Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор
1.1. Рецепторы эстрогенов и механизм их действия 18
1.1.1. История открытия рецепторов эстрогенов 18
1.1.2. Структурно-функциональная организация ядерных рецепторов эстрогенов 20
1.1.3. Разновидности рецепторов эстрогенов– ER и ER 22
1.1.4. Структура гормонсвязывающего участка (ГСУ) ER,
образование комплексов с лигандами 23
1.1.5. Структура гормонсвязывающего участка ER,
образование комплексов с частичными агонистами и антагонистами 26
1.1.6. Современные представления о функциях рецепторов эстрогенов (обзор литературы за последние 15 лет) 29
1.1.7. Рецепторы эстрогенов как мишени для препаратов для лечения РМЖ 34
1.1.8. Хемокиновые рецепторы 39
1.1.9. Орфанные рецепторы 40
1.2. Гормональный канцерогенез 42
1.3. Роль эстрогенов как антиоксидантов 58
1.3.1. Антиоксидантная система организма 58
1.3.2. Оксидативное разрушение 62
1.3.2.1. ДНК и гормональная терапия 62
1.4. Ингибиторы ферментов 66
1.4.1. Роль сульфатазы эстрона в развитии рака молочной железы 66
1.4.2. Строение сульфатазы эстрона 70
1.4.3. Другие стероидогенные пути в ткани РМЖ 75
1.4.3.1. Ароматаза 75
1.4.3.2. 17-Гидроксистероид дегидрогеназы (17-ГСД) 75
1.4.4. Ингибиторы сульфатазы 76
1.4.4.1. Двойные ингибиторы сульфатаза/ароматаза (DASI) 77
1.5. Стероиды как противоопухолевые препараты - современное состояние 78
1.5.1. Стероиды как антипролиферативные агенты 79
1.5.1.1. Ингибиторы ферментов 79
1.5.1.1.1. Ингибиторы стероидной сульфатазы 79
1.5.1.1.2. Ингибиторы ароматазы 81
1.5.1.1.3. Ингибиторы 17-гидроксистероид дегидрогеназы 83
1.5.1.1.4. Антиэстрогены 86
1.5.1.1.5. Стероиды как цитотоксические агенты 93
1.6. Остеопороз 95
1.7.1. Синтез стероидных эстрогенов и их аналогов 100
1.7.2. Методы синтеза аналогов стероидных эстрогенов с заместителями в стероидном скелете 119
1.7.2.1. Синтез и свойства стероидов, содержащих алкильные группы в кольце D 119
1.7.2.2. Методы синтеза стероидных эстрогенов,
содержащих алкильный заместитель при С-7 122
1.7.2.3. Методы синтеза аналогов стероидных эстрогенов,
содержащих фтор в положении 2 138
1.7.2.4. Методы синтеза стероидных эстрогенов,
содержащих заместитель при С2 143
Глава 2. Обсуждение результатов 147
2.1. Синтез новых эстрогенов, обладающих остеопротекторным действием 147
2.2. Соединения, защищающие сердечно-сосудистую систему 171
2.2.2. Синтез аналогов эстрогенов, содержащих фтор в положении 2 и свободную фенольную группу в положении 3 192
2.2.3. Проверка предложенного M. Heravi метода
синтеза 2-фтораналогов стероидных эстрогенов 201
2.2.4. Синтез, исследование структуры и биологических свойств 13-аналогов стероидных эстрогенов 203
2.3. Исследование перспективности комбинированного применения аналогов эстрогенов и тритерпеноидов 210
2.4. Аналоги эстрогенов с антиоксидантным действием 216
2.4.1. Природные эстрогены, механизмы их гормонального действия 216
2.4.2. Модифицированные эстрогены с антиоксидантными свойствами 218
2.4.3. Антиоксидантная активность аналогов эстрогенов в отношении ЛПНП 234
2.5. Препараты с противоопухолевым действием 235
2.5.1. Разработка методов синтеза 6-окса-аналогов стероидных эстрогенов 241
2.5.2. Разработка методов синтеза 6-окса аналогов стероидных эстрогенов со свободным фенольным гидроксилом 255
2.5.3. Синтез 2-этил-аналогов стероидных эстрогенов 261
2.6. Синтез оптически активных аналогов 263
2.7. Другие аналоги эстрогенов, которые синтезированы для исследования биологических свойств 266
2.8. Исследование противоопухолевых свойств сульфаматов аналогов стероидных эстрогенов 268
2.8.1. Исследование ингибирующей способности сульфаматов стероидных эстрогенов в отношении клеток РМЖ 268
2.8.2. Препараты с негеномным механизмом действия на раковые клетки 270
2.9. Сводная таблица биологических свойств аналогов стероидных эстрогенов, полученных в работе 272
Глава 3. Экспериментальная часть 278
Выводы 379
Благодарности 381
Список литературы
- Современные представления о функциях рецепторов эстрогенов (обзор литературы за последние 15 лет)
