Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Подходы к направленному спин-мечению олигонуклеотидов для структурных исследований комплексов ДНК методом ЭПР Шевелев Георгий Юрьевич

Подходы к направленному спин-мечению олигонуклеотидов для структурных исследований комплексов ДНК методом ЭПР
<
Подходы к направленному спин-мечению олигонуклеотидов для структурных исследований комплексов ДНК методом ЭПР Подходы к направленному спин-мечению олигонуклеотидов для структурных исследований комплексов ДНК методом ЭПР Подходы к направленному спин-мечению олигонуклеотидов для структурных исследований комплексов ДНК методом ЭПР Подходы к направленному спин-мечению олигонуклеотидов для структурных исследований комплексов ДНК методом ЭПР Подходы к направленному спин-мечению олигонуклеотидов для структурных исследований комплексов ДНК методом ЭПР Подходы к направленному спин-мечению олигонуклеотидов для структурных исследований комплексов ДНК методом ЭПР Подходы к направленному спин-мечению олигонуклеотидов для структурных исследований комплексов ДНК методом ЭПР Подходы к направленному спин-мечению олигонуклеотидов для структурных исследований комплексов ДНК методом ЭПР Подходы к направленному спин-мечению олигонуклеотидов для структурных исследований комплексов ДНК методом ЭПР Подходы к направленному спин-мечению олигонуклеотидов для структурных исследований комплексов ДНК методом ЭПР Подходы к направленному спин-мечению олигонуклеотидов для структурных исследований комплексов ДНК методом ЭПР Подходы к направленному спин-мечению олигонуклеотидов для структурных исследований комплексов ДНК методом ЭПР Подходы к направленному спин-мечению олигонуклеотидов для структурных исследований комплексов ДНК методом ЭПР Подходы к направленному спин-мечению олигонуклеотидов для структурных исследований комплексов ДНК методом ЭПР Подходы к направленному спин-мечению олигонуклеотидов для структурных исследований комплексов ДНК методом ЭПР
>

Диссертация - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Шевелев Георгий Юрьевич. Подходы к направленному спин-мечению олигонуклеотидов для структурных исследований комплексов ДНК методом ЭПР: диссертация ... кандидата Химических наук: 02.00.10 / Шевелев Георгий Юрьевич;[Место защиты: Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук].- Новосибирск, 2016

Введение к работе

Актуальность проблемы. Исследование пространственной организации супрамолекулярных комплексов на основе белков и нуклеиновых кислот является актуальной задачей современной структурной биологии, для решения которой исследователи привлекают широкий спектр физико-химических методов, включая различные варианты флуорометрии, ренттеноструктурный анализ (РСА), спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Спиновые метки, необходимые для проведения ЭПР - стабильные молекулы, содержащие в своей структуре неспаренный электрон (парамагнитный центр), «чувствительный» к микроокружению среды, введение которого в исследуемые биомолекулы позволяет изучать их структурную организацию и конформационную динамику методом ЭПР в различных условиях среды (Duss, Nat. Com., 2014; Khramtsov, Antiox. Redox Sign., 2004). Наличие пары спиновых меток в составе молекулярного объекта дает возможность измерения межспиновых расстояний в диапазоне от 2 до 8 им (Reginsson, Biochem. Soc. Trans., 2011). Значительный интерес научного сообщества к спиновым меткам в последнее время сфокусирован в области их использования для изучения структуры сложных супрамолекулярных белковых и белково-нуклеиновых комплексов как с помощью метода импульсного ЭПР, так и в его сочетании с ЯМР и молекулярной динамикой (МД). Спиновые метки нового типа на основе триарилметильных (тритильных) радикалов, в отличие от использованных ранее меток на основе нитроксильных радикалов, засчет своих физико-химических свойств позволяют существенно расширить диапазон температурных условий проведения ЭПР экспериментов, т.е. дают возможность не ограничиваться условиями глубокой заморозки образцов (80 К), но и анализировать структуру биомолекул в условиях, близких к физиологическим (Yang, J ACS, 2012). Однако, в силу новизны и особенностей своей структуры, методология введения тритильных меток в структуру нуклеиновых кислот (НК) и белков на сегодняшний день нуждается в развитии и унификации. До настоящего времени отсутствовала информация о влиянии тритильных меток на структуру и свойства содержащих их биомолекул. Кроме этого, не решена проблема пробоподготовки спин-меченых образцов нуклеиновых кислот, например, ДНК, для проведения исследований методом импульсного ЭПР в незамороженных водных растворах, т.е. при температурах выше 0 С.

Рассматривая спиновые метки тритильного и нитроксильного типов в качестве факторов, возмущающих структуру нуклеиновых кислот, представляется крайне важным исследовать их влияние на физико- химические свойства олигонуклеотидов и их комплексов: пространственное строение и термодинамические параметры формирования спин-меченых НК-комплексов.

Цель работы - разработка подходов к 5-концевому спин-мечению олигодезоксирибонуклеотидов с использованием нитроксильных и тритильных радикалов, а также способов иммобилизации меченых ДНК комплексов, позволяющих проводить измерения межспиновых расстояний в комплексах нуклеиновых кислот при физиологической температуре методом импульсного ЭПР.

