Содержание к диссертации
Введение
1 Литературный обзор 12
1.1 Классификация полифенольных соединений 12
1.1.1 Флавоноиды 13
1.1.2 Изофлавоноиды 14
1.1.3 Номенклатура флавоноидов и изофлавоноидов 16
1.2 Распространение полифенольных соединений в видах рода Iris 16
1.2.1 Изофлавоноиды 17
1.2.2 Флавоноиды 25
1.2.3 Бензолкарбоновые кислоты, кетоны, фенилпропаноиды, стильбены, ксантоны 31
1.3 Методы выделения и исследования флавоноидов и изофлавоноидов 37
1.3.1 Экстракция и препаративная хроматография 37
1.3.2 Методы анализа и идентификации полифенольных соединений 38
1.4 Биологическая активность флавоноидов и изофлавоноидов из видов рода Iris 39
1.4.1 Антиоксидантная активность 39
1.4.2 Способность полифенолов предотвращать развитие нейродегенеративных заболеваний 40
1.4.3 Противоопухолевая активность 41
1.4.4 Антимутагенная активность 42
1.4.5 Противовоспалительная активность 42
1.4.6 Антимикробная активность 43
1.4.7 Эстрогенная активность 43
1.4.8 Перспективы использования полифенольных соединений для лечения диабета 43
1.5 Биосинтез изофлавоноидов 44
2 Результаты и обсуждение 46
2.1 Экстракция полифенольных соединений из корней и стеблей
Iris pseudacorus 47
2.2 Состав полифенольных метаболитов стеблей I. pseudacorus 48
2.2.1 Установление структуры транс-3-гидрокси-5,7-диметоксифлаванона 56
2.3 Состав полифенольных метаболитов корней I. pseudacorus 58
2.3.1 Установление структуры 7-О--D-глюкопиранозида 5,7-дигидрокси-6,2 диметоксиизофлавона 61
2.4 Состав полифенольных метаболитов клеточной культуры I. pseudacorus 64
2.4.1 Структурная идентификация 4 -О--D-глюкопиранозида дегидродикониферилового спирта 67
2.5 Определение содержания полифенольных соединений в корнях, стеблях и клеточных культурах I. pseudacorus 69
2.5.1 Содержание полифенольных соединений в корнях и стеблях растения 74
2.5.2 Влияние компонентов питательных сред на продукцию полифенольных соединений клеточной культурой 75
2.5.3 Содержание полифенольных соединений в "желтой" и "зеленой" линиях клеточной культуры 77
2.6 Биологическая активность полифенольных соединений I. pseudacorus 79
2.6.1 Противоопухолевая активность полифенольных соединений in vitro 79
2.6.2 Антирадикальная и антиоксидантная активности полифенольных соединений 80
2.7 Филогенетические отношения видов рода Iris на основании данных химического состава полифенольных метаболитов методом иерархической классификации 83
3 Экспериментальная часть 87
3.1 Приборы и материалы 87
3.2 Тонкослойная хроматография 87
3.3 Высокоэффективная жидкостная хроматография 87
3.4 Хроматомасс-спектрометрия 88
3.5 Растительное сырье 88
3.6 Клеточная культура растения I. pseudacorus 88
3.6.1 Влияние фенилаланина и ионов меди на продукцию полифенольных соединений клеточной культурой 89
3.7 Методы выделения полифенольных соединений из корней, стеблей и клеточной культуры I. pseudacorus 89
3.7.1 Экстракция полифенольных соединений 89
3.7.2 Препаративная хроматография 90
3.8 Метод количественного определения полифенольных соединений в корнях, стеблях и клеточных культурах I. pseudacorus 97
3.8.1 Внутренний стандарт для ВЭЖХ 97
3.8.2 Подготовка проб 97
3.8.3 Определение содержания полифенольных соединений методом ВЭЖХ 98
3.8.4 Валидация методики количественного определения полифенолов 99
3.9 Методы исследования противоопухолевой активности полифенольных соединений I. pseudacorus in vitro 99
3.9.1 Культивирование клеток 99
3.9.2 Определение цитотоксической активности полифенолов по отношению к клеткам карциномы кишечника человека HT-29 99
3.9.3 Метод мягких агаров 100
3.10 Методы определения антирадикальной и антиоксидантной активности полифенольных соединений I. pseudacorus 100
3.10.1 Определение антирадикальной активности полифенольных соединений 100
3.10.2 Определение антиоксидантной активности полифенолов на модели автоокисления линетола 100
3.11 Статистическая обработка данных 101
3.12 Построение иерархической классификации по матрице сходства для сравнения химических составов полифенолов видов рода Iris и их таксономии 101
Заключение 103
Выводы 106
Список литературы 108
- Номенклатура флавоноидов и изофлавоноидов
- Способность полифенолов предотвращать развитие нейродегенеративных заболеваний
- Установление структуры 7-О--D-глюкопиранозида 5,7-дигидрокси-6,2 диметоксиизофлавона
- Определение цитотоксической активности полифенолов по отношению к клеткам карциномы кишечника человека HT-29
Введение к работе
Актуальность проблемы. Естественный процесс старения, сердечно
сосудистые и онкологические заболевания, а также воспалительные явления
могут быть следствием нарушения нормального уровня свободных радикалов в
организме. Для лечения таких патологических состояний как в традиционной,
так и в народной медицине часто используются антиоксиданты полифенольной
природы, основными источниками которых являются высшие наземные
растения. Они защищают организм от окислительного стресса путем
нейтрализации активных форм кислорода, регулируют окислительно-
восстановительные свойства клеток и препятствуют их старению. Поиск новых биологически активных полифенольных соединений и разработка методов, позволяющих получать их в промышленных масштабах, являются важными этапами процесса создания новых лекарственных средств.
