Содержание к диссертации
Введение
1. Катализаторы гидролитического расщепления связи р-о в нуклеиновых кислотах и модельных субстратах 12
1.1. Конструирование реагентов для направленного расщепления нуклеиновых кислот 12
1.2. Гидролитический механизм расщепления Р-О связей
1.2.1. Гидролитическое расщепление фосфодиэфирных связей в РНК 15
1.3. Расщепление Р-О связей различных субстратов природными биокатализаторами 20
1.3.1. Расщепление Р-О связей в каталитических центрах ферментов 20
1.3.2. Расщепление фосфодиэфирных связей в присутствии НК-зимов 41
1.4. Расщепление Р-О связей под воздействием неприродныхагентов 46
1.4.1. Расщепление Р-О связей ионами металлов и металлокомплексами 46
1.4.2. Расщепление Р-О связей аминосоединениями и короткими пептидами 52
1.5. Моделирование каталитических центров металлозависимых ферментов, гидролизующих Р-О связи в различных субстратах 56
1.6. Моделирование каталитических центров металлонезависимых рибонуклеаз 60
1.7. Реагенты, расщепляющие РНК по определенным участкам структуры 66
1.7.1. Конъюгаты на основе полициклических соединений 67
1.7.2. Конъюгаты на основе поликатионов 70
1.8. Сверхспецифичные рибонуклеазы на основе конъюгатов олигонуклеотидов с каталитическими группами 79
1.9. Методы синтеза олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих реакционноспособные группы 93
2. Экспериментальная часть 97
3. Конструирование органических катализаторов гидролитического расщепления рнк. Результаты и обсуждение 137
3. 1. Синтетические катализаторы на основе полициклических ароматических соединений 140
3.1.1. Конструирование и синтез РНКазомиметиков на основе полициклических ароматических соединений 148
3.1.2. Гидролитическая активность РНКазомиметиков на основе полициклических ароматических соединений 155
3.2. Синтетические катализаторы на основе поликатионных соединений 155
3.2.1. Конструирование и синтез РНКазомиметиков на основе коротких катионных пептидов и пептидоподобных молекул 155
3.2.2. Гидролитическая активность РНКазомиметиков на основе коротких катионных пептидов и пептидоподобных молекул 157
3.2.3. Конструирование и синтез РНКазомиметиков на основе бис-четвертичных солей 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана 170
3.2.4. Гидролитическая активность РНКазомиметиков на основе четвертичных солей 1,4-диазабицикло[2.2.2]- октана. Зависимость гидролитической активности от строения 180
3.2.4.1. Сравнение рибонуклеазной активности соединений с различным доменным составом 180
3.2.4.2. Сравнение рибонуклеазной активности соединений с различными каталитическими группами 187
3.2.4.3. Влияние количества положительных зарядов в РНК- связывающем домене на эффективность расщепления РНК 188
3.2.4.4. Влияние длины линкера, связывающего каталитическую группу с диазабициклоокановым фрагментом, на эффективность расщепления фосфодиэфирных связей 196
3.2.4.5. Влияние строения алифатического остатка в РНК-связывающем домене РНКазомиметиков на эффективность расщепления фосфодиэф ирных связей 197
3.3. Предполагаемый механизм гидролиза РНК химическими рибонуклеазами 200
3.4. Высокоспецифичные катализаторы расщепления РНК на основе конъюгатов олигонуклеотидов с РНК- гидролизующими конструкциями 217
3.4.1. Синтез и свойства олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих каталитические группы, присоединенные к олигонуклеотидам через 5*- или 3'- концевые фосфамидные группы 218
3.4.2. Синтез и свойства олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих каталитические группы, присоединенные к олигонуклеотидам через 5'- концевые фосфодиэфирные группы 232
3.4.3. Синтез и свойства олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих каталитические группы, присоединенные к 5'- или 3'-концевым фосфамидным группам через промежуточные полициклические соединения 237
3.4.4. Другие подходы к конструированию олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих каталитические группы 246
3.4.4.1. Синтез и свойства олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих каталитические группы на основе дендримерных конструкций 241
3.4.4.2. Конструирование конъюгатов, содержащих каталитические группы в середине ол иго нуклеотид ного адреса 259
Заключение 269
Выводы 272
- Расщепление Р-О связей различных субстратов природными биокатализаторами
- Расщепление Р-О связей ионами металлов и металлокомплексами
- Конъюгаты на основе поликатионов
- Методы синтеза олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих реакционноспособные группы
Введение к работе
Одним из основных научных направлений биоорганической химии и молекулярной биологии является разработка теории и методов направленного воздействия на биополимеры. Среди объектов для адресованного химического воздействия особый интерес представляют нуклеиновые кислоты, являющиеся носителями генетической информации. Создание реагентов, избирательно взаимодействующих с определенными видами нуклеиновых кислот, открывает возможность селективного воздействия на функционирование отдельных генов с целью коррекции протекающих в организме биохимических процессов и возможность селективного повреждения находящихся в организме чужеродных нуклеиновых кислот для подавления размножения инфекционных агентов (бактерии, вирусы, микоплазмы и т.д.). Такие реагенты окажут революционизирующий эффект на стратегию лечения практически всех заболеваний, поскольку открывают возможности воздействия на самые глубинные источники патологических состоя н и й,1,2*3,4'5
Наиболее эффективным подходом к конструированию реагентов, направленных на определенные нуклеиновые кислоты, является синтез реакционноспособных производных олигонуклеотидов.6 Перспектива создания рациональных подходов в химиотерапии, основанных на применении производных олигонуклеотидов, вызвала в последние годы появление большого количества работ, связанных как с синтезом такого сорта реагентов, так и с изучением их химической и биологической активности.
