Введение к работе
і
.^-.Постановка проблемы, ее актуальность. В результате исследова-яертдний 'последних десятилетий в тканях животных был открыт новый класс универсальных биорегуляторов, получивших нзвание "эйко-заноиды". Эти соединения являются оксигенкрованными жирными кислотами, образующимися при окислительном метаболизме арахи-доновой и родственных ей Сао-полиеновых жирных кислот. Эйкоза-ноиды контролируют многие жизненно важные функции в организме животных, в частности, сокращение гладкой мускулатуры, регуляция кровяного давления и температуры, воспалительные и бронхо-спазматические процессы. Ввиду особого фундаментального и прикладного значения открытия простагландинов констет по Нобелевским премиям присудил премию по физиологии и медицине за 1982 г. профессорам Бергстрему и Самуэльссону (Швеция) и профессору Вейяу (Великобритания).
Успехи в области исследования эйкозаноидов животных привели к попыткам поиска простагландинов и родственных им соединенна в растениях. В некоторых опубликованных работах сообщается об обнаружении простагландинов в растениях [Attrep ct al., 1980;- Левин с соавт.. 1984]. Однако эти работы нуждаются в серьезной проверке ввиду недостаточного экспериментального обоснования содержащихся в них выводов. Достаточно основательно выполненные работы других авторов [Паносян с соавт., 1979; Clayes et al., 1986], посвященные скринингу простагландинов в высших растениях, привели к отрицательным результатам. При этом в обоих случаях вместо простагландинов F и Е были выделены С% в-тригидро!кяпсислоты.
Отрицательные результаты, полученные при попытках скрининга простагландинов в растениях, очевидно, не случайны. Для оценки целесообразности поиска простагландинов или их аналогов в растениях необходимо приникать во внимание относительную распространенность различных полиеновых жирных кислот в растите-
Сокращения: ХИМС - масс-спектр химической ионизации; ЭУМС -масс-спетр электронного удара; H(P)0D - гидро(перо)ксиокта-декадиеновая кислота; (DDHCP)OT - (ди)гидро(пероЗксиоктаде-катриеновая кислота; (DDH(P)ETE - (ди)гидро(перо)ксиэйкоэа-тетраеновая кислота; ЛКК - липоксигеназа клубней картофеля; 12-оксо-ФДК - 12-оксо-10,15-фитодиеновая кислота.
- 2 -льных тканях. Преобладающая часть имеющихся литературных данных свидетельствует о том, что цветковые растения не содержат арахидоновой и эйкозопентаеновой кислот, а 8 -эйкозотриеновая кислота содержится в них в очень малых количествах [Pohl et' al., 1972; Von Kunau, 1976]. В связи с отсутствием или малым содержанием метаболических предшественников эйкозаноидов, их участие как класса биорегуляторов в системе эндогенной регуляции у цветковых растений представляется маловероятным.
Приведенный выше анализ привел нас к выдвижению концепции, явившейся предпосылкой данной работы. Согласно этой концепции, в тканях цветковых растений содержатся в малых количествах многочисленные продукты окисления линолевой и линоле-новой кислот. Эти Cfв-соединения, а также некоторые проду; ты укорачивания цепи выполняют в высших растениях роль эндогенных регуляторов типа эйкозаноидов.
Актуальность проблемы систематического изучения окислительного метаболизма линолевой и яинолеьовой кислот в высших растениях определяется следующим:
отрывочным характером имеющихся в литературе сведений по этой проблеме;
необходимостью построения максимально полной модели метаболических путей окисления С|в-полиеновых кислот в высших растениях;
достаточно высокой вероятностью обнаружения новых природных физиологически активных соединений.
Настоящая работа выполнена в рамках координируемой АН СССР программы "Физико-химические основы биологии и биотехнологии", раздел N 13: "Молекулярные основы метаболизма, его регуляция, биологическая подвижность". Название темы; "Пути окислительного метаболизма полиеновых жирных кислот в высших растениях. Роль оксигенированных продуктов в регуляции анаболизма".
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение путей окислительного метаболизма линоленовой и линолевой кислот в высших растениях, выделение и идентификация основных метаболитов.
Для достижения поставленной цели был разработан и применен новый подход, включаювшй: - использование меченых '*С линоленовой и линолевой кислот;
разделение и очистку недериватизированных продуктов окисления методом высокоэффективной жидкостной радиохроматографии;
изучение молекулярного строения очищенных соединений (также недериватизированных!) методом масс-спектрометрии химической ионизации и электронного удара, а также 'Н-ЯМР.
В задачи исследования входило
исследование метаболизма линолевой, коронаровой и верноло-вой кислот в проростках гороха;
изучение окисления а-линоленовоЯ кислоты липоксигеназой из клубней картофеля;
поиск новых метаболитов линолевой и линоленовой кислот, образуемых гидропероксиддегидразой из некоторых однодольных растений.