Ценным источником полифенольных метаболитов являются растения
рода Iris. Благодаря яркой окраске цветков и тонкому аромату они
культивируются в качестве декоративных растений и применяются в
парфюмерной промышленности. Документально подтверждено использование
растений рода Iris в медицине народов Европы. Корни I. germanica и
I. pseudacorus используются как мочегонное, рвотное и слабительное средства
[Wang H., 2010]. Растения рода Iris широко применяются в китайской медицине.
Согласно фармакопее Китайской народной республики, I. tectorum имеет
название «Chuan She Gan» и используется при лечении ангин, для облегчения
выведения мокроты и детоксикации организма. В Монголии I. bungei применяют
для лечения онкологических заболеваний, воспалительных процессов,
бактериальных и вирусных инфекций [Choudhary M.I., 2001]. В связи с этим актуальной задачей является изучение химического состава вторичных метаболитов растений рода Iris и их биологической активности.
Содержание вторичных метаболитов в видах рода Iris невысоко, а
возобновление растительных ресурсов происходит медленно, поэтому
перспективы приобретают биотехнологические способы получения ценных
природных веществ. Использование методов биотехнологии позволяет не только
изучать, но и регулировать биосинтез вторичных метаболитов для получения
конечного продукта с высоким выходом [Banthorpe D.V., 1994]. Важным
преимуществом такого подхода является независимость процесса
культивирования клеток растений от влияния различных факторов окружающей среды (климат, сезон, почвы, вредители). Клеточные культуры можно выращивать неограниченно долго. При этом часть полученной биомассы можно использовать для экстракции целевых продуктов, а другую часть пересаживать на свежую питательную среду для возобновления культуры.
В настоящее время получены клеточные культуры Iris ensata и I. germanica, биосинтезирующие полифенольные метаболиты [Akashi T., 2005; Boltenkov E.V., 2005]. Группой немецких ученых было показано, что клеточная культура I. pseudacorus является источником вторичных метаболитов класса терпеноидов [Ritzdorf I., 1999]. Однако на сегодняшний день в литературе
отсутствуют сведения о клеточных культурах I. pseudacorus, биосинтезирующих полифенольные соединения. Кроме того, химический состав и биологическая активность полифенолов корней I. pseudacorus ранее изучены не были.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось
сравнительное изучение химического состава и биологической активности
полифенольных соединений, биосинтезируемых органами растения
Iris pseudacorus и его клеточными культурами, а также разработка
биотехнологических способов увеличения продукции этих метаболитов культурами клеток.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
-
выделить и структурно идентифицировать полифенольные метаболиты из корней, стеблей и клеточной культуры I. pseudacorus;
-
разработать метод количественного определения полифенольных соединений и определить их содержание в корнях, стеблях и клеточных культурах I. pseudacorus;
-
разработать способы увеличения продукции полифенольных метаболитов клеточными культурами I. pseudacorus;
-
изучить антиоксидантную и противоопухолевую активности выделенных индивидуальных соединений in vitro;
-
методом иерархической классификации проанализировать данные о распространении полифенольных соединений в видах рода Iris.
Научная новизна и практическая значимость работы.
-
Впервые проведено сравнительное изучение химического состава полифенолов корней и стеблей Iris pseudacorus. Показано, что полифенольный комплекс стеблей I. pseudacorus представлен восемью изофлавоноидами, тремя флавоноидами и гидроксибензойной кислотой, а корни растения содержат четыре гидроксибензойные кислоты, шесть изофлавоноидов и флавоноид.
