Низкомолекулярные производные ионных полисахаридов. Структура и свойства Калитник, Александра Анатольевна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Вещества растительного и животного происхождения проявляют различные биологические свойства, что открывает перспективу создания на их основе новых эффективных лекарственных препаратов. Среди природных полисахаридов особое место занимают полиэлектролиты, характеризующиеся уникальными физико-химическими свойствами и разнообразной биологической активностью. К таким полисахаридам относятся хитозан и каррагинаны, которые имеют разную природу - поликатионную, в случае хитозана, и полианионную, в случае каррагинанов. Интерес к этим полисахаридам обусловлен их структурными особенностями и широкими возможностями использования в различных областях медицины и фармакологии, благодаря многообразию полезных свойств, биосовместимости, безопасности и доступности.

Каррагинаны - сульфатированные полисахариды красных водорослей, в основе химической структуры которых находится дисахаридное повторяющееся звено, состоящее из остатков D-галактозы, соединенных регулярно чередующимися в-(1-4) и а-(1-3) гликозидными связями. Структурное разнообразие каррагинанов обусловлено присутствием р-(1-4)-связанного моносахаридного остатка в виде 3,6- ангидрогалактозы, а также количеством и местоположением сульфатных групп в молекуле полисахарида. Регулярные полисахариды, полимерная цепь которых построена из повторяющихся дисахаридных звеньев одного типа, получили собственные названия и условно делятся на желирующие и нежелирующие. Природные каррагинаны редко имеют регулярную структуру, чаще они содержат повторяющиеся звенья нескольких типов и представлены блочной или гибридной структурой, что обусловлено биосинтезом полисахаридов. Для определения соотношения и характера распределения этих звеньев в полимерной цепи, установления степени их влияния на проявление биологической активности необходимо использование различных модификаций полисахаридов, включая получение их низкомолекулярных (НМ) производных.

Хитозан - р-1,4-глюкозаминогликан - полностью или частично дезацетилированное производное хитина, обычно получаемое из него методом щелочного дезацетилирования. Низкая растворимость хитозана в нейтральных растворах часто является серьезным препятствием для практического использования полисахарида, в связи с этим, применяются различные методы его модификации, в том числе деполимеризация полимера.

Известно, что структурные особенности полисахаридов, их молекулярная масса, количество и распределение заместителей вдоль углеводной цепи оказывают существенное влияние на физиологическую активность полимеров. Так, согласно литературным данным, олигосахариды каррагинанов проявляют более высокую противоопухолевую активность по сравнению с исходными полисахаридами, тогда как, например, активность хитозана зависит не только от степени деполимеризации, но и от источника получения и степени ацетилирования полисахарида. Однако данные по некоторым биологическим свойствам НМ- производных как каррагинанов, так и хитозана, в сравнении с исходными полисахаридами весьма противоречивы, что может быть обусловлено различием методов их получения и фракционирования. Для корректной оценки биологических свойств полисахаридов, а также выбора наиболее перспективных из них для применения в качестве биопрепаратов и новых лекарственных средств необходимо получение образцов с заданными физико-химическими свойствами с помощью различных модификаций, включая деполимеризацию полимеров химическими и ферментативными методами.

Сокращения и условные обозначения. G - 3-р^-галактоза; D - 4-а^-галактоза; DA - 4-а-3,6-ангидро^- галактоза; S - сульфатная группа; ВМ - высокомолекулярный; ВТМ - вирус табачной мозаики; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ИК - инфракрасный; ИЛ - интерлейкин; ИФА - иммуноферментный анализ; ИЭР - ионизация электрораспылением; ЛПС - липополисахарид; МАЛДИ - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация; Мм - молекулярная масса; МПО - миелпероксидаза; НМ - низкомолекулярный; СА - степень ацетилирования; ФНО - фактор некроза опухоли; Х-ВМ - хитозан высокомолекулярный; Х-НМ - хитозан низкомолекулярный; ЯМР - ядерный магнитный резонанс.

Изучение структуры и свойств НМ-производных полисахаридов может внести определенный вклад в установления взаимосвязи структуры и биологической активности полисахаридов.

Целью данной работы является сравнительное изучение структуры, физико- химических и биологических свойств НМ-образцов каррагинанов и хитозана, полученных различными методами, а также изучение тонкой структуры каппа/бета- каррагинана из красной водоросли Tichocarpus crinitus на основе анализа его олигосахаридов для доказательства гибридной структуры этого желирующэго полисахарида.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. выбрать оптимальные условия деполимеризации исследуемых полисахаридов;

2. изучить структуру и физико-химические свойства НМ-производных каррагинанов и хитозана, полученных химическими и ферментативными методами;

3. установить тонкую структуру каппа/бета-каррагинана и доказать гибридную структуру данного полисахарида;

4. изучить биологическую активность продуктов химической и ферментативной деполимеризации НМ-производных каррагинанов и хитозана в сравнении с исходными полимерами.

Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научных исследований в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН. Работа поддержана грантами: Президиума РАН - «Фундаментальные науки - медицине» (руководитель д.х.н. И.М. Ермак), «Молекулярная и клеточная биология» (руководитель к.б.н. В.А. Рассказов) и интеграционным грантом ДВО - УРО РАН (руководитель д.х.н. И.М. Ермак).

Научная новизна работы. Впервые на основе структурного анализа олигосахаридов каппа/бета-каррагинана из T. crinitus показано, что полимерная цепь этого желирующэго полисахарида построена из блоков регулярного каппа-, протяженных блоков бета-, гибридных блоков каппа/бета-каррагинана, с включением звеньев йота- и гамма-каррагинана. Впервые показано, что деполимеризация каппа/бета-каррагинана не влияет на его способность индуцировать синтез противовоспалительных цитокинов, но снижает индуцирующую способность синтеза провоспалительных цитокинов. Впервые показано, что цитокин-индуцирующая активность НМ-производных хитозана значительно выше активности исходного полисахарида. На модели ВТМ показано, что антивирусная активность НМ-образцов хитозана выше, чем активность исходного полисахарида, в то время как антивирусное действие исходных каррагинанов выше активности их НМ- производных, независимо от способа получения последних. Получены антитела к каппа-каррагинану и показано, что основным звеном, входящим в состав антигенных детерминант каррагинанов, является сульфатированная 3-связанная p-D-галактоза, и важную роль в формировании антигенной структуры играет макромолекулярная организация полисахаридов. Впервые на модели экспериментального колита показано, что каррагинан (каппа) и хитозан обладают противовоспалительным эффектом, который не зависит от степени полимеризации в случае хитозана, но не проявляется для НМ-образца каррагинана.

Практическая значимость работы. Показано, что НМ-производные хитозана обладают высокой антивирусной активностью в отношении ВТМ, которая проявляется в ингибировании вирусоиндуцированных локальных некрозов в листьях табака на ранних стадиях инфекции, что позволяет рассматривать олигосахариды хитозана в качестве перспективных препаратов при защите растений от вирусных инфекций. Показано, что пероральное введение хитозана и его НМ-производных, а также высокомолекулярного каппа-каррагинана способствует уменьшению тяжести воспаления толстой кишки, что открывает возможность потенциального использования этих полисахаридов в качестве препаратов для профилактики воспалительных процессов в толстом кишечнике. Деполимеризация ВМ-хитозана способствует значительному расширению возможностей его использования в качестве препарата медицинского и фармакологического назначения вследствие повышения растворимости полисахарида в воде и снижения вязкости его растворов.

Основные положения, выносимые на защиту.

4. 1. Химическая деполимеризация каррагинанов приводит к получению НМ- производных с ММ от 1,2 до 3,5 кДа и не сопровождается образованием побочных продуктов.

   2. НМ-производные каррагинанов, полученные кислотным гидролизом в мягких условиях (37^оС), отличаются по составу и структуре от олигосахаридов, образующихся в результате обработки полисахарида кислотой при высоких температурах (60^оС).

   3. Продуктами ферментативной деполимеризации каппа/бета-каррагинана каппа-каррагиназой являются как олигосахариды, так и высокомолекулярная фракция полисахарида, устойчивая к действию фермента.

   4. Желирующий полисахарид из красных водорослей Tichocarpus crinitus имеет гибридную структуру его полимерная цепь состоит из блоков регулярного каппа- каррагинана, протяженных блоков бета-каррагинана, а также гибридных блоков каппа/бета-каррагинана, с включениями звеньев йота- и гамма-каррагинана.

   5. В результате свободно-радикальной деполимеризации образцов хитозана с различными ММ и СА образуются НМ-производные с ММ в пределах 4-17 кДа, структура которых соответствует структуре исходных полимеров.

   6. НМ-производные исследуемых полисахаридов обладают антивирусной активностью в отношении ВТМ, которая зависит от способа их получения. Исходные образцы каррагинанов проявляют большую антивирусную активность по сравнению с НМ-производными, в то время как антивирусная активность хитозана возрастает с уменьшением молекулярной массы полимера.

   7. НМ-производные исследуемых полисахаридов сохраняют способность индуцировать синтез цитокинов иммунокомпетентными клетками крови человека. Деполимеризация каррагинана (каппа/бета) не влияет на его способность индуцировать синтез противовоспалительного цитокина ИЛ-10, но снижает его активность в отношении синтеза провоспалительного цитокина ФНО-альфа. Цитокин-индуцирующая активность НМ-производных хитозана значительно выше активности исходного полисахарида.