- Двойные ингибиторы сульфатаза/ароматаза (DASI)
- Соединения, защищающие сердечно-сосудистую систему
- Препараты с негеномным механизмом действия на раковые клетки
Современные представления о функциях рецепторов эстрогенов (обзор литературы за последние 15 лет)
Ещё в 1949 г Скэтчард теоретически рассмотрел связывание молекулы ли-ганда одной молекулой белка и предложил уравнение для вычисления константы ассоциации (Ка) при образовании лиганд-рецепторного комплекса и концентрации рецепторных белков («числа мест связывания») [5]. Впервые эти величины определили экспериментально, когда стали доступны меченые тритием эстрогены, имеющие высокую удельную радиоактивность [6]. В типичном эксперименте ци-тозоль из органа-мишени инкубируют с радиоактивным гормоном, после установления равновесия разделяют свободный и связанный с высокомолекулярным рецептором лиганд. При определении содержания ER в опухолях молочной или предстательной железы для адсорбции свободного гормона рекомендуют использовать антитела [7]. Желательно учитывать скорость диссоциации гормон-рецеп-торого комплекса в процессе разделения свободного и связанного гормона [8].
Сложности в определении Ка связаны с температурой, при которой проводится эксперимент, и временем инкубации лиганда с рецепторами [9, 10]. Чтобы избежать дезактивации рецепторов, лучше проводить эксперимент при 0-4оС. Од-18 нако при пониженной температуре за время опыта система не всегда приходит в состояние равновесия, поэтому надежнее результаты, полученные при более высоких температурах (например, 25оС).
В многочисленных экспериментальных работах показано, что Ка связывания Е2 с ER находится в районе 109-1011 л/моль-1. Высокое сродство гормона к рецепторам обусловлено большой скоростью образования лиганд-рецепторного комплекса и низкой скоростью его распада [11, 12].
В разбавленных растворах с низкой ионной силой, особенно в отсутствие гормона, ER могут образовывать комплексы с белками, характеризующиеся константами седиментации от 5 до 9S (в зависимости от объекта исследования) [13-15]. Позднее установили, что форма 8-9S образована одной молекулой рецептора и двумя молекулами белка термического шока c м.м. 90 кД [16].
Исследование механизма действия эстрогенов развивалось по двум направлениям: 1) выяснением роли функциональных групп в гормонах и их аналогах и влияние различных модификаций на связывание с рецепторами; 2) установлением пути активации генетического аппарата клетки гормон-рецепторным комплексом.
Роль гидроксильных групп Е2 в образовании гормон-рецепторного комплекса установлена при исследовании белков из различных органов-мишеней [17-24]. Все авторы пришли к заключению, что фенольная гидроксильная группа вносит больший вклад в связывание с ER, но только в работе [18] отмечена аддитивность влияния гидроксильных групп.
Для высокого сродства эстрогенов с природным сочленением колец необходим «полный» углеродный скелет, секосоединения имеют пониженное сродство, особенно В-секоаналоги [25]. Отмечается большой вклад гидрофобной составляющей в энергию образования лиганд-рецепторного комплекса [26].
Подытоживая результаты работ по изучению влияния различных заместителей на сродство аналогов стероидных эстрогенов к ER, J. Karzenellenbogen с соавторами [26] предложили модель эстроген-рецепторного комплекса: фенольная гидроксильная группа образует с рецептором донорную, а гид-роксильная группа при С17 - акцепторную водородную связь; в районе 7 и 11 расположения стероидной молекулы в рецепторе имеются гидрофобные карманы объемом соответственно 17 и 45 3; стероид находится в «тесном» контакте с белком в области кольца А и положений 6, 6, 9 и 16, тогда как в зоне положений 14, 15, 16 и 17 рецептор достаточно подвижен; в -области кольца А стероидной молекулы рецептор содержит полярные группы; в районе 12 стероида у рецептора имеется «высоко подвижный» участок. Предложенная модель остается полезной для выбора модификаций в структуре лигандов, которые должны усилить или ослабить сродство к рецепторам.