-
Впервые из растения I. pseudacorus были выделены флавоноид транс-3-гидрокси-5,7-диметоксифлаванон и изофлавоноид 7-О--D-глюкопиранозид 5,7-дигидрокси-6,2'-диметоксиизофлавона.
-
Из листьев I. pseudacorus совместно с сотрудниками отдела биотехнологии Биолого-почвенного института ДВО РАН впервые получена клеточная культура, способная биосинтезировать семь изофлавоноидов, флавоноид, фенилпропаноид, лигнан и гидроксибензойную кислоту. Содержание полифенольных соединений в полученной культуре клеток было в 9 раз выше, чем в растении.
-
Впервые определен качественный состав и количественное соотношение полифенольных соединений в различных органах I. pseudacorus и его клеточной культуре.
-
Впервые математическим методом иерархической классификации проанализированы данные о распространении полифенольных соединений в 34 видах рода Iris.
-
Изучены антирадикальная и антиоксидантная активности полифенольных соединений из корней, стеблей и клеточной культуры I. pseudacorus, а также
их фитокомплексов на моделях взаимодействия со свободным ДФПГ радикалом и автоокисления линетола. Определена их способность ингибировать образование колоний клеток карциномы кишечника человека HT-29.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Фитокомплексы из корней, стеблей и клеточной культуры Iris pseudacorus различаются между собой по химическому составу полифенолов.
-
Полифенольный комплекс стеблей I. pseudacorus представлен восемью изофлавоноидами, тремя флавоноидами и гидроксибензойной кислотой.
-
Корни I. pseudacorus содержат четыре гидроксибензойные кислоты, шесть изофлавоноидов и флавоноид.
-
Растение I. pseudacorus биосинтезирует два ранее неизвестных полифенольных метаболита: транс-3-гидрокси-5,7-диметоксифлаванон и 7-О--D-глюкопиранозид 5,7-дигидрокси-6,2'-диметоксиизофлавона.
-
Клеточная культура, полученная из листьев I. pseudacorus, биосинтезирует семь изофлавоноидов, флавоноид, фенилпропаноид, лигнан и гидроксибензойную кислоту.
-
Получена линия клеточной культуры I. pseudacorus, содержание полифенольных метаболитов в которой в 9 раз превышало их содержание в корнях и стеблях растения.
-
Впервые выделенный из стеблей I. pseudacorus флаванонол транс-3-гидрокси-5,7-диметоксифлаванон способен эффективно ингибировать образование колоний клеток аденокарциномы кишечника человека.
-
Изучены антирадикальная и антиоксидантная активности индивидуальных полифенольных соединений и их фитокомплексов из корней, стеблей и клеточной культуры I. pseudacorus. Наибольшей антирадикальной активностью обладает фитокомплекс из корней I. pseudacorus благодаря наличию в нем галловой и 2,3,5-тригидроксибензойной кислот.
-
На основании данных о составе полифенольных метаболитов 34 видов рода Iris построена дендрограмма их филогенетических отношений.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены автором в виде устных сообщений на всероссийских и международных научных мероприятиях «XIV Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии» (Владивосток, 2012); «2nd International symposium on life sciences» (Vladivostok, 2013); «6-й международный симпозиум Химия и химическое образование» (Владивосток, 2013); «Korea-Russia seminar on science and technology» (Khabarovsk, 2015); «Future of biomedicine conference» (Vladivostok, 2015).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано три статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и восемь тезисов докладов в материалах научных конференций.
Личный вклад соискателя в проведение исследования. Соискателем был выполнен анализ литературных данных по теме исследования, планирование экспериментов, получена основная часть результатов, написаны статьи и подготовлены доклады на конференциях. На защиту вынесены только
те положения и результаты, в получении которых роль автора была определяющей.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, посвященного полифенольным метаболитам растений рода Iris, результатов и обсуждения, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 198 источников. Работа изложена на 126 страницах, содержит 30 таблиц и 31 рисунок.
Номенклатура флавоноидов и изофлавоноидов
В мировой литературе имеется ряд обзорных статей, посвященных вторичным метаболитам растений рода Iris [2, 23, 24, 30-34]. Доннелли Д. и Боланд Г. привели обобщенные сведения об изофлавоноидах (более 260 новых соединений), в том числе из видов рода Iris, выделенных в период с 1991 по 1996 годы [23, 24]. В 1998 г. Ивашина Т. описал структуры, распределение и функции 46 различных негликозилированных форм изофлавоноидов из 18 видов рода Iris [30]. По структурному разнообразию изофлавоноидов семейство Iridaceae занимает второе место после сем. Fabaceae, однако некоторые растения, принадлежащие к сем. Asteraceae, Chenopodiaceae, Nyctagynaceae, Moraceae, также содержат значительные количества изофлавоноидов [31, 32].