Научная новизна работы. Обнаружено два неизвестных ранее пути окисления полиеновых жирных кислот в растениях, а именно, мо-нооксигенаэный путь, контролируемый цитохроыом Р-450 и путь липоксигенаэного двойного диоксигенирования.
Существенно расширены представления о гидропероксидлиаз-ном и гидропероксиддегидраэном путях метаболизма. Показано, что при раеаеплении 13-гидроперехисеи гидропероксид-дегидразой наряду с первичными продуктами, С|2-альдегадами, образуется іг-гидрокси-ЗСа-додеценовая кислота. Преврадение 12-оксо- в іг-гидроксикислоту контролируется NADPH-эависимой редуктазой оксокислоты.
Впервые обнаружена зависимость направленности гидроперок-сид-дегидразного пути от величины рН. Идентифг лровано два неизвестных ранее смеетола. Предложена модель гидролиза аллен--оксида, объясняющая рН-яависиырсть направленности реакции и образование всех кетолов. Обнаружены новые продукты, образув-ояеся при яипоксигеназном окислении о-кетолов.
Показана способность различных липохсигеназ катализировать окисление 1-гидрокси-2-оксо-4С2Э-пентенияьного фрагмента вместо обычного 1<2),4{2)-пентадиекильного. В растениях с де-гидразным путем метаболизма гидроперекисей ос-кетолы является субстратами для этой необычной липоксигеназной реакции.
Идентифицирован минорный 15Ш-иэоиер іг-оксофитодиеновой кислоты. Предложена иодель механизма циклизации окисей алле-нов, объяснящая как образование 15Ш-иэомера, так и необходимость наличия определенных структурных элементов в молекулах
- A -
гидроперекисей для образования циклопентзнонов.
Впервые обнаружены в природных источниках следующие кислоты: 12-гидрокси-9(г)-додеценовая; С9,10),(IE,13)-диэпоксиок-тадекановая; 9,10-дигидрокси-12,13-эпоксиоктадокановая; 9,10--эпокси-12,13-дигидроксиоктадекановая; 9-оксо-16-гидроперокси-тЮСЕ), 12CZ), 14Ш-октадекатриеновая; 9-гидроперокси-16-оксо--10CD, 12CZ), 14(Ю-октадекатриеновая; 9-гидроперокси-12-оксо--13-гидрокси-10(Ь .ІБШ-октадекадиеновая; 9-гидрокси-Ю-оксо--ІЗ-гидроперокси-lKE),15(~)-октадекадиеновая; П-гидрокси-12--оксо-9С2),15Сг)-октадекадиеновая и 12-оксо-10,15Ш-фитодие-новая.
Некоторые из изученных соединений проявляет ростстимули-рупщую активность в низких концентрациях (10~в-10" М), в частности, 9,16-дигидрокси-10(),12(2),14(0-октадекатриеновая и 12-гидрокси-9С2)-додеценовая кислоты. Практическое значение работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание фунданенальных закономерностей окислительного метаболизма полиеновых жирных кислот в высших растениях.
Предложенный метод анализа смесей недериватиэированных оксигенированных жирных кислот и родственных соединений высокоэффективной жидкостной хроматографией с последуощим исследованием молекулярного строения отдельных компонентов масс-спек-трометрией химической ионизации и электронного удара с прямым вводом образца модет быть использован в различных лабораториях биохимического профиля. В КИБ КНЦ СССР метод используется не только для анализа оксигенирован? їх жирных кислот, но и терпеноидов.
Материалы диссертации использовались для чтения лекция по биохимии растений в Казанском государственном университете. Автор защищает:
представления об основных путях окислительного метаболизма полиеновых жирных кислот в цветковых растениях;
структуры ряда неизвестных ранее октадеканоидов;
оксигенирование аллильных кетонов - новый тип липоксигеназ-ной реакции;
новые данные-и представления о механизмах гидролиза и циклизации жирнокислотных окисей алленов.
Апробация работы. Материалы диссертации обсуждались на V Всесоюзном биохимическом схезде (Киев, 1986), итоговых научных
конференциях КЩ АН СССР СКазань, 1987-1991), I Всесоюзном рабочем совещании по растительным липидам СКазань, 1989), 8-ом (Будапешт, 1988) и 9-ом СУай, Англия, 1990) Международных симпозиумах по биохимии растительных липидоь, на научных семинарах в Делийском университете и Университете Джавахарлала Неру (Дели, Индия, 1990), на I Всесоюзной конференции по биохимии и физиологии растительных липидов СКазань, 1991). Публикации, Основное содержание диссертации отражено в 20 работах, опубликованных в отечественных С"Доклады АН СССР", "Биоорганическая химия", "Биохимия") и иностранных C'Biochimi-са et Biophysica Acta", "Plant Science", "European Journal of Biochemistry") журналах, а также в сборниках трудов международных конференций.
Структура и объем работы. Диссертация содержит 298 страниц машинописного текста и состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 414 ссылок. Представленные в работе данные проиллюстрированы 7S рисунками и 18 таблицами.