Введение к работе
Актуальность темы.
Общеизвестным является тот факт, что большинство сельскохозяйственных культур заражены вирусами, бактериями и другими инфекционными агентами. Это приводит к снижению урожайности на 25-203 не только при выращивании в открыто:; грунте, но и при хранении. Наибо.тег эффективной мерой защиты растений от патогенов является их оздоровление с последующим выращиванием в условиях, не допускавших повторного инфицирования.
В связи с этим на первый план выдвигается задача разработки быстрого, надежного и высокочувствительного теста, позволя-сдего определять вирус в начальной стадии заражения. 3 полной ::ере ре_нть эту проблему позволяет гибридсмная технология. Мсноклональные антитела (МкАт) взаимодействуют, как правило, с одном антигенной детерминантом белка оболочки вируса. Поэтому они являются высокоспецифич-ными реагентами и могут быть получены в неограниченном количестве. что создает основу для иіроксмасштабной диагностики сельскохозяйственных растений.
Основными объектами исследования данной работы являются: А-ви-рус картофеля (гр.Potyvirus). вирус мозаики резухи (rp.Kepovirus) и вирус желтой карликовости ячменя (гр.Luteovirus). А-вирус картофеля относится к наиболее обширной группе потивирусов. Ежегодный ущерб, наносимый вирусными болезнями урожаю картофеля, составляет не менее 25%. Вирус мозаики резухи поражает широкий спектр плодовых и ягодных растений, некоторые овощные культуры. Вирус желтой карликовости ячменя поражает зерновые культуры - ячмень, овес, пшеницу, рис и кукурузу, а также кормовые травы. Он распространен в Европе, Северной Америке и Австралии. Данных о распространении ВЖКЯ в России очень мало из-за отсутствия диагностических средств. Диагностика ВЖКЯ затруднена, так как вирус накапливается в растениях в очень низких концентрациях.
Цель и задачи исследования.
Целью данной работы являлось получение ИкАт к ВНР. АВК и ВЖКЯ, отбор МкАт. которые отвечают всем требованиям к иммунологическим реагентам в ИФА и на их основе разработка диагностических тест-систем для определения BMP, АВК и ВЖКЯ в растительном материале методом ИФА. В ходе работы решались следующие задачи:
-
Получение и характеристика МкАт к BMP, АВК и ВЖКЯ.
-
Определение эпитопной специфичности МкАт методом конкурентного ИФА.
-
Подбор оптимальных комбинаций антител, обеспечивающих максимальную чувствительность тест-системы как для очищенного вирусного препарата, так и для зараженного растительного материала.
-
Исследование специфичности взаимодействия МкАт к АВК и ВЖКЯ с различными штаммами и изолятами гомологичных вирусов.
-
Разработка иммуноферментных тест-систем с использованием прямого ИФА и латекс-теста для диагностики указанных вирусов.
Научная новизна.
Впервые в России получены и охарактеризованы МкАт к BMP, АВК и ВЖКЯ, которые обладают высокой аффинностью и специфически взаимодействуют как с очищенными препаратами соответствующих вирусов, так и с зараженным растительным материалом.
На базе МкАт к BMP, АВК и ВЖКЯ разработаны высокочувствительные диагностические тест-системы для определения этих вирусов в растительном материале методом ИФА с использованием конъюгатов МкАт с пе-роксидазой хрена (ПХ).
Впервые для диагностики фитовирусов применен метод латекс-агглютинации с использованием МкАт.
С помощью МкАт выявлено четыре различных эпитопа на поверхности белка оболочки BMP и по крайней мере четыре различных эпитопа на поверхности белка оболочки ВЖКЯ.
Практическая ценность работы.
Полученные в работе результаты представляют несомненный научный и практический интерес. Разработанные на основе МкАт тест-наборы для диагностики BMP, АВК и ВЖКЯ детектируют указанные вирусы с высокой чувствительностью (2-Ю нг/мл) и успешно прошли биологические испытания в МГУ им.Ломоносова. Главном Ботаническом саду РАН (BMP), ВНИИ по картофелеводству РАСХН (АВК), НИИ фитопатологии РАСХН (ВЖКЯ). Кроме того, тест-наборы были применены при получении безвирусного посадочного материала во ВНИИ садоводства им. Мичурина (г.Мичуринск) и Исследовательском институте селекции и технологии садоводства (г.Кишинев, Молдова).
Апробация работы.
Основные положения диссертации были доложены на Всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии" (Тарту-Кяэрику, Эстония, сентябрь 1938г.). международных конференциях "Роль клеточных культур в биотехнологии" (г.Нойебранденбург, ГДР, сентябрь 1989г.) и "Фундаментальные и прикладные проблемы фитовирусологии" (г.Ялта. Украина, 1994г.).
Публикация результатов исследований.
По теме диссертации опубликовано 8 работ.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на страницах машинописного текста (без списка литературы) и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов экспериментов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Список цитируемой литературы включает /,ЙГнаименований. Текст иллюстрирован ^ таблицами и / рисунками.