Китайские авторы обобщили данные о флавоноидах и изофлавоноидах видов рода Iris, опубликованные в литературе в 1999-2008 гг. За этот период из 15 видов рода Iris было выделено более 90 флавоноидов и изофлавоноидов, включая 38 новых соединений [2]. В обзорах за 2012 г. и 2015 г. приведены сведения о распространении вторичных метаболитов различных классов в видах рода Iris [33, 34]. Наряду с флавоноидами и изофлавоноидами [33-38], в этих растениях обнаружены С-гликозиды ксантонов, хиноны и тритерпеноиды типа иридалов [34, 36, 39-43].
За период с 1961 по 2015 годы в 34 видах рода Iris были обнаружены 105 изофлавоноидов, 80 флавоноидов, 6 бензолкарбоновых кислот, 7 фенилпропаноидов, 9 ацето- и бензофенонов, 6 стильбенов и их производных и 7 ксантонов (табл. 1-9, рис. 4-7). Наиболее полно исследован химический состав полифенольных соединений I. germanica и I. domestica.
В таблице 9 систематизированы опубликованные в литературе данные о распространении в видах рода Iris 54 изофлавонов (1-54), 38 гликозидов изофлавонов (55-92), 7 кумаронохромонов (93-99), изофлаванона 100, производного ауронола 101 и 4 ротенодов (102-105) (табл. 1-3, 9, рис. 4). В отличие от сем. Fabaceae, в растениях сем. Iridaceae не обнаружено птерокарпанов, а также малонилгликозидов изофлавонов и птерокарпанов. В мировой литературе отсутствуют сведения о наличии пренилированных форм изофлавоноидов в видах рода Iris.
Изофлавоны и их гликозиды чаще всего встречаются в корнях, реже – в листьях и цветках растений рода Iris [2]. Наиболее распространенными изофлавонами в видах этого рода являются текторигенин (4) и его гликозиды 55 и 56, иристекторигенин А (9) и ирилон (22). Реже встречается иризолидон (16) (табл. 9). Текторигенин (4) либо его гликозидные формы 55 и 56 были обнаружены в 12 растениях подрода Limniris и 3 видах подрода Iris, а иристекторигенин А (9) – в 6 видах подрода Limniris и 2 видах подрода Iris (табл. 9). Эти соединения содержат гидроксильные группы в положениях при С-5 и С-7, а также метоксильную группу в положении при С-6 (табл. 1).
В видах, относящихся к подроду Iris, преобладают соединения, имеющие метилендиокси группу в положениях при С-6 и С-7. Так, ирилон (22) был обнаружен в 6 видах подрода Iris и только в 3 видах подрода Limniris (табл. 9). Помимо характерных для подрода Limniris изофлавонов 4 и 9, из надземной части растения I. japonica были выделены ирисяпонины А (13) и В (14), юнипегенин В (15), иризолидон (16), метиловый эфир ирискумаонина (17) и метиловый эфир иризолона (18) [44], а в I. dichotoma идентифицированы изофлавоноиды 17, 22, 32 и 33, также содержащие метилендиокси группу в положениях при С-6 и С-7 (табл. 9) [40, 44]. В редких случаях изофлавоны видов рода Iris могут содержать гидроксильную или метоксильную группу в положении при С-8. Изотекторигенин (37) был идентифицирован в корнях I. domestica [45], а изонигрицин (49) и изоиризолидон (50) были выделены из I. kashmiriana (табл. 9) [46].
Кислородсодержащие функциональные группы в кольце B чаще всего находятся в положении при С-4 , однако для некоторых видов подрода Limniris характерны соединения, содержащие гидроксильную или метоксильную группу в положении 2 кольца B. В частности, в листьях I. pseudacorus японскими авторами обнаружены изофлавоны 1-3 [47], а в корнях I. bungei – 1, 2 и 45 [3]. 5,7-Дигидрокси-6,2 -диметоксиизофлавон (12) был идентифицирован в корнях I. songarica [48], а в I. tenuifolia были найдены изофлавоны 2, 12, 36 и 41 [49]. Соединения, имеющие кислородсодержащую функциональную группу в положении 2 , не характерны для видов подрода Iris (табл. 9). Единственным исключением является I. germanica (табл. 9) [50].