Если на первом этапе развития исследований в этой области стоял вопрос о принципиальной возможности избирательных воздействий на нуклеиновые кислоты посредством реакционноспособных олигонуклеотидных производных, то после доказательства этой возможности встал вопрос о выборе реакционных групп, обеспечивающих высокоэффективную и селективную модификацию нуклеиновых кислот. Известен широкий спектр реакционноспособных соединений, вызывающих деструкцию нуклеиновых кислот. Для расщепления ДНК в настоящее время используются главным образом соединения, несущие в качестве реакционноспособных групп комплексы металлов с переменной валентностью, способные катализировать процессы, ведущие к разрушению нуклеозидов;7,8,9 ен-дииновые соединения, способные в определенных условиях генерировать бирадикальные частицы, реагирующие с обеими цепями ДНК и вызывающие их одновременный разрыв;10 а также алкилирующие соединения, реакция с которыми приводит к модификациям нуклеозидов, вызывающим ослабление гликозидных связей и, как следствие, их разрушение.11,12 В последние годы широкое распространение получили реагенты, расщепляющие ДНК по фотоокислительному механизму,13,14 а также реагенты на основе природных и синтетических металлонезависимых антибиотиков, генерирующих гидроксильные радикалы (варацин, лизоклинотоксин и др.)-
7,15,16
В отличие от ДНК, РНК проявляют значительно большую устойчивость к окислительному расщеплению.17 Деградация РНК под действием металлозависимых антибиотиков, таких как блеомицин18'19и ен-дииновые антибиотики (неокарциностатин, эсперамицин и др.),20 протекает со значительно меньшей эффективностью по сравнению с ДНК. В то же время РНК гораздо легче подвергается гидролитическому расщеплению. Чрезвычайно интересным направлением в области создания реагентов для направленного гидролитического расщепления нуклеиновых кислот является конструирование катализаторов на основе РНК и ДНК.21,22,гз'24,25
Всем перечисленным выше реагентам характерен ряд существенных недостатков. В частности, как отмечалось выше, наиболее широко ф используются соединения, расщепляющие нуклеиновые кислоты по радикальному механизму. Однако образующиеся высоко реакционноспособные радикальные частицы обладают низкой избирательностью, что приводит как к разрушению нецелевых биополимеров, так и к быстрой инактивации самих реагентов. Низкой специфичностью обладают также соединения, несущие алкилирующие группы, которые способны реагировать со многими функциональными группами белков. Реагенты на основе ионов металлов находят широкое применение в структурных исследованиях, однако их высокая токсичность делает такие реагенты малоперспективными для их применения в биологических системах. Необходимость формирования сложноорганизованного комплекса между протяженными участками РНК-мишени и нуклеотиднои последовательностью катализаторов на основе нуклеиновых кислот приводит к тому, что такие соединения, обладая очень высокой специфичностью, имеют крайне невысокую эффективность по сравнению с белковыми катализаторами.26
При создании реагентов на основе олигонуклеотидных конъюгатов с природными белковыми катализаторами ' также возникает ряд проблем. Природные нуклеазы помимо каталитических центров содержат собственные аффинные центры, что неизбежно сказывается на специфичности таких конъюгатов. Другой важной проблемой является сохранение каталитической активности фермента или антибиотика в процессе получения его конъюгата с олигонуклеотидом.
Идеальным решением в плане разработки химических реагентов для расщепления нуклеиновых кислот явилось бы создание синтетических катализаторов, имитирующих процессы, которые протекают в активных центрах природных катализаторов, расщепляющих Р-0 связи.
Структурный анализ активных центров таких ферментов29 приводит к обнадеживающему выводу. Ферменты бесконечно вариабельны по структурам аффинных центров, но в значительной степени консервативны по структурам каталитических центров. Таким образом, можно надеяться, что, имея в своем распоряжении знания по строению каталитических центров ферментов и механизмам их функционирования, при использовании современного арсенала органической химии удастся создать высокоэффективные синтетические катализаторы, расщепляющие нуклеиновые кислоты с эффективностью, близкой или даже превосходящей эффективность природных ферментов. При этом предпочтение следует отдавать максимально простым соединениям, которые в минимальной степени будут вносить искажения в нативную структуру нуклеиновых кислот.
