 1JC ЯМР желирующего полисахарида были сопоставлены с сигналами известных предельных структур каррагинанов [106, 131, 245, 246, 253]. В спектре С ЯМР полисахарида в области резонанса аномерных атомов углерода наблюдается шесть сигналов разной интенсивности при 92,9, 95,9 96,2, 102,9, 103,1 и 103,2 м.д., что может указывать на присутствие трех типов дисахаридных звеньев (рис. 24 Б). Сигнал с 8 92,9 м.д. относится к атому С-1 1,4-связанного остатка 3,6-ангидро- a-D-галактозы 2-сульфат і-типа каррагинана, а сигналы с 8 96,2 и 95,9 м.д. соответствуют атому С-1 1,4-связанных остатков 3,6-ангидро-а-Б-галактозы к- и Р-каррагинанов соответственно (табл. 18). Плохо разрешенные сигналы с 8 102,9, 103,1 и 103,2 м.д. являются результатом наложения сигналов атомов С-1 1,3-связанных остатков P-D-галактозы і-, к- и Р-каррагинанов [253]. Спектр С ЯМР в области относительно сильного поля имеет типичный для і-, к- и Р-типов полисахарида вид. DEPT-135 эксперимент показал наличие двух оксиметиленовых групп при 62,0 и 70,1 м.д., последняя из которых замещена, как видно из значения величины ее химического сдвига. G4S,G4S ,G-6 \ спектроскопией С ЯМР. В области резонанса аномерных протонов спектра Н ЯМР присутствуют пять аномерных сигналов различной интенсивности при 4,61, 4,64, 5,07, 5,09 и 5,3 м.д. (рис. 24 А). Сигнал с 8 5,3 м.д. относится к атому Н-1 1,4-связанного остатка 3,6-ангидро-а-Б-галактозы 2-сульфат і-каррагинана, а сигналы с 8 5,09 и 5,07 м.д. соответствуют атому Н-1 1,4-связанных остатков 3,6-ангидро-а-D-галактозы к- и Р-каррагинанов соответственно (табл. 18). Сигнал при 4,61 м.д. может быть отнесен к атому Н-1 1,3-связанного остатка несульфатированной P-D-галактозы Р-каррагинана, а сигнал с 8 4,64 м.д. присутствует с спектре благодаря 1,3-связанному остатку P-D-галактозы 4-сульфат, входящему в состав дисахаридного звена как к-, так и і-каррагинанов. Помимо этого, в спектре Н ЯМР (рис. 24 А) присутствует сигнал слабой интегральной интенсивности при 5,5 м.д., который может быть отнесен к аномерному протону остатка а-галактозы 2,6 100 дисульфат v-каррагинана, который является биосинтетическим предшественником і-каррагинана [132]. Согласно данным спектроскопии ЯМР, содержание дисахаридных звеньев і-типа в полимерной цепи является преобладающим, и соотношение і- и к-звеньев составляет 1:0,5.
Таким образом, из данных химического анализа, ИК- и ЯМР спектроскопии следует, что исследуемый желирующий полисахарид из карпоспорофита А. flabelliformis представляет собой і/к-каррагинан с соотношением звеньев і- и к-типа 1:0,5, содержит звенья Р-каррагинана и минорные количества v-каррагинана.
Мягкий кислотный гидролиз полисахарида из A. flabelliformis Для установления особенностей структуры полисахарида из карпоспорофита A. flabelliformis был проведен тщательный анализ суммарного полисахарида. Как показано выше, в составе этого полимера обнаружены ксилоза и глюкоза, которые содержатся в незначительных количествах в желирующем і/к-каррагинане. В связи с этим, был проведен кислотный гидролиз суммарного полисахарида.
В настоящее время при изучении полисахаридов со сложной структурой, содержащих 3,6-ангидрогалактозу, часто используется метод мягкого кислотного гидролиза, протекающий без разрушения 3,6-ангидрогалактозы и приводящий к образованию олигосахаридов с четным и нечетным количеством моносахаридных остатков. При этом, чем более сульфатированным является полисахарид, тем труднее он подвергается гидролизу [254]. Ранее нами было показано, что благоприятными условиями гидролиза к-каррагинана, содержащего 22% сульфатных групп, 0,1 N соляной кислотой являются 37С и 24 ч, поскольку при этих условиях 3,6-ангидрогалактоза разрушается в меньшей степени по сравнению со стандартными условиями (60С и 4 ч) [255]. Исследуемый нами полисахарид представляет собой і/к-каррагинан и содержит 32% сульфатов, поэтому он был гидролизован при 37С в течение 50 ч.