Клеточный сигнал эстрогенов опосредован двумя ERs, ER (NR3A1) и ER (NR3A2), оба принадлежат к семейству ядерных рецепторов.
Лиганд-зависимая передача сигнала эстрогеном начинается со связывания эстрогена с ER. Поэтому специфический транскрипционный отклик к эстрогену зависит от множественных факторов, наиболее быстрый – взаимодействие c коре-гуляторами в данной клетке и промотерами эстрогеночувствительных генов. Поскольку гормоны – модуляторы транскрипции, отклик генов также зависит от того, какие другие сигнальные пути активны во время гормонального действия [27, 28].
Все члены суперсемейства имеют высокую степень подобия (гомологии) первичных структур доменов, выполняющих главные биологические функции, и характеризуются близкой доменной организацией молекул [29, 30]. Так, молекула ER имеет шесть функциональных областей.
В N-концевой области А/В находится гормононезависимая активационная функция AF1, ответственная за активацию генов в органах-мишенях [31, 32]. Домен С (DBD) содержит два цинковых «пальца», узнающих гормоночувст-вительные элементы генов и обеспечивающих связывание рецептора с ДНК, а также участвует в димеризации рецептора [31-33].
Домен Е (LBD) ответственен за узнавание и связывание лигандов, а также участвует в димеризации и активации рецептора [31, 33]. В этой СООН-терминальной зоне находится гормонозависимая активационная функция АF2 [34, 35]. Функции АF1 разных рецепторов существенно отличаются, АF2-схожи [36].
Между доменами С и Е лежит «шарнирная» область D, вариабельная по длине и аминокислотной последовательности. С помощью этой области конформа-ционные изменения, происходящие в домене Е после связывания агониста, частичного агониста или антагониста, оказывают влияние на конформацию домена С [28].
Димеризация рецептора с участием лигандсвязывающего участка происходит только после образования комплекса с агонистом. Домен Е связывается с другими белками, входящими в состав олигомерного неактивированного рецепторного комплекса, и с различными факторами транскрипции, а также содержит сигнал ядерной локализации. Наконец, вариабельный по длине и первичной структуре участок F может играть роль ингибитора транскрипционной активности рецептора в отсутствие гормона, а также опосредует активность антиэстрогенов [37].
Двойные ингибиторы сульфатаза/ароматаза (DASI)
ГСУ ER - большой по размеру для E2 [66]. Это позволяет ER связываться с широким кругом соединений, удивительно различающимися по структуре. Кроме эстрогенов, ERs также проявляет афинность к загрязнителям окружающей среды -полициклическим ароматическим углеводородам, фталатам, и пестицидам. Фито-эстрогены также имеют эстрогенные эффекты и названы эдокринными разрушителями. Считают, что измененная репродуктивная способность и рак МЖ и эндометрия - следствия действия эндокринных разрушителей. С другой стороны, эпидемиологические исследования показали связь диеты, богатой фитоэстрогенами (в частности, сои и не очищенных зерновых продуктов), с уменьшенным риском возникновения некоторых гормонозависимых онкологических заболеваний. Хорошо известны антипролиферативные свойства генистеина (6), наиболее обильного фитоэстрогена в сое, его сродство в 9 раз большее к ER, чем к ER [50]. Ожидается, что за счет ER селективности, генистеин не будет иметь нежелательных побочных эффектов на эндометрий. Будет ли генистеин сам по себе замещать эффекты эстрогена в кости, мозге, сердечно-сосудистой и иммунной системах – сейчас активно исследуется. он он Genistein ici 164384 8a-estradiol РСА комплексов ГСУ ER с генистеином (6) показал, что пространственные структуры ГСУ ER и ER в целом близки [73], а в ближайшем окружении ли-гандов первичные структуры рецепторов различаются только в 2-х положениях: в ER вместо Leu384 находится Met293, а вместо Met421 - Ile330 (различие в нумерации аминокислотных остатков связано большей длиной ER). Сердцевидный сэндвич, образованный спиралями 2-11, сохраняется, хотя и наблюдаются небольшие изменения в длине и относительной ориентации спиралей. Короткая спираль 1, наблюдаемая в ГСУ ER, отсутствует в ГСУ ER; отличаются конформа-ции петель, соединяющие спирали 2 и 3, 9 и 10. Наибольшее различие между ГСУ ER и ER - в расположении спирали 5.