Целью настоящей работы является разработка общих подходов к конструированию высокоактивных катализаторов расщепления фосфодиэфирных связей в рибонуклеиновых кислотах путем моделирования каталитических центров природных ферментов, расщепляющих Р-0 связи в различных субстратах; создание с помощью таких подходов реагентов, способных осуществлять направленную деструкцию РНК в физиологических условиях; исследование способности таких соединений катализировать расщепление нуклеиновых кислот; изучение механизма функционирования полученных соединений с целью создания на их основе сверхспецифичных синтетических рибонуклеаз, пригодных для структурных исследований и биомедицинских приложений.
Расщепление Р-О связей различных субстратов природными биокатализаторами
В настоящее время известно несколько классов природных катализаторов, способных вызывать расщепление Р-О связи в различных субстратах. К таким соединениям в первую очередь относится широкий класс ферментов - биокатализаторов пептидной природы. Вторым важнейшим классом природных биокатализаторов являются НК-зимы -открытые сравнительно недавно природные катализаторы на основе нуклеиновых кислот. Известно также, что нуклеиновые кислоты деполимеризуются в присутствии антибиотиков - природных соединений, отличающихся разнообразным строением и механизмом действия. 4 (.3.1. Расщепление Р-О связей в каталитических центрах ферментов Прогресс, достигнутый в области изучения строения и механизмов функционирования природных ферментов, гидролизующих Р-О связи в различных субстратах, нашел отражение в ряде обзоров, опубликованных в последние годы.63 64-65,66 Строение белковых катализаторов в основном определяется двадцатью аминокислотами. В результате взаимодействия между функциональными группами боковых радикалов этих аминокислот j . формируются сложные третичные и четвертичные структуры, определяющие строение различных функциональных доменов ферментов. Наиболее часто в каталитических центрах рассматриваемых катализаторов встречаются аминокислотные остатки гистидина, лизина, аргинина, аспарагиновои и глутаминовои кислот и их амидов, а также гидроксилсодержащие аминокислоты. Функциональные группы боковых J«V радикалов этих аминокислот также формируют несколько унифицированных металлокомплексов с ионами Mg, Са, Zn, Со, Mn, Fe и хт- 67,68,69,7» Очень часто каталитические центры различных гидролаз содержат два комплексообразующих домена, сформированных аминокислотными остатками His, Asp(Asn), Glu, Arg, Lys и одной из гидроксилсодержащих аминокислот - Ser или Туг. Расстояния между ионами металлов в активных 4&F центрах составляет 3-5 А. Кроме того, каталитические центры содержат одну или несколько таких аминокислот, как Glu, Arg, Lys, His, Ser. Функциональные группы этих аминокислот непосредственно не связаны с ионами металлов и выполняют роль дополнительных основных, кислотных или нуклеофильных катализаторов. На рис. L4-I.6 приведены примеры активных центров ферментов, содержащих 1-3 иона металла, непосредственно принимающих участие в каталитическом процессе. " Значительно реже встречаются ферменты (наиболее часто - рибонуклеазы), активные центры которых не содержат ионов металлов.
Примерами таких ферментов могут служить рибонуклеазы семейств А (рис. 1.7) и Т (рис. 1.8). Общие представления о ферментативном катализе как о совокупности сопряженных процессов позволяют предположить наличие в активных центрах обсуждаемых ферментов нескольких структурно-функциональных доменов, отвечающих за активацию атакуемой и атакующей частиц, а также за стабилизацию переходного состояния и уходящей группы. При гидролитическом расщеплении Р-0 связей природными ферментами в качестве атакующей (нуклеофильной) частицы выступает молекула воды, однако в ряде случаев это могут быть алкоксильные Чй группы. Примером таких групп может служить 2 -гидроксильная группа рибозы и ОН-группа гидроксилсодержащих аминокислот. Значительно реже в качестве нуклеофильной частицы выступает SH-группа цистеина.82 Наиболее вероятный механизм гидролиза фосфоэфиров {ЕА) У аналог механизма Sy2, предполагает, что в качестве атакуемой частицы выступает атом фосфора. При этом реакция протекает через образование отрицательно заряженного интермедиата с пентакоординированным Г атомом фосфора (рис. 1.1.В). Стабилизация промежуточного состояния происходит за счет делокализации отрицательного заряда как на фосфате, так и на кислороде уходящей группы. В работе29 на основе анализа аминокислотных остатков, входящих в активные центры гидролаз (фосфогидролаз и родственных им пептидаз), были выявлены четыре типа доменов, ответственных за активацию нуклеофильных частиц (молекулы воды или гидроксильной группы) и четыре типа доменов, ответственных за повышение электрофильности № ,-29 атома фосфора. По мнению авторов работы, в каталитических центрах гидролаз активаторами нуклеофильной частицы являются: 1. Имидазол (часто сопряженная пара имидазол-карбоксилат); 2. Карбоксильная группа в депротонированной форме; 3. Металлокомплексы с ионами Mg2+mm Mn2+; 4. Металлокомплексы с ионами Zn2\ Со2+ и Ni2+. В качестве функциональных групп, повышающих электрофильность атома фосфора, выступают: I. Амидная группа (собственно пептидная связь, амидные группы аспарагина или глутамина); II. Карбоксильная группа в протонированной форме; III. Металл о комплексы Zn2+, Со2+; IV. Металлокомплексы Mg2+, Мп2+. Разделение на две независимые группы комплексов 3, 4 и III, IV по типу входящих в их состав ионов металлов с нашей точки зрения условно.