В видах рода Iris присутствуют изофлавоноиды и флавоноиды, имеющие в своей структуре дополнительные шестичленные или пятичленные кислородсодержащие гетероциклы. В частности, кумаронохромоны были выделены японскими авторами из I. pseudacorus [47, 51]. Из корней I. bungei были выделены айяменин В (94) и новый кумаронохромон ирисбунгин (99) [36]. Кумаронохромоны были также обнаружены в I. songarica и I. lactea (табл. 9) [48, 52]. Все эти виды относятся к подроду Limniris. В мировой литературе отсутствуют сведения о выделении кумаронохромонов из растений других подродов рода Iris. Это свидетельствует о том, что кумаронохромоны могут быть важными хемотаксономическими маркерами подрода Limniris.
В I. crocea и I. spuria, принадлежащих к серии Spuriae подрода Limniris, идентифицированы изофлавоноиды 102-105 [53-55], которые, согласно классификации Вейтча, относятся к подклассу ротеноидов [25]. Такие соединения, отсутствующие в других таксонах, могут быть хемотаксономическим признаком данной серии (табл. 9).
Представители подкласса изофлаванонов, широко распространенные в растениях семейств Fabaceae и Vitaceae, редко встречаются в видах рода Iris. Единственным исключением является I. pallida, где был обнаружен 2,3-дигидроиригенин (100) (табл. 9) [56].
Гликозидные формы изофлавонов видов рода Iris содержат один или два моносахаридных остатка, которые в большинстве случаев представляют собой -D глюкопиранозу или -D-глюкопиранозил-16--D-глюкопиранозу. Такие соединения представлены О-глюкопиранозидами, в структурах которых сахарный остаток чаще всего находится в положении при С-7 или С-4 (табл. 2). В частности, в I. carthaliniae, I. spuria и I. domestica обнаружены глюкозиды текторигенина 55 57 (табл. 9) [38, 55, 57, 58]. Иристекторины А (63) и B (64) были найдены в I. spuria, I. tectorum и I. domestica [54, 57, 59, 60]. Глюкозиды необычного строения 76 и 83, структурно идентифицированные как 6-О- и 3 -О--D-глюкопиранозиды, были выделены из I. potaninii и I. lepthpylla соответственно (табл. 9) [61, 62]. Наряду с моно- и дигликозидами изофлавонов германаизмами С-Е и G (75, 84, 86, 87), из I. germanica был выделен единственный тригликозид германаизм F (88) (табл. 2) [63]. В структуру гликозида 87 (германаизма G) входит фрагмент, представляющий собой ацетилфенильное производное глюкозы. Подобного рода соединения были выделены только из I. germanica
Способность полифенолов предотвращать развитие нейродегенеративных заболеваний
Структурная идентификация 4 -О--D-глюкопиранозида дегидродикониферилового спирта Молекулярная формула C26H32O11 соединения 228 была определена на основании данных масс-спектра HR-ESI, где был обнаружен сигнал при m/z 519.1875 [M-H]- (рассчитанное значение для [C26H31O11]- составило 519.1871). В спектре 1Н ЯМР присутствовали сигналы пяти ароматических и шести алифатических протонов, шести протонов метоксильных групп, двух протонов, расположенных при двойной связи, двух протонов гидроксильных групп и шести протонов моносахаридного фрагмента. Анализ спиновых систем показал наличие двух ароматических фрагментов в молекуле 228. Протоны, входящие в состав одного из них, образовывали классическую спиновую систему ABX типа (кольцо В). Их сигналы были обнаружены при Н 6.96 м.д. (д, J=1.9, 1H), 7.06 м.д. (д, J=8.4, 1H) и 6.84 м.д. (дд, J=8.4, 1.9, 1H). Данные эксперимента NOESY свидетельствовали о том, что моносахаридный остаток, представляющий собой -D-глюкопиранозу, и одна метоксильная группа были расположены в кольце В структуры 228. Положение этих заместителей при С-4 и С-3 соответственно определено на основании данных эксперимента HMBC (табл. 21).
OH 4.72, м, 1H (OH-10) 5.00, м, 1H (OH-3b) Н-10 Н-ЗЬ В кольце А присутствовали два протона при Н 6.93 м.д. (д, J=2.0, 1H) и 6.92 м.д. (д, J=2.0, 1H), расположенные в мета-положении друг относительно друга, о чем свидетельствовала величина КССВ (2.0 Гц). Анализ NOESY спектра показал, что в кольце А расположена вторая метоксильная группа, а также алкенильный заместитель. Величина КССВ между протонами H-8 и Н-9 (J=15.9 Гц) подтверждала транс-конфигурацию двойной связи (табл. 21).