Генистеин лежит поперек связывающего кармана ER, подобно Е2. Ароматическое кольцо расположено в узкой щели между спиралями 3 и 6. Фенольная гидроксильная группа взаимодействует с Glu305, Arg346 и молекулой воды. Флавоновая часть лиганда занимает то же положение, что и кольца C и D Е2 в ER и ориентирована так, что гидроксил О2 образует водородную связь с His475. Сравнение пространственных структур комплексов ралоксифена 2 с ГСУ ER [66] и ГСУ ER [79] показало, что они также очень похожи.
Созданы различные синтетические антагонисты ER, некоторые из них используются в клинике для остановки рост-промотирующих эффектов эстрогенов в РМЖ [обзоры: 80, 81]. Многие соединения разработаны и охарактеризованы с целью получения более ткане- и рецептор- селективных эффектов [82, 83]. SERM (селективные модуляторы ER) - синтетические лиганды ER, которые проявляют тканеселективную фармакологию. Как антиэстрогены (или антагонисты) они блокируют действие эстрогенов в определенных тканях, и имитируют действие эндогенных эстрогенов (агонистов) в других [27].
Особый интерес представляют данные РСА, полученные при исследовании комплекса ICI 164384 (7) c ГСУ ER [84]. Трехслойный антипараллельный - спиральный сэндвич ER такой же, как в комплексах ГСУ с другими лигандами. Карман, который вмещает стероид 7, скрыт гидрофобной поверхностью под центральным слоем спиралей. С-концевая спираль 12 не видна на экспериментальной карте электронной плотности.
Заместитель при С7 слишком велик, чтобы занять свободное место, имеющееся на этом участке ER. Соединение 7 может расположиться в лиганд-связывающем кармане только благодаря каналу, который образуется при расширении гидрофобной зоны в области С11 лиганда и перемещении спирали 12. Это возможно только в том случае, если стероид повернется на 180о относительно оси О3-О17 по сравнению с положением Е2 в ER [66]. Это и происходит (по данным РСА). Часть цепи заместителя при 7 выходит наружу связывающей щели через 11канал. Фенольная группа кольца А взаимодействует с карбоксильной группой Glu260, Arg301 и координирует молекулу Н2О, а гидроксильная группа в кольце D с His430. Интересно, что положение этой гидроксильной группы и His430 очень похожи на положения соответствующих групп в комплексе ER с ралоксифеном. Центральная часть соединения 7 располагается таким образом, чтобы максимально занять пространство связывающей щели. Кольцо А стероида смещается от спиралей 3 и 6 на 1. Боковые цепи Ile328, His430 и Leu431 приспосабливаются для размещения кольца D, которое остается в том же месте. Боковая цепь стероида выходит за пределы связывающей щели, как у ралоксифена 2, однако занимает иное положение, и обеспечивает антагонистические свойства.
Данные РСА комплексов различных лигандов с ER и ER служат основой для предварительной оценки гормональных свойств новых соединений еще до их синтеза. Для этого можно докировать в ГСУ ER, построенный по данным РСА, молекулу потенциального лиганда и оптимизировать её положение с помощью того или иного полуэмпирического метода квантовой химии. В работе [85] при использовании такого подхода высказано предположение, что 8-эстрадиол 8 связывается с ГСУ ER так, что кольцаС и D этой молекулы занимают то же положение, что и Е2, тогда как положения колец А и В тех же лигандов различаются. Эта модель позволяет объяснить свойства многих эстрогенов 8-ряда и предсказать гормональную активность новых веществ.
Молекулярные биологические, биохимические и структурные изучения дали бесценную информацию для создания более селективных и эффективных ли-гандов ER. ERs не функционируют сами по себе, а требуют ряд корегуляторных белков, чья клеточно-специфичная экспрессия объясняет некоторые различающиеся клеточные свойства эстрогенов. Эстроген – важный морфоген, многие его пролиферативные эффекты на эпителиальные отсеки желез опосредованы факторами роста, секретируемыми из стромального отсека. Таким образом, понимание взаимосвязи между факторами роста и действием эстрогена – существенно как для понимания нормального роста, так и опухолевого.