   8. Каррагинан (каппа) обладает иммуногенными свойствами. В состав антигенных детерминант каррагинанов входит сульфатированный остаток 3- связанной p-D-галактозы, и важную роль в формировании антигенной структуры играет макромолекулярная организация полисахаридов.

   9. Исследуемые полисахариды проявляют защитный эффект при воспалении толстой кишки экспериментальных животных. Противовоспалительный эффект каррагинана (каппа) проявляется при низкой дозе полисахарида. Олигосахариды каррагинана не оказывает защитного действия, в то время как противовоспалительная активность хитозана не зависит от степени полимеризации.

   Апробация работы. Материалы диссертации были представлены автором в виде устных и стендовых сообщений на XIII и XIV Всероссийских молодежных школах-конференциях по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 2010, 2012; на II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», Санкт-Петербург, 2012. 4^th Annual Korea-Russia Conference «Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology», Novosibirsk, 2012.

   Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в отечественных и зарубежных журналах, рекомендованных ВАК РФ и 5 тезисов докладов в материалах научных конференций.

   Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании отдела молекулярной иммунологии ТИБОХ ДВО РАН 26 ноября 2012 г.

   Личный вклад соискателя в проведение исследования. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором совместно с сотрудниками ЛМОАБИ и других лабораторий ТИБОХ ДВО РАН, а также совместно с сотрудниками ОМИБ ИФ Коми НЦ УРО РАН. На защиту

   вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей.

   Объем и структура работы. Диссертация построена по традиционной схеме и содержит разделы «Введение», «Литературный обзор», «Материалы и методы» «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы», включающий 235 наименований. Диссертация изложена на 136 страницах. Результаты представлены в 13 таблицах и иллюстрированы 30 рисунками.

   Автор выражает искреннюю благодарность своему руководителю д.х.н. И.М. Ермак за неоценимую помощь в выполнении диссертационной работы, к.х.н. А.О. Барабановой и к.х.н. В.Н. Давыдовой за любезное предоставление образцов полисахаридов и помощь при проведении экспериментов, д.х.н. Т.Ф. Соловьевой, к.х.н. В.И. Горбачу и всем сотрудникам ЛМОАБИ, к.х.н. С.Д. Анастюку и к.ф.-м.н. В.П. Глазунову за получение и помощь в интерпретации масс -спектров и ИК-спектров, к.х.н. В.В. Исакову за получение ЯМР спектров, к.б.н. О.Ю. Портнягиной за практическую помощь в проведении иммунологических исследований каррагинанов, д.б.н. А.В. Реунову и к.б.н. В.П. Нагорской за проведение экспериментов по антивирусной активности полисахаридов. Особая благодарность директору Института Физиологии Коми НЦ уРо РАН академику Ю.С. Оводову за предоставление возможности проведения экспериментальных работ в ОМИБ этого института и также сотрудникам этого отдела: д.б.н. С.В. Попову, к.б.н. П.А. Маркову,

   1. 1. 1. С. Падерину, к.б.н. Д.С. Храмовой за практическую помощь и консультации при проведении биологических испытаний по противовоспалительной активности полисахаридов. Автор также благодарит Dr. W. Helbert за любезное предоставление фермента каппа-каррагиназы.

         Похожие диссертации на Низкомолекулярные производные ионных полисахаридов. Структура и свойства

         

         Изучение структуры, свойств и функций нового белка ядрышка SURF-6Ползиков Михаил Александрович

         Синтез и изучение связи структура-свойства замещенных фенолов - компонентов коптильных препаратовМанжос, Александр Всеволодович

         

         Структура и свойства ключевого ядрышкового белка-нуклеофозмина в клетках HeLaСауткина Елена Николаевна

         

         Структура и свойства липида А - компонента липополисахаридов YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS Красикова Инна Николаевна

         Выделение, структура и свойства новых регуляторных пептидов из мозга крупного рогатого скотаКарелин, Андрей Авенирович

         Синтез, структура и свойства производных ЛупининаУтениязов, Куанышбай

         Порообразующие белки бактерий рода yersinia. структура и свойства.Новикова Ольга Данииловна

         

         Влияние эндогенных и экзогенных факторов на структуры и свойства каррагинанов красных водорослей Tichocarpus crinitus и Chondrus pinnulatusБарабанова Анна Олеговна

         

         Синтез и изучение физико-химических свойств молекулярных структур на основе порфиринов, аминокислот и хинонов Ларкина Екатерина Александровна

         

         Влияние замен аминокислотных остатков в зонах контакта субъединиц на структуру и каталитические свойства пирофосфатазы Escherichia coliЕфимова Ирина Сергеевна