Сравнение спектральных данных для 228 с данными, опубликованными в литературе, позволило идентифицировать это соединение как 4 -О--D-глюкопиранозид дегидродикониферилового спирта [173].
Лавандозид (227) и 4 -О--D-глюкопиранозид дегидродикониферилового спирта (228) впервые были выделены из растений Lavandula spica (сем. Lamiaceae) и Euphrasia rostkoviana (сем. Scrophulariaceae) соответственно [172-174] и ранее не были обнаружены в растениях сем. Iridaceae. 5,7-Дигидроки-3,6 диметоксифлавон (221), ранее выделенный из Gomphrena martiana (сем. Amaranthaceae) [175], в I. pseudacorus был обнаружен нами впервые.
Изменения в составе, а, следовательно, и в биосинтезе полифенольных метаболитов, которые мы наблюдали в клеточной культуре I. pseudacorus по сравнению с нативным растением, происходят, вероятно, потому, что при культивировании in vitro клетки растения находятся в состоянии стресса. В результате этого в них могут экспрессироваться другие гены и биосинтезироваться другие метаболиты по сравнению с нативным растением. Подобные эффекты описаны в литературе для многих клеточных культур. Они могут свидетельствовать о переходе клеток к более "древнему" (примитивному) пути биосинтеза вторичных метаболитов [176]. Однако гораздо чаще клеточные культуры содержат наборы вторичных метаболитов, которые в точности повторяют имеющиеся у нативных растений [177, 178].
Для оценки возможности использования растения I. pseudacorus и его клеточных культур в качестве источника ценных биологически активных соединений необходимо не только изучить химический состав полифенольных метаболитов, но и определить их содержание в органах растения и его клеточных культурах. Наличие больших количеств липидов, восков, терпеноидов и других балластных соединений затрудняло исследование экстрактов из растения I. pseudacorus и его клеточных культур методом ВЭЖХ (рис. 22). В связи с этим необходимо было специально разработать методику подготовки проб для ВЭЖХ и ВЭЖХ-МС анализа, которая позволила бы отделить мешающие компоненты и сконцентрировать полифенольные соединения. Для этой цели нами были предприняты попытки хроматографирования экстрактов из корней, стеблей и клеточной культуры I. pseudacorus на полихроме, полиамиде и оксиде алюминия с использованием различных элюентов. Использование хроматографии на колонке, заполненной полиамидом, позволило наиболее эффективно удалить балластные вещества из экстрактов стеблей, корней и клеточных культур I. pseudacorus и селективно сконцентрировать полифенольные метаболиты. Элюирование полифенолов последовательно проводили гексаном (фракция А), хлороформом (фракция Б), системой растворителей хлороформ-этиловый спирт 10:1 (фракция В) и этиловым спиртом (фракция Г) [170].
Установление структуры 7-О--D-глюкопиранозида 5,7-дигидрокси-6,2 диметоксиизофлавона
Навеску (0.5 г) измельченных (меньше 100 мкм) и высушенных до постоянной массы стеблей, корней и клеточных культур I. pseudacorus дважды экстрагировали 15 мл этилового спирта. Экстракты упаривали и высушивали под вакуумом до постоянной массы. 100 мг полученных экстрактов наносили на колонку (8.52.1 см), заполненную полиамидом (8 г), и промывали гексаном (100 мл, фракция А) для удаления липидных компонентов. Фракции, содержащие полифенольные соединения, были получены после последовательного элюирования колонки следующими растворителями: хлороформ (100 мл, фракция Б), хлороформ-этиловый спирт 10:1 (100 мл, фракция В), этиловый спирт (150 мл, фракция Г). Полученные фракции упаривали, высушивали под вакуумом в присутствии P2О5 до постоянного веса и анализировали методом ВЭЖХ [170]. 3.8.3 Определение содержания полифенольных соединений методом ВЭЖХ
Для определения относительных времен удерживания (ОВУ) и поправочных коэффициентов (К) индивидуальных соединений методом ВЭЖХ использовали растворы полифенольных соединений и дигидрокверцетина (ДГК) в концентрации 1 мг/мл.
Свежеприготовленные растворы фильтровали через нейлоновый фильтр с размером пор 0.45 мкм. Приготавливали смесь из равных объемов (по 50 мкл) растворов исследуемого вещества и ДГК. В хроматограф вводили аликвоту полученной смеси объемом 5 мкл.
Отношение времени удерживания исследуемого вещества ко времени удерживания ДГК характеризовали как ОВУ, а отношение площадей их пиков при X 280 нм - как поправочный коэффициент (К). Величины ОВУ и К для каждого соединения были рассчитаны как средние значения трех измерений.