Эстрогены играют ключевую роль в развитии и поддержании нормальной сексуальной и репродуктивной функций. Кроме того, как у мужчин, так и у женщин, они проявляют широкое биологическое действие на сердечно-сосудистую систему, мускулаторно-скелетную, иммунную, ЦНС [86]. Основные открытия в этой области сделаны в поздние 1950-е, когда Elwood Jensen [87] открыл и охарактеризовал эстроген-связывающий белок, сегодня известный как ER. В 1993 г, 30 лет спустя, создана первая ER нокаутная мышь [88], и сделано сенсационное открытие, что жизнь возможна без этого рецептора, который, как думали в то время, единственный регулятор действия эстрогенов. Вскоре после исследования ER нокаутных мышей открыт ER [51], и возник вопрос: была ли выживаемость ER нокаутных мышей за счет замещения функций ER на ER. Были созданы ER нокаутные мыши, а затем ER нокаутные. Эти различные модели показали, что жизнь возможна без одного или обоих ER, но репродуктивные функции серьезно ослаблены. Также показано, что ER и ER играют различные роли в иммунной, скелетной, сердечно-сосудистой системах и ЦНС [86, 89]. Считают, что суммарный пролиферативный отклик к E2 - баланс между действием ER и ER и их изоформами. Эти пути могут быть селективно стимулированы или ингибированы селективными препаратами, что открывает новые многообещающие терапевтические возможности в клиническом применении для ГЗТ, лечения аутоиммунных заболеваний, рака МЖ и простаты, депрессии. Антиэстрогены, блокирующие действие ER, широко и эффективно используются в клинической практике для лечения РМЖ [90].
Соединения, защищающие сердечно-сосудистую систему
Соединение 471 получают кристаллизацией с выходом 33%. Соединение 470 выделяют из маточного раствора хроматографически с выходом 32% и цикли-зуют в ацетоне под действием H2SO4 при -200С, выход соединения 472 достигает 33%. Побочные реакции – элиминирование фенилсульфонильной группы с образованием производного эквиленина и расщепление трет-бутилового эфира и ке-таля. Соединение 471 циклизуется в толуоле со смесью CF3COOH и (CF3CO)2O (3:1) с образованием соединения 473 (выход 81%).
Эстратетраен 473 - единственный промежуточный продукт для дальнейшего синтеза аналогов с природным сочленением колец, т.к. соединение 472 из-за сте-рического экранирования -стороны молекулы после гидрирования образует аналог с цис-сочленением колец В и С (9-аналог) (схема 54) [515]. Если не выделять антиподы, а после циклизации добавить сильное основание (LiMe, LiH, LDA), то образуется 7-сульфонилэстра-1,3,5(10),9(11)-тетраен (472), который под действием воды или уксусной кислоты количественно изомеризуется в 7-сульфонилэст-ра-1,3,5(10),9(11)-тетраен (473) [514]. Каталитическое гидрирование смеси соединений 472 и 473 осуществляют в присутствии Pd/CaCO3, Pd/C, Pd/BaSO4 или NiRа.
Полученный 7-сульфонилэстратриен может депротонироваться в присутствии основания и при подкислении изомеризоваться в 7-сульфонилэстратриен. Следующий шаг - метилирование Mel, которое может проходить без изомеризации продуктов гидрирования. Но если проводить реакцию так, что продукт гидрирования в реакции депротонируется и метилируется, то получают 7-метил-7-суль-фониланалог. Предпочтительная температура - от -20С до комнатной. Подходящие растворители - ДМСО, ДМФА, ТГФ, толуол, бензол, Et20. Соединения 472 и 473 можно сначала метилировать, а потом гидрировать. В присутствии алкилли-тия или LiH образуется анион, который метилируется Mel. Полученный при этом промежуточный 7-метил-7-сульфонил-эстра-1,3,5(10),9(11)-тетраен селективно гидрируется в соответствующий эстратриен. Удаление серы осуществляют химически или электрохимически. Химическое отщепление проводится по следующей схеме: соединение 475 растворяют в протонном или апротонном растворителе и восстанавливают амальгамированными К, Li или Na (схема 55). Возможны и другие варианты восстановления, например, под действием алюмогидрида лития /Ni (Rа), диизобутилалюмогидрида с Ni(Rа) в гексаметаполе при 40-70С.