По-видимому, более правильно говорить о двух типах комплексов по типу формирующих их лигандов: в целом электронейтральные комплексы, сформированные преимущественно с участием карбоксильных групп; и положительно заряженные комплексы, сформированные с участием преимущественно электронейтральных лигандов. На рис. 1.11. представлены варианты активации различных нуклеофильных групп на примере активных центров панкреатической РНКазы А,77 внеклеточной эндонуклеазы Serratia marcescens (нуклеаза Sm) [ЕС 3.1,4.9]87 и щелочной tf& фосф атазы Esch erich Іа coli [EC 3.1.3.1 ] .88 В ряде случаев активация нуклеофильной частицы протекает по механизму донорно-акцепторных взаимодействий с участием ассоциированных молекул, подобно механизму действия классической каталитической триады Asp-His-Ser сериновых протеаз (рис. 1.12. А). Такой механизм реализуется в случае фосфолипазы С8 и, по- видимому, встречается значительно чаще, нежели предполагалось ранее. В Цр частности, триады Glu(Asp)-His-HOR обнаружены в активных центрах ДНКазы I [ЕС 3.1.21.1]9091 и РНКазы А.92 Помимо каталитических триад, в активных центрах некоторых ферментов могут реализоваться другие ассоциаты. Так, в предложенном в работе93 механизме функционирования активного центра рибонуклеазы А предполагается синергическое действие имидазольного остатка и протонированной аминогруппы лизина на 2 -ОН группу рибозы (рис. 1.12.С). При этом, наряду с повышением нуклеофильности атакующей частицы, происходит протонирование кислорода фосфата и, как следствие, повышение электрофильности атома фосфора. Возможность реализации такого механизма переноса протона была также подтверждена квантово-химическими расчетами в работе . На основе анализа строения активного центра серин-треониновой і і 95 96 " фосфатазы можно предположить наличие другой цепи ассоциированных групп, с помощью которой реализуется перенос протона от молекулы воды (нуклеофильная частица) через гидроксильную группу тирозина на кислород уходящей группы (рис. І.12.В). Схожий механизм,
Расщепление Р-О связей ионами металлов и металлокомплексами
Как уже отмечалось выше, ионы металлов входят в состав активных центров многих ферментов, гидролизующих Р-О связи в различных субстратах. Кроме того, они являются необходимыми кофакторами для функционирования многих рибозимов. В настоящее время накоплен обширный материал по гидролизу нуклеиновых кислот ионами различных металлов. Имеется ограниченное число данных по гидролитическому расщеплению ДНК ионами тяжелых металлов,125 126,127 в то время как гидролиз РНК изучен очень детально. Наиболее исследованными в реакции деструкции РНК являются ионы Zn2+, Ni2+, Са2+, Со2" ", Си24-, Mg2+, Mn , Pb , А1 , а также La и других лантаноидов. Некоторые из них способны вызывать гидролиз РНК в физиологических условиях. На рис. 1.23 представлены обобщенные схемы, по которым ионы металлов могут стимулировать расщепление фосфодиэфирных связей в РНК. Выступая в качестве кислоты Льюиса, ионы металлов могут напрямую принимать участие в каталитическом процессе, взаимодействуя с кислородом фосфатной группы (рис. I.23.A), нуклеофилом (например, гидроксид-анионом) (рис. 1.23.В) или кислородом уходящей группы (рис. 1.23.С). Кроме того, ионы металлов могут принимать участие в катализе опосредованно, координируя молекулу воды, выступая в роли внутримолекулярного общего кислотного катализатора (рис. 1.23.D), либо координируя гидроксид-анион - в роли внутримолекулярного общего основного катализатора (рис. L23.E,F).129,13I Очевидно, что при гидролитическом расщеплении РНК различными ионами металлов может реализоваться тот или иной механизм или их сочетание. Кроме того, можно предположить, что в ускорении гидролиза принимают участие два иона металла, тем самым обеспечивая более эффективное расщепление Р-О связей. Аргументом в пользу моноионного механизма реакции следует считать данные рентгеноструктурного анализа некоторых рибоз и мов. 1 С другой стороны, сообщения о значительном ускорении гидролиза РНК под действием пары ионов металлов Mg2+-Pb2Y32 Nd3+-Pb2+ ШД34 и La3+-Fe3+, La3+-Sn4+ U5 могут быть интерпретированы только в рамках диионной модели.