В ходе исследования решали следующие задачи: 1) разработать подходы к введению спиновых меток в структуру модельных олигонуклеотидов по 5'-концу; выбрать структуру линкера, обеспечивающую оптимальную длину и конформационную жесткость структурного звена, соединяющего олигонуклеотид и спиновую метку;

  1. исследовать влияние введенных спиновых меток на основе нитроксильных и тритильных радикалов на термодинамические параметры формирования и вторичную структуру дважды спин-меченых ДНК-комплексов;

  2. разработать подходы к нековалентной иммобилизации дважды спин-меченых ДНК-комплексов, обеспечивающие возможность измерения расстояний между спиновыми метками с помощью методов импульсного ЭПР при физиологической температуре;

4) провести анализ результатов измерений межспиновых расстояний в
тритил/тритил, тритил/нитроксил и нитроксил/ыитроксил меченых НК-комплексах,
полученных методами молекулярной динамики и импульсного ЭПР, выявить
возможные закономерности и отличия в результатах измерений;

Научная новизна и практическая значимость работы. В работе предложен новый подход к введению триарилметильных и нитроксильных спиновых меток по S'-концевому положению олигонуклеотидов с использованием конформационно жестких линкеров различной длины. При этом введение тритильных меток в структуру олигонуклеотидов осуществлено впервые. Разработан подход к созданию дважды спин-меченых ДНК-комплексов, несущих тритильные и/или нитроксильные спиновые метки. Впервые исследовано влияние тритильных спиновых меток на термическую стабильность и пространственную структуру комплексов спин-меченых ДНК. Доказано, что наличие двух S'-концевых остатков тритильных, или нитроксильных спиновых меток не приводит к существенным изменениям термической стабильности и пространственной структуры комплексов ДНК. В работе впервые были разработаны протоколы нековалентной иммобилизации комплексов спин-меченых ДНК, несущих спиновые метки тритильного типа для проведения измерений межспиновых расстояний методом ЭПР при физиологических температурах. На основе данных молекулярно-динамических расчетов впервые проведен детальный анализ структуры и конформационной подвижности набора дважды спин-меченых ДНК-комплексов, а также распределений межспиновых расстояний в случае использования различных комбинаций концевых спиновых меток (тритильных, нитроксильных и тритил/нитроксильных). Полученные данные физико-химических исследований подтверждаются результатами структурных исследований методом импульсного ЭПР, проведенных коллегами из МГЦ СО РАН как в условиях глубокой заморозки (80 К), так и при физиологических температурах (298 и 310 К). Разработанные подходы значительно расширяют границы применения методов структурного ЭПР для исследования биомолекулярных объектов.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Предложены новые подходы к введению спиновых меток на основе нитроксильных и тритильных радикалов по S'-концевому положению олигодезоксирибонуклеотидов. Впервые осуществлено введение триарилметильных радикалов в структуру олигонуклеотидов.

  2. Введение спиновых меток на основе нитроксильных и тритильных радикалов в состав олигонуклеотидов не приводит к существенному изменению эффективности комплексообраэования и не нарушает вторичную структуру дважды спин-меченых ДНК-комплексов, которая соответствует В-форме двойной спирали ДНК.

  3. Моно- и дисахариды (глюкоза, сахароза и трегалоза) в высоких концентрациях (до 1.8 М) снижают термическую стабильность модельного ДНК-комплекса (15 п.н.). Дестабилизирующий эффект в случае дисахаридов более выражен. Температура плавления олигонуклеотидного комплекса с высокой достоверностью описывается линейной зависимостью от концентрации моно- и дисахаридов.

  4. Разработаны подходы к нековалентной иммобилизации дважды спин-меченых ДНК-комплексов с использованием лиофилизованных матриц на основе моно- и дисахаридов, а также анионообменного сорбента (Nucleosil-10 DMA) в водных растворах, обеспечившие возможность измерения межспиновых расстояний -4.6 нм с помощью метода импульсного ЭПР при физиологических значениях температуры эксперимента.

5) Проведен анализ конформационной подвижности и распределений межспиновых
расстояний в различных дважды спин-меченых ДНК-комплексах, полученных методом
молекулярной динамики при температуре 298 К. Показано, что результаты
молекулярно-динамических расчетов хорошо согласуются с экспериментальными
измерениями методом ЭПР.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 работы в международных рецензируемых журналах и тезисы международной конференции в издании, индексируемом Web Of Science. Результаты работы апробированы на научных международных конференциях: Russian-British Conference «The Future of Nucleic Acid in Therapeutics» (Санкт-Петербург, Россия, 2015), 40th FEBS Congress «The Biochemical Basis of Life» (Берлин, Германия, 2015), International Research Workshop «Targeting the RNA World: Using Chemistry to Understand RNA Biology» (Республика Алтай, Россия, 2015), Russian-British Conference «Expanding Frontiers of RNA Chemistry and Biology», (Новосибирск, Россия, 2015).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, а так же заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 145 страницах, содержит 88 рисунков, 19 таблиц. Библиография включает 163 литературных источника.