Введение к работе
Актуальность работы.
Определение аминокислотного состава и аминокислотной последовательности пептидов и белков являются необходимыми стадиями структурно-функциональных исследований. Первичная структура в значительной мере определяет физиологическую активность и физико-химические свойства пептидов и белков. Свободные аминокислоты, входящие в состав физиологических жидкостей, имеют важное функциональное значение, изменение их концентраций часто является маркером метаболических нарушений. Помимо двадцати «обычных» белковых аминокислот, существует множество соединений этого класса, отличающихся от «обычных» аминокислот структурой радикала боковой цепи, либо пространственной конфигурацией, либо способом включения в полипептидный остов. В основном, модифицированные аминокислоты являются продуктами либо посттрансляционных модификаций аминокислотных остатков в составе пептидов и белков, кодируемых геномами организмов, либо метаболических ферментативных превращений, в том числе, свободных природных «обычных» аминокислот. Посттрансляционная модификация аминокислотных остатков пептидов и белков - важное явление, встречающееся в различных живых организмах - от вирусов до млекопитающих. Другой тип «необычных» аминокислот - некоднруемые аминокислоты, - синтетические аналоги, не встречающиеся в природе ни в пептидах и белках, ни в свободном виде. Синтетические пептиды, содержащие такие аминокислоты, представляют большой интерес как аналоги биологически активных природных пептидов с изменёнными свойствами, необходимые для исследования механизмов ферментативных реакций и межклеточных взаимодействий. До сих пор идентификация модифицированных и некодируемых аминокислот остается одним из наиболее сложных этапов структурных исследований. Условия реакций, используемые в классических методах аминокислотного анализа и пептидно-белкового секвенирования могут изменять или разрушать ковалентно модифицированные остатки, либо являются недостаточно чувствительными и селективными для идентификации упомянутых аминокислот, присутствующих в природных источниках в низких концентрациях. Кроме того, идентификация свободных аминокислот и аминокислотных остатков пептидов обычно основана на известных хроматографических подвижностях двадцати генетически кодируемых аминокислот, и «необычные» аминокислоты могут быть не узнаны или утеряны. Таким образом, в настоящее время существует проблема высокочувствительного надёжного определения
некодируемых и модифицированных аминокислот в свободном виде и в составе пептидов и белков как для решения структурных задач, так и для клинико-диагностических целей.
Цель работы. Эта работа посвящена разработке комплекса инструментальных высокочувствительных методов идентификации и анализа различных некодируемых и модифицированных (фосфорилированных, гидроксилированных) аминокислот как в природных и синтетических пептидах, так и в свободном виде (гомоцистеина) в плазме крови.
Научная новизна и практическая ценность работы.
-
Разработаны методики для однозначной идентификации аминокислотных остатков 1-амнноциклогексан- 1-карбоновой кислоты, 4-аминотетрагидропиран-4-карбоновой кислоты и 1-аминоциклогексан-1,4-дикарбоновой кислоты, О-фосфорилированных аминокислот, 5-гидроксилизина в пептидах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), высокоэффективного капиллярного электрофореза (ВЭКЭ), масс-спектрометрии (МС), автоматического газофазного секвенировання и приёмов микросинтеза.
-
Впервые выделен и охарактеризован ряд биологически активных пептидов морских кольчатых червей - полихет, показано, что полихеты являются потенциальными источниками пептидов с функционально ценными свойствами и необычными структурами.
-
Разработана методика скоростного анализа гомоцистеина и других низкомолекулярных аминотиолов плазмы крови для применения в клинической диагностике кардиососудистых, нейродегенеративных и других ненаследственных и наследственных нарушений метаболизма.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы.