Для проведения ВЭЖХ анализа готовили растворы фракций, полученных после хроматографии на полиамиде, в этаноле (10 мг/мл). 450 мкл полученного раствора смешивали с 50 мкл ДГК (внутренний стандарт, 1 мг/мл), фильтровали через нейлоновый фильтр с размером пор 0.45 мкм. Аликвоту 5 мкл вводили в хроматограф и анализировали в условиях, описанных в пункте 2.5. Содержание полифенольных соединений (X) в органах I. pseudacorus и его клеточных культурах рассчитывали по формуле (1):
Были приготовлены растворы определяемых полифенольных соединений в концентрациях 10, 20, 40, 60, 80, 100 мкг/мл и построены калибровочные кривые, представляющие собой зависимости площадей пиков определяемых соединений от их концентраций. Для определения предела обнаружения и предела количественного определения были выбраны соотношения сигнал/шум 3 и 10 соответственно. Растворы полифенольных соединений в концентрации 10 мкг/мл последовательно двукратно разбавляли и проводили ВЭЖХ анализ аликвоты 5 мкл.
Методы исследования противоопухолевой активности полифенольных соединений I. pseudacorus in vitro 3.9.1 Культивирование клеток Клетки карциномы толстого кишечника человека НТ-29 культивировали в питательной среде McCoy s 5A, 10 % FBS (эмбриональная телячья сыворотка) («Биолот», Россия) с добавлением раствора пенициллина и стрептомицина («Биолот», Россия) в инкубаторе MCO-18AIC («Sanyo», Япония) при 37С, содержание С02 - 5 % [195].
Клетки НТ-29 (1104 в лунку) рассеивали в 96-луночные планшеты и культивировали в СО2-инкубаторе в течение 24 ч. Клетки обрабатывали индивидуальными полифенольными соединениями в концентрациях 25, 50, 100 мкМ и инкубировали в течение 24 ч. Затем в каждую лунку планшета добавляли по 20 мкл раствора MTS-реагента (“Promega”, США) и помещали в СО2-инкубатор (37С) на 3 ч. Оптическую плотность растворов А измеряли на спектрофотометре Power Wave XS (США) при 490/630 нм.
Цитотоксичность полифенольных соединений рассчитывали по формуле (2): Цитотоксичность = А(X) А(1) 100 о/ (2) А(2)-А(1) где А(1) - оптическая плотность среды для культивирования клеток, содержащей MTS реагент; А(2) - оптическая плотность среды, содержащей контрольные клетки (без обработки веществом) и MTS реагент; А(X) - оптическая плотность среды, содержащей клетки, обработанные веществом и MTS реагентом.
Действие исследуемых соединений на формирование и рост колоний клеток карциномы кишечника человека определяли с помощью метода мягкого агара. Опухолевые клетки (3104 клеток) обрабатывали исследуемыми соединениями в концентрации 25 мкМ в 1 мл 0.33 % агара ВМЕ, содержащем 10 % FBS. Затем раствор перемешивали и наслаивали поверх 0.5 % агара ВМЕ, содержащего полифенольные соединения. Контрольные клетки не обрабатывали веществами. Клетки культивировали в С02-инкубаторе в течение 14 дней. Количество и размер колоний клеток были оценены с использованием обратимого микроскопа «Motic AE 20» и программы Motic Image Plus [196].
Методы определения антирадикальной и антиоксидантной активности полифенольных соединений I. pseudacorus 3.10.1 Определение антирадикальной активности полифенольных соединений
Для определения антирадикальной активности полифенолов использовали модель их взаимодействия со свободным дифенилпикрилгилразильным радикалом (ДФПГ) [197, 198]. Измеряли оптическую плотность А0 исходного свежеприготовленного раствора ДФПГ в метаноле (10"4 М) при 517 нм. К 3 мл 10"4 М раствора ДФПГ добавляли исследуемые вещества или фитокомплексы полифенолов, растворенные в метаноле, и через 30 мин измеряли оптическую плотность А полученных растворов (их концентрации указаны в таблицах 28 и 30).
Определение цитотоксической активности полифенолов по отношению к клеткам карциномы кишечника человека HT-29
В данной работе впервые изучены полифенольные соединения корней и стеблей нативного растения I. pseudacorus, собранного на острове Сахалин. В стеблях растения I. pseudacorus были обнаружены восемь известных изофлавоноидов (2, 4, 6, 9, 12, 22, 93, 94), флавоноиды 221 и 164, 4 гидроксибензойная кислота (189), а также новый метаболит транс-3-гидрокси-5,7 диметоксифлаванон (222) (табл. 31). Для установления его структуры были использованы современные методы ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии, а также спектроскопии кругового дихроизма. Корни растения I. pseudacorus, в отличие от стеблей, содержали четыре гидроксибензойные кислоты (188, 189, 224, 225), пять известных изофлавоноидов (2, 4, 9, 12, 93) и флавоноид 221. Кроме того, из корней растения был выделен новый глюкозид изофлавона, структура которого была установлена как 7-О--D-глюкопиранозид 5,7-дигидрокси-6,2 диметоксиизофлавона (223) (табл. 31).