На примере динуклеотида Ар А было показано, что гидролиз фосфодиэфирной связи может осуществляться как под действием т 3+136 гидрокси комплекса La , так и под действием двуядерного гидроксикомплекса La2(OH)5+.137 При этом скорость гидролиза возрастаетна четыре порядка при переходе от моно- к двуядерному комплексу. Можно предположить, что гидролиз протекает как с участием одного, так и двух ионов металлов в зависимости от условий реакции. В рамках всех предложенных механизмов более эффективными катализаторами гидролитического расщепления должны быть ионы металлов, являющиеся более сильными кислотами Льюиса и обладающие большим координационным числом. В связи с этим повышенное внимание направлено на изучение расщепления фосфодиэфирных связей ионами Се4+Ш и 2т4\шш Скорость гидролиза фосфодиэфирных связей в РНК определяется не только реакционной способностью ионов металлов, но и зависит от строения РНК-мишени. Так, скорость гидролиза фосфодиэфирной связи в 0.01 М Тш3+ для АрА в 4.8 - 5-І142 раз выше, чем для UpU. При изучении гидролиза шести различных пар нуклеотидов (UpG, СрС, GpA, ApU, UpA, Ар А) в 0.01 М Lu было обнаружено, что разница между наиболее быстро гидролизуюшимся динуклеотидом UpG и наиболее стабильным в этих условиях Ар А составляла 2.2 раза. Наличие 3 -концевой фосфатной группы значительно ускоряет гидролиз межнуклеотидной фосфоди эф ирной связи в динуклеотидах, возможно, за счет более эффективного связывания катионов. Так, скорость гидролиза фосфодиэф ирной связи Ар Ар ионами Zn в 100 раз выше, нежели Ар А. В то же время наличие 2 - концевой фосфатной или 2\3 - циклофосфатной группы на скорость гидролиза влияет незначительно.143 Изучение скорости гидролиза олигодезоксинуклеотидов, содержащих на 5 -конце рибонуклеотидное звено - Up(Tp)nTp и Up(Tp)nT {n = 0-4,7), показало, что ускоряющее влияние 3 -концевой фосфатной группы распространяется вплоть до 7 нуклеотидных звеньев.144 Относительная гидролитическая способность ионов металлов может меняться в широких пределах в зависимости от природы субстрата. Так, гидролитическая активность ионов металлов в реакции гидролиза Ар А убывает в ряду: Tm, Lu Y Nd, Eu, Sm Се, Sc, Gd, Tb Pr, Dy Ho, Er Yb La. В то же время при гидролизе 3\5 -циклического аденозинмонофосфата (являющегося одним из промежуточных продуктов гидролиза АрА) в аналогичных условиях ионы металлов располагаются в следующей последовательности: Се » Pr Nd, La Y, Sm, Dy другие лантаноиды. Очевидно, различия в скорости гидролиза в динуклеотидах, как и в более протяженных последовательностях РНК, определяются разной комплексообразующей способностью различных фрагментов нуклеиновых кислот. Подробно вопросы комплексообразования ионов металлов с нуклеиновыми кислотами рассмотрены в обзоре.146 Гидролиз РНК ионами различных металлов широко используется для выявления участков связывания катионов в структуре нуклеиновых кислот/47 148 149,150 151 Ионы магния, свинца и лантаноидов могут катализировать избирательное расщепление фосфодиэфирных связей в области некоторых специфических элементов пространственной структуры рнк.152,153,154 155 Чувствительность этих реакций к ориентации лигандов использовалась для изучения структуры РНК в растворе и сравнения пространственной организации мутантных тРНК и 5S РНК.156,157 1 8 Было показано, что в смешанных комплексах - ДНК:РНК рибонуклеотидная последовательность эффективно защищена от гидролиза комплексами Еи3+ и La3+. Вероятно, это объясняется тем, что при образовании дуплекса происходит ограничение конформационной подвижности РНК, необходимой для эффективного связывания ионов и протекания трансэтерификации.