Гельпроникающая хроматография на биогеле Р-10
Образцы полисахаридов из стерильной формы A. flabelliformis и нефракционированный гепарин в конечных концентрациях 10 и 1 мкг/мл соответственно, инкубировали в течение 1 мин при 37С с 0,1 мл плазмы крови человека с последующим добавлением 0,2 мл раствора тромбопластин кальциевой смеси (Технология-стандарт, Россия) предварительно нагретом при 37С. После этого регистрировали время образования сгустка. Влияние образцов полисахаридов на ПВ рассчитывали согласно следующему уравнению:
Время образования и активности тромбопластина (А ЧТВ) Образцы полисахаридов из стерильной формы A. flabelliformis и нефракционированный гепарин в конечных концентрациях 10 и 1 мкг/мл соответственно, инкубировали в течение 2 мин при 37С с 90 мкл плазмы крови человека с последующим добавлением 90 мкл АЧТВ реагента, содержащего фосфолипид эллаговой кислоты (Технология-стандарт, Россия). После инкубирования при 37С в течение 3 мин добавляли 40 мкл 0,025 М СаСЬ и засекали время. Влияние образцов полисахаридов на АЧТВ рассчитывали согласно следующему уравнению:
Протокол исследования был одобрен медицинским этическим комитетом местной больницы (Владивосток, Россия). Информированное согласие было получено от всех субъектов, которые приняли участие в исследовании. Ни один из доноров не употреблял никаких лекарств в течение 14 дней до забора крови. Кровь брали из локтевой вены нормальных здоровых добровольцев в пластиковые пробирки Vacuette (Greiner Bio-One International AG, Кремсмюнстер, Австрия), содержащие 3,8% раствор тринатрийцитрата в качестве антикоагулянта в соотношении цитрат:кровь 1:9.
Лейкоциты были выделены из венозной крови путем лизиса эритроцитов в растворе, содержащем 0,15 М NH4C1, 10 мМ NaHC03 и 0,1 мМ ЭДТА, в течение 10 мин [282]. Фракцию лейкоцитов промывали дважды, повторно суспендировали в фосфатном буфере (PBS) и доводили до концентрации 10 не-лимфоцитов (полиморфноядерные лейкоциты и моноциты) на мл.
Определение образования АФК Образование активных форм кислорода анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием 2-[6(4-амино) фенокси-ЗН-ксантен-3-он-9-ил] бензойной кислоты (APF), как описано Setsukinai и соавторами [283]. Клетки высевали в 96-луночный планшет для тканевых культур (Costar, Cambridge, MA) (100 000 клеток/лунку) и выдерживали в течение 1 ч с образцами (50 и 100 мкг/мл, конечное значение), APF (10 мкМ) добавляли в среду в течение последних 30 мин. Клетки собирали, выдерживали во льду 10 мин и сразу анализировали с помощью проточной цитометрии. Цитометрические измерения проводили с использованием четырех цветовых FACSCalibur (Becton Dickinson). Переднее и боковое рассеивание света использовали для идентификации клеточных популяций, измерения размера и гранулярности клеток.
Температуру и соленость воды, а также интенсивность и количество фотосинтетически активной радиации (ФАР) в месте обитания A. flabelliformis (Амурский залив, мыс Красный, Японское море) регистрировали ежемесячно в течение 2009 г. Температуру воды измеряли ртутным термометром, соленость -солемер-рефрактометром "Атаго". Интервал между измерениями температуры воды и солености составлял 3-5 дней. Интенсивность ФАР, проникающей в толщу воды на месте сбора биологического материала, измеряли квантовым фотометром LI-COR 189, оснащенным 2D подводным датчиком UWQ, LI-COR 7254 (Biospherical Instruments Inc. Сан-Диего, США). В течение исследуемого периода интенсивности ФАР регистрировали каждые 3-5 дней. Измерения проводили с 8:00 до 20:00, интервал между измерениями составлял 30 мин. Полученные за сутки данные интегрировали и рассчитывали дневную дозу падающей на воду фотосинтетической радиации. В течение каждого месяца вели учет пасмурных и солнечных дней. На основании полученных за каждый месяц данных рассчитывали среднесуточные параметры интенсивности и дозы ФАР, полученные в течение каждого месяца.
Для оценки статистических различий в содержании фотосинтетических пигментов, сухого вещества водоросли, общего растворимого белка и полисахаридов между отдельными месяцами в течение 2009 г. и в содержании ФБП и полисахаридов в июле 2012 г. полученные данные подвергали однофакторному дисперсионному анализу (one-way ANOVA) с последующим использованием многорангового LSD-теста. Представленные значения соответствуют средним и их стандартным отклонениям (SD); различия считали достоверными при Р 0,05. Для выявления взаимосвязи между сухим веществом водоросли, количеством общего растворимого белка, содержанием пигментов, полисахаридов, их моносахаридным составом и факторами среды (свет, температура воды) в 2009 г. использовали непараметрический тест по Спирмену (Spearman Rank test). Взаимосвязь считали достоверной при Р 0,05.
Результаты экспериментов по биологической активности полисахаридов выражены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Достоверность различий между показателями оценивали по однопараметрическому тесту ANOVA. Различия считали достоверными при уровне значимости Р 0,05.