Схема 55. Наиболее интересными являются методы полного синтеза стероидных эстрогенов. Так, используя бромид 477 для алкилирования соединения 464, можно получить 7-метилстероиды. При алкилировании ,-ненасыщенного кетона 464 образуется моноалкилированный продукт 478 с выходом 60% в виде смеси эпиме-ров, в которой преобладает 7-метилпроизводное. После замыкания кольца в фу-ран 479 и последующего каталитического гидрирования полученный секоспирт 480 служит доказательством того, что реагент при гидрировании подходит с -стороны молекулы. После этой стадии метильная группа в положении 7 расположена в -области. Окисляя спирт 480 и циклизуя полученное соединение 481 авторы получали тетрациклический продукт 482 с выходом 78%. Очевидно, из-за влияния 7-метильной группы при гидрировании 9(11)-двойной связи образуется эстратриен 483 с -ориентацией протона при С-9. После снятия защиты с 17 положения авторы получали 7-метилзамещенный аналог 484 (схема 56). OMe Ot-Bu Ot-Bu Ot-Bu
Схема 56. Из работы Anner и сотрудников [517] известно, что фармакологически более интересны эстрогены с 7-метильной группой. Чтобы синтезировать такие производные, авторы алкилировали соединение 464 оптически активным тозила-том (S) 485. Авторы статей [516, 518] получали секосоединение 486 с -метиль-ной группой в положении 7, реакция протекает с полной инверсией хирального центра тозилата 485 (схема 57).
Схема 57. Наиболее удачной для синтеза аналогов с метильной группой в положении 7 является схема полного синтеза стероидных эстрогенов, предложенная Торговым и Ананченко [422, 424]. Преимущества данного метода: масштабируемость, возможность получать практически любые модифицированные аналоги стероидных эстрогенов (за некоторым исключением), возможен переход к аналогам природного ряда, а также к оптически активным стероидам. Авторы статьи [454] ис-135 пользовали данную схему для синтеза аналогов с -метильной группой в положении 7 (схема 58). Соединение 492а получено с выходом 52% в расчете на соединение 489а, а соединение 492Ь - с выходом 69% в расчете на соединение 489Ь.
Схема 58. Ранее на кафедре ХПС использование схемы полного синтеза Торгова-Ана-нченко позволило получить торговские эстрапентаены с метильной группой в положении 7 (включая D-гомо-аналоги) [519, 520, 521, 522]. В ряду 6-окса-аналогов эстрапентаен 493 – ключевое соединение, которое дает возможность получать аналоги с различным сочленением колец при различных условиях гидрирования (схема 59). Так, гидрирование соединения 493 на NiRa привело к получению эстра-тетраена 494 и эстратриена 495. Было исследовано пространственное строение соединения 494 методами спектроскопии ЯМР и РСА, что важно для предсказания биологических свойств модифицированных аналогов стероидных эстрогенов [520].
Сродство соединения 496 к цитоплазматическим рецепторам матки крысы меньше, чем у аналога 497 в 9 раз, а контрацептивный эффект составил 87% как в дозе 0.01 мг/кг, так и в дозе 0.1 мг/кг. Утеротропная активность соединений оценивалась по дозе, вызывающей удвоение массы матки по сравнению с контролем. Эта доза равна 1 мг/кг, что в 100 раз превосходит дозу, обеспечивающую предупреждение беременности в условиях эксперимента [519].
Препараты с негеномным механизмом действия на раковые клетки
Моделирование связывания различных 8-аналогов стероидных эстрогенов с ER показало, что введение CH3 группы в положение 4 или 7 молекулы D-го-мостероидов может привести к сильному снижению сродства к рецептору, так как продуктивное связывание может происходить только при сильной деформации кольца В. Указанные модификации достаточно просто осуществить в ряду 6-окса-D-гомостероидов [772], целевыми соединениями выбраны аналоги 248 и 304с. Об эффективности влияния модификаций на изменение гормональных свойств целесообразно судить, сравнивая их свойства с таковыми стероида 304b.
Следует указать, что специфические модуляторы ER (например, ралокси-фен) могут иметь серьезные побочные эффекты, характерные для природных гормонов [773]. Более того, оказалось, что длительное введение ралоксифена женщинам, находящимся в пременопаузе, приводит к повышению в крови содержания Е2 и сексгормон-связывающего глобулина, что свидетельствует об увеличении риска развития инвазивного РМЖ [774]. Поэтому для создания ингибиторов метаболизма стероидных гормонов и носителей в органы-мишени эстрогенов других классов биологически активных веществ перспективны соединения, не имеющие гормональных свойств.