В несовершенных комплексах петлевые одноцепочечные участки расщепляются с большой скоростью.159 Детально было исследовано влияние нуклеотидной последовательности и размера петлевого участка на эффективность гидролиза РНК ионами Pb2+, Zn2+ и металл о комплексами на их основе.160 Было показано, что эффективность гидролитического расщепления возрастает с увеличением размера петли и удалением гидролизуемой фосфодиэфирной связи от стеблевого фрагмента. Полученные результаты еще раз подтверждают необходимость конформационной подвижности подвергающегося гидролизу рибозофосфатного фрагмента. Очевидно, что ионы металлов могут рассматриваться в качестве реакционноспособных групп при конструировании синтетических нуклеаз только в составе соответствующих металлокомплексов. Способность комплексов лантаноидов, меди, цинка и ряда других металлов164 катализировать гидролиз фосфодиэфирных связей позволяет рассматривать их в качестве потенциальных гидролитически активных групп для синтеза конъюгатов с органическими соединениями и олигонуклеотидами. Как уже отмечалось выше, наиболее перспективными считаются ионы металлов, являющиеся сильными кислотами Льюиса и обладающие гибкой геометрией координационной сферы. Конструирование металлокомплексов, обладающих высокой стабильностью и в то же время не уменьшающих кислотных свойств центрального атома, является противоречивой задачей. Тем не менее, был получен ряд металлокомплексов, имеющих высокую стабильностью при сохранении высокой гидролитической активности. Была показана возможность расщепления РНК этими реагентами в каталитическом режиме. Зависимость скорости гидролиза РНК различными металл око мплексами от рН позволяет предположить, что, как и в случае свободных ионов металлов, наиболее вероятен бифункциональный механизм расщепления фосфодиэфирных связей, когда одна молекула металл око мплекса выступает в роли кислоты Льюиса, а вторая, координируя гидроксид-анион, - в виде основания.167,168 1.4.2. Расщепление Р-0 связей аминосоединениями и короткими пептидами Ряд простых ди- и полиаминов способен вызывать гидролиз Р-0 связей в различных соединениях. В результате исследования гидролиза 4-нитро-и бис-2,4-динитрофениловых эфиров фосфорной кислоты диаминами с общей формулой (CH3)2N-(CH2)n-N(CHj)2 (n=l, N-l-N; n-2, N-2-N; n=3, N-3-N) были предложены два возможных механизма расщепления фосфодиэфирных связей (рис. L25.A,B).
Конъюгаты на основе поликатионов
В отличие от РНКазомиметиков на основе полициклических соединений, обладающих ярко выраженной тенденцией связываться с двуцепочечными фрагментами нуклеиновых кислот, конструкции на основе катионных структур, связываясь с РНК за счет электростатических взаимодействий, обеспечивают их равномерное распределение между всеми стерически доступными фосфодиэфирными связями мишени. На рис. 1.34.А,В приведены структуры описанных в литературе искусственных рибонуклеаз на основе синтетических и природных полиаминов,23 "5 содержащих в качестве РНК-гидролизующих групп остатки имидазола. Как уже отмечалось выше, отдельные структурные элементы конъюгатов, представленных на рис. 1.34.А,В, такие как 1,4- диаминобутан и имидазол, в 1-2 М концентрациях способны вызывать гидролиз РНК. В то же время синтетические рибонуклеазы на основе конъюгатов имидазола с полиаминами обладают высокой гидролитической активностью в значительно более низких концентрациях (10"3-105 М), что свидетельствует о синергическом действии отдельных элементов этих конструкций. В отличие от описанных выше соединений, осуществляющих расщепление РНК с участием общего кислотно-основного катализа, в работах236 237 были представлены нуклеофильные катализаторы гидролитического расщепления фосфодиэфирных связей (рис. I.34.C,D). Наличие электроотрицательной группы в непосредственной близости от альдегидной группы приводит к смещению равновесия в слабощелочных и нейтральных средах в сторону образования высоконуклеофильной гидратированной формы. Наличие положительного заряда обеспечивает локализацию нуклеофильной группы в непосредственной близости от фосфодиэфирной связи, в то время как наличие алифатического остатка, {ёА по мнению авторов, повышает эффективность гидролиза за счет мицеллярного катализа (по аналогии с предложенными ранее мицеллярными аналогами сериновых протеаз238). Предложенные катализаторы ускоряли гидролиз бис(4-нитрофенил)фосфата по сравнению с некатализируемым гидролизом в 750-1800 раз, в то время как ускорение гидролиза, достигнутое только за счет мицеллярного катализа, составило 210 раз. S Отсутствие в литературе примеров расщепления природных РНК- субстратов катализаторами такого типа не позволяет провести сравнение их эффективности с конструкциями сходной структуры, но функционирующих на основе общего кислотно-основного катализа. В работе23 (рис. 1.35) для получения катализаторов расщепления фосфодиэфирных связей на основе полиаминов были использованы методы комбинаторной химии.
Смесь нескольких карбоновых кислот активировалась водорастворимым карбодиимидом в присутствии полиаллиламина с молекулярным весом 30000-40000. Соотношение компонентов подбиралось таким образом, что суммарная степень ацилирования аминогрупп полимера составляла от 5 до 45 %. Изменяя соотношения карбоновых кислот в исходной реакционной смеси и варьируя степень модификации исходного полиамина, была получена обширная библиотека водорастворимых полимеров со статистически расположенными функциональными группами. Каталитическая активность полученных соединений определялась по степени гидролиза бис-( -нитрофенил)фосфата в присутствии различных ионов металлов (Mg2+, Zn2\ Fe3+). Данный подход позволил выявить ряд полимеров, ускоряющих гидролиз в 20000-30000 раз. Наиболее активным оказался полиамин, содержащий 7.5% остатков гексилкарбоновой, 15% имидазолуксусной и 10% 4-гидроксибензойной кислот в присутствии ионов железа (ускорение гидролиза в 31400 раз). Недостатком данного подхода является отсутствие информации о структуре каталитически активных сайтов. В то же время комбинаторный метод позволяет быстро выявить набор функциональных групп, необходимых для эффективного протекания тех или иных каталитических процессов. Особый интерес представляют синтетические конструкции на основе макроциклических полиаминов. В таких соединениях каталитический и аффинный центры объединены в одно целое. Эффективность связывания с РНК макроциклов дополнительно может быть повышена путем присоединения их к полициклическим ароматическим соединениям. На основе конъюгатов азакраунэфиров с акридином были получены эффективные катализаторы гидролиза такого субстрата, как аденозин-5 -трифосфат (рис. 1.36). Однако эти соединения не проявили гидролитическую активность по отношению к нуклеиновым кислотам. Тем не менее, конструирование искусственных нуклеаз на основе молекул, в которых функциональные группы имеют ограниченную степень свободы, представляется весьма перспективным. Варьируя геометрические параметры полиаминов, можно добиться связывания с определенными структурными элементами РНК.