Совместно с сотрудниками отдела биотехнологии Биолого-почвенного института ДВО РАН из листьев I. pseudacorus впервые была получена клеточная культура, биосинтезирующая полифенольные соединения, состав которых значительно отличался от такового в органах растения. Существенные изменения в биосинтезе полифенольных метаболитов обусловлены стрессом, возникающим при переносе клеток листьев растения I. pseudacorus на питательную среду WB/2,4-D [176]. Под воздействием стресса клеточная культура Ip-ISO начала продуцировать не только полифенолы, синтезируемые растением, но и фенольные метаболиты, которые в этом растении ранее не встречались (55, 226, 227 и 228) (табл. 31).
Помимо 7 изофлавоноидов (2, 4, 9, 12, 55, 93, 98), флавоноида 221 и гидроксибензойной кислоты 226, данная клеточная культура содержала фенилпропаноид лавандозид (227) и лигнан 4 -О--D-глюкопиранозид дегидродикониферилового спирта (228), которые впервые были выделены из растений Lavandula spica (сем. Lamiaceae) и Euphrasia rostkoviana (сем. Scrophulariaceae) соответственно. Эти соединения не были обнаружены ранее в растениях сем. Iridaceae.
Для определения содержания полифенольных соединений в органах I. pseudacorus и его клеточных культурах методом ВЭЖХ была впервые предложена методика подготовки проб с использованием хроматографии на полиамиде. Впервые было выполнено сравнительное изучение содержания полифенольных метаболитов в корнях и стеблях растения I. pseudacorus. Основными метаболитами корней являются изофлавоноиды ирилин В (2) и 5,7-дигидрокси-6,2 -диметоксиизофлавон (12), а также гентизиновая кислота (225). В отличие от корней, стебли накапливали больше транс-3-гидрокси-5,7-диметоксифлаванона (222) и текторигенина (4), чем других полифенолов.
Для подбора оптимальных условий культивирования клеток I. pseudacorus было исследовано влияние элиситоров (ионов Cu2+) и компонентов питательных сред (фенилаланина) на продукцию полифенолов его клеточной культурой. Показано, что при добавлении предшественника в биосинтезе полифенолов фенилаланина в концентрации 1 мМ в клеточной массе накапливается наибольшее количество полифенольных соединений. С помощью методов селекции получена высокопродуктивная «зеленая» культура клеток, т.е. отличающаяся по цвету от остальных клеточная линия I. pseudacorus, общее содержание полифенолов в которой в 9 раз превышало таковое в органах растения.
Таким образом, впервые на примере культуры клеток I. pseudacorus показано, что семейство Iridaceae является перспективным биотехнологическим источником для получения ценных биологически активных веществ. Особенно важно то, что культура клеток стабильно продуцирует полифенолы в течение многих лет, а действием элиситоров и клеточной селекцией можно увеличить их содержание. Появление новых веществ в культуре клеток, не свойственных нативному растению, или даже всему семейству, свидетельствует об эффекте «включения» молчащих генов, что не часто встречается в биотехнологии растений. Этот эффект позволяет провести селекцию для обогащения культуры целевыми веществами.
Было изучено противоопухолевое действие полифенолов растения I. pseudacorus и его клеточной культуры in vitro. Установлено, что транс-3-гидрокси-5,7-диметоксифлаванон (222) в концентрации 25 мкМ способен ингибировать образование колоний клеток аденокарциномы толстого кишечника человека HT-29 на 81 %.
Показано, что наибольшей антирадикальной и антиоксидантной активностью обладали галловая кислота (3,4,5-тригидроксибензойная кислота, 188) и 2,3,5-тригидроксибензойная кислота (224). Наличие этих соединений обеспечило более высокую антирадикальную активность экстракта корней по сравнению с полифенольными комплексами стеблей и клеточной культуры I. pseudacorus. Впервые математическим методом иерархической классификации проанализированы сведения о распределении полифенольных соединений в 34 видах рода Iris, опубликованные в литературе, а также полученные нами экспериментально данные о полифенолах I. pseudacorus. По результатам данной математической обработки была построена дендрограмма филогенетических отношений 34 видов рода Iris.