6-Окса-D-гомо-8-эстрон и его метиловый эфир обладают пониженной уте-ротропной активностью [775, 776], и введение 2-х метильных групп в положение 16, по аналогии с карбоаналогами [726], может привести к полному исчезновению эстрогенной активности у модифицированных веществ. Мы синтезировали стероид 304a [777] и исследовали биологические свойства.
Эстрогены с С3-OH должны иметь большее сродство к рецепторам, чем аналоги с метоксильной группой [85]. В комплекс Е2 с ER, построенным по данным РСА [66], вместо природного гормона докировали аналог 305b. Оказалось, что структура плохо совместима с геометрией ГСУ рецептора. Наличие СН3-С16 вынуждает лиганд занять энергетически невыгодное положение в комплексе с белком, исключающее образование водородных связей между группой NH His524 и кетогруппой при С17а, что должно заметно снизить сродство стероида к рецептору. Кроме того, возникают неблагоприятные взаимодействия между Н4 и Н7 и Met388, Н11 и Н11 стероида и СН3 группой Ala350 рецептора (1.9 и 2.2 соответственно).
Расстояние между гидроксильной группой при С3 и кислородом карбоксильной группы Glu353, по расчетным данным, около 3.8 , что намного больше, чем в комплексе с Е2 (2.4 ) [85]). Вычисленная величина энтальпии образования лиганда в комплексе с рецептором примерно на 10 ккал/ моль больше, чем в свободном состоянии. Очевидно, что стероид практически не должен обладать утеротропной активностью. Еще большие различия в этальпии образования в комплексе с ER и в свободном состоянии у антипода соединения 305b.
Из смеси эпимеров по С7 (a) получены индивидуальные стероиды 248 и 307. Каталитическое гидрирование соединений 308b,c, у которых 14(15)-двойная связь пространственно не экранирована, протекает достаточно селективно, что позволило синтезировать стероиды 304b,c с относительно высокими выходами. Структура соединений 248, 304b,c доказана методами РСА [793] и спектроскопии ЯМР. Стероид 305 синтезировали согласно способу [777].
Первоначально 7-метил-3-метокси-D-гомо-6-окса-эстра-1,3,5(10),8,14-пен-таен-17а-он (306а) получен кипячением бензольного раствора секосоединения в присутствии пosOH. После перекристаллизаци из MeOH выход составил 10% в расчете на секосоединение. Каталитическое гидрирование ацетата 308а на NiRa под давлением и при высокой температуре и окисление продуктов реакции привело к получению стероида 248 с крайне низким выходом (12% на эстрапентаен 306а). РСА эстрапентаена 311 показал, что -область молекулы пространственно экранирована СН3 группами при С7 и С13. Это означает, что при каталитическом гидрировании стероида 311 преимущественный подход катализатора к системе сопряженных двойных связей будет осуществляться с -стороны молекулы, что открывает возможность восстановления двойных связей в мягких условиях. Это предположение мы подтвердили экспериментально. Разделение смеси эпимеров по С7 перед стадией гидрирования дало возможность выделить 7-изомер 311, при его гидрировании в смеси ТГФ-MeOH (1:1) образуются стероиды 248 и 312 с выходами 61% и 25% (схема 42). При гидрировании смеси эпимеров 308а над Pd/C в бензоле или ТГФ образуется эстратетраен 313 с выходом 57%, гидрирование же чистого 7-изомера позволяет получить аналог 312 с выходом 91%.
Аналоги 304c, 311 и 305a не проявили утеротропной активности (по влиянию на увеличение веса матки ОВЭ крыс [778] и по способности индуцировать синтез рецепторов прогестерона [779]). Подчеркнём, что соединения 304c, 311 и 305a не имеют гипертриглицеридемического действия (в отличие от стероида 304b). Наибольший интерес представляет соединение 304c, проявившее гипохо-лестеринемический эффект при отсутствии утеротропной активности (табл. 52). Стероиды 304c, 311 и 305a – платформы для создания носителей биологически активных пептидов и ингибиторов ферментов, ответственных за метаболизм стероидов.