Так, было показано, что аминогликозиды, такие как природный антибиотик канамицин, связываются с несимметричными выпетливаниями в РНК, фланкированными GC парами.241 Добавление ионов меди к комплексу канамицин-РНК приводит к сайт-специфичному гидролизу фосфодиэфирных связей (рис. 1.37). Гидролитический характер расщепления был подтвержден в экспериментах по расщеплению модельных соединений (Ар А и с AMP) в присутствии комплекса ами нот и коз ид - Си(II).242 В работе было показано, что девятизвенный пептид, содержащий в своем составе шесть остатков аргинина, способен эффективно связываться с фрагментом мРНК ВИЧ. Присоединение этого пептида к металл о комплексу на основе циклического полиамина - 1,4,7,10-тетраазациклододекана (циклена) - приводило к сайт-специфичному расщеплению РНК-мишени (рис, 1.38.). Дальнейшие исследования показали, что для эффективного связывания с этой мишенью достаточно гуанидиниевого фрагмента и остатка тирозина. Конъюгаты циклена с такими конструкциями вызывают эффективный сайт-направленный гидролиз даже в отсутствие ионов металлов.244 На рис. 1.39. представлена структура РНК-мишени и различных соединений, содержащих гуанидиниевую группу и остаток циклена. Гидролитическая активность полученных соединений сильно зависит от строения РНК. В случае замены пары U-G в мишени на A-G гидролиз РНК не наблюдался. При конструировании олигонуклеотидных конъюгатов для сайт-специфичного расщепления РНК были использованы в различных модификациях две принципиально различные стратегии (рис. 1.40). Согласно первому подходу (рис. 1.40. А), РНК-гидролизующие конструкции различной природы вводятся по 3 - или 5 -концу олигонуклеотидного адреса. В этом случае каталитические группы оказываются локализованными в области гидролитически лабильного одноцепочечного участка РНК-мишени. Однако стабильность комплекса олигонуклеотид - мишень после расщепления РНК практически не снижается, обмен конъюгата между деполимеризованной и интактной РНК затруднен, что будет препятствовать эффективному функционированию реагентов такого типа. Впервые данный подход был успешно реализован в работе.245 Эффективность гидролиза РНК-мишени (синтетический 39-звенный рибоолигонуклеотид) олигонуклеотидным конъюгатом, несущим металлокомплекс Lu +, на основе иминодиуксусной кислоты достигала 17% после 8 часов инкубации при 37 С и 30-кратном избытке реагента. При реализации второго подхода (рис. 1.40.В) каталитические группы вводятся в середину олигонуклеотидного адреса. В этом случае при расщеплении РНК происходит существенное уменьшение стабильности комплекса конъюгата с субстратом, что должно способствовать осуществлению гидролиза в каталитическом режиме.
Методы синтеза олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих реакционноспособные группы
В настоящее время для получения конъюгатов олигонуклеотидов с соединениями, содержащими различные функциональные группы, широко 275 используются несколько различных стратегии. В случаях конъюгатов олигонуклеотидов с пептидами или пептидоподобными молекулами наиболее перспективными выглядят методы синтеза, позволяющие на твердофазном носителе осуществлять последовательный/ синтез олигонуклеотидного и пептидного фрагментов конъюгатов. Однако к настоящему времени методы такого последовательного синтеза отработаны недостаточно хорошо, и в лятературе описаны лишь единичные примеры удачного применения 276 277 такого подхода. В случае получения конъюгатов олигонуклеотидов с небольшими молекулами наибольшее распространение получил метод их непосредственного введения в олигонуклеотид во время твердофазного синтеза. Для этих целей получают соответствующие фосфорамидиты, содержащие необходимые структуры. Однако даже простые фосфорамидиты, содержащие 1-2 имидазольных остатка, требуют сложных многостадийных синтезов.278,279,280 Проблема еще более осложняется в случае синтеза фосфорамидитов, содержащих функциональные группы, требующие различных типов защитных групп. В случае конструирования синтетических рибонуклеаз на основе олигонуклеотидных конъюгатов были предложены мо но мерные блоки, 2Я1 282 2R1 2R4 содержащие остатки металл о комплексов и имидазолсодержащие конструкции.261 262 263,285 286 В результате интенсивных работ в области конструирования синтетических катализаторов, направленных на специфическое расщепление рибонуклеиновых кислот, уже получены перспективные Ф соединения на основе металлокомплексов, гидролизующие с высокой эффективностью фосфодиэфирные связи в РНК. Предпринимаются попытки получения низкомолекулярных металлонезависимых катализаторов расщепления РНК. Однако представленные в литературе данные в этой области носят разрозненный характер и не позволяют сделать каких-либо общих заключений по корреляции "строение -каталитическая активность". В целом, как низ ко молекулярные металл о независимые РНКазомиметики, так и их конъюгаты с олигонуклеотидами обладают существенно более низкой активностью в сравнении с металлсодержащими синтетическими рибонуклеазами. Однако можно надеяться, что привлечение данных, полученных в ходе исследований, направленных на изучение как строения, так и процессов, протекающих в активных центрах ферментов, позволит создать высокоэффективные металл о независимые химические РНКазомиметики, не уступающие или даже превосходящие по своей эффективности природные биокатализаторы.
Можно также констатировать, что к настоящему времени не существует сколько-нибудь универсального подхода, пригодного для синтеза широкого спектра РНКазоми мети ков на основе конъюгатов олигонуклеотидов, несущих различные каталитические группы в разных положениях олигонуклеотидного адреса. Поиск простых методов введения в олигонуклеотиды соединений, содержащих различные функциональные j \ группы, по-прежнему остается актуальной задачей. II. Экспериментальная часть Приборы и оборудование Аналитическую хроматографию осуществляли с использованием хроматографов Милихром-1 и Милихром-4 (г. Орел, Россия) на колонках 160x2 мм с сорбентом Lichrosorb-RP-18 (Merck, Германия, 5 мкм, обращеннофазовая и ион-парная хроматография) и с сорбентом Polisil-SA (Вектор, Россия, 15 мкм, ионообменная хроматография). Препаративную ВЭЖХ проводили на хроматографе "Waters 600" с UV детектором "Waters 486" (США), на колонке 1x25 см со смолой LiChroprep RP 18, 15-25 мкм (Merck, Германия), градиент от 0 до 80% ацетонитрила в 0.03 М L1CIO4 за 60 мин, скорость элюции 6 мл/мин. Электрофорез проводили на стандартном оборудовании с использованием в качестве источника высокого напряжения прибор ИПЭ-2000 (Россия). Спектры ЯМР записывали на спектрометрах WP-200, АС-200, АМ-400, DRX-500 (Вшкег, Германия) при 200 МГц для ]Н и 50 МГц для ПС в первых двух случаях, 400 и 100 МГц в третьем и 500 и 125 МГц в последнем, соответственно. Спектры 13С записаны с применением программы J-модулированного спинового эха. В качестве растворителей использовали CD3CN и DMSO-rfe (99% D, Aldrich, США), содержащие тетраметилсилан в качестве внутреннего стандарта, а также D2O, DMFA-db CDCb, CD3OD (99% D, Изотоп, Россия).
Спектры 14N и 15Т\[-ЯМР (на естественном содержании изотопа) записаны в DMSO-c/б с применением жидкого аммиака в качестве внешнего стандарта. Запись ЯМР, ИК-спектров и проведение элементного анализа осуществлялось в Лаборатории физических методов анализа НИОХ СО РАН. ИК-спектры регистрировали на спектрометре Specord М-80 (Karl Zeiss Iena, Германия) в таблетках КВг и в растворах СНСЬ- Электронные спектры поглощения записаны на спектрометре Specord М-40 (Karl Zeiss Iena, Германия) в Н20, МеОН или ЕЮН. Масс-спектры высокого разрешения соединений катионной природы получены с помощью оригинального "time-of-flight" масс-спектрометра291 с ортогональной экстракцией ионов, полученных с помощью электроионизации образцов, которые использовались в виде 5-Ю"5 М раствора в метаноле. Масс-спектры высокого разрешения олигонуклеотидных конъюгатов, незаряженных пептидов и пептидоподобных соединений получены с помощью MALDI "time-of-flight" масс-спектрометра Vision 2000 (Thermo Bio Analysis, Manchester, Англия) (для ионизации использован азотный лазер (VSL-337ND, Laser Science, Newton, MA, 337 нм, в качестве матрицы — 2,5-дигидроксибензойная кислота). Масс-спектры неполярных летучих соединений получены с помощью масс-спектрометра MAT900S (Finnigan, Франция, ЭУ, 70 эВ). Хромато-масс-спектрометрический анализ выполняли на приборе 2091 (LKB, Швеция), используя капиллярную колонку 40 м х 0.3 мм (фаза SE-30) с программным разогревом от 30 С (скорость нагрева 6 /мин). Элементный анализ выполнен с помощью установки Elemental Analyzer Model 1106 (Carlo Erba, Италия). Температуры плавления органических соединений измеряли на столике Кофлера "VEB Analytik" (Германия).
