Содержание к диссертации
Введение
Часть 2. Обзор литературы 7
2.1. Олиголактозамин (Gaipi-4GlcNAc)n и изолактозамин (Gaipi-3GlcNAc) в составе гликанов человека 7
2.1.1. Олиголактозаминовые цепи эритроцитов 7
2.1.2. Муцины, межклеточный матрикс 12
2.1.3. Олиголактозаминовые цепи иммунных клеток 13
2.1.4. Олиголактозамины молока 19
2.1.5. Изменение гликанов поверхности клеток при онкотрансформации 21
2.1.6. Заключение 22
2.2. Методы синтеза олиго-7У-ацетиллактозаминсодержащих олигосахаридов 23
2.2.1. Химические методы синтеза 23
2.2.2. Ферментативные методы синтеза 32
ЧАСТЬ 3. Обсуждение результатов
3.1. Синтез олиголактозаминов 37
3.2. Синтез флуоресцеин-меченых полиакриламидных гликоконъюгатов 71
3.3. Изучение углеводной специфичности галектинов в составе клеточной мембраны 72
Часть 4. Выводы 78
Часть 5. Экспериментальная часть 79
5.1. Синтез олиголактозаминов 79
5.2. Синтез флуоресцеин-меченых полиакриламидных гликоконъюгатов 112
5.3. Изучение углеводной специфичности галектинов в составе клеточной
ЧАСТЬ 6. Список цитируемой литературы
Список используемых сокращений
- Олиголактозаминовые цепи иммунных клеток
- Методы синтеза олиго-7У-ацетиллактозаминсодержащих олигосахаридов
- Изучение углеводной специфичности галектинов в составе клеточной мембраны
- Изучение углеводной специфичности галектинов в составе клеточной
Олиголактозаминовые цепи иммунных клеток
Основным гликопротеином мембраны эритроцитов является транспортер анионов Band 3 [19]. Его N-гликаны имеют следующие структурные особенности: - являются двух- (основные компоненты) или трехантенными (минорные компоненты) комплексного типа, построенными на основе коровой структуры Manal-6(Manal-3)[±GlcNAcP 1 -4]МапР 1 -4GlcNAcP 1 -4(Fucal -6)GlcNAc-Asn; - олиголактозаминовые цепи, присоединенные к Manal-6-антенне, состоят из 10-12 лактозаминовых блоков и имеют три точки ветвления; - олиголактозаминовые цепи, присоединенные к Мапа 1-3-антенне, состоят из 5-6 лактозаминовых блоков и имеют 1-2 точки ветвления; - цепи, образованные разветвлением основной цепи, состоят из одного лактозаминового блока; - терминальные галактозные остатки могут содержать al-2-связанную фукозу (для Band 3 из эритроцитов группы крови О), а также а2-3- или а2-6- связанную сиаловую кислоту.
Таким образом, N-гликаны Band 3 содержат антигены АВН, а также сиаловую кислоту, придающую поверхности эритроцита слабоотрицательный заряд (препятствующий агрегации эритроцитов). Сиалилированные олиголактозамины также присутствуют на гликолипидах мембраны эритроцитов (Рисунок 4) [20-22]. Neu5Aca2-qGal31-4GlcNAc31-3Gaipi-4GlcNAc31-3Gaipi-4Glcpi-Cer
Таким образом, как гликолипиды, так и гликопротеины мембраны эритроцитов содержат разветвленные олиголактозамины, несущие детерминанты групп крови АВН, а также остаток сиаловой кислоты. Как было показано [23-25], разветвленные олиголактозамины являются антигенами для 1-антител, аллоантигеном для данной структуры являются линейные Р1-3-замещенные олиголактозамины (i-антигены). Эритроциты пуповинной крови и новорожденных богаты і-антигеном и практически не проявляют I-антигенность [26, 27], причем в течение первых лет жизни ребенка і-антигенность идет на убыль, тогда как 1-антигенность возрастает. Хотя і-антиген является маркером зародышевых тканей, он коэкспрессируется с 1-антигеном на зрелых лимфоцитах [28]. Существует редкий (1 из 10 тыс.) фенотип людей, имеющих дефицит 1-антигена, но не полное его отсутствие [29]. Углеводные цепи пуповинных, а также i-эритроцитов, в среднем, короче цепей зрелых I-активных эритроцитов из-за отсутствия ветвления, и состоят из 6-15 моносахаридных остатков; среднее число разветвлений на молекулу равно 0.7 [26].
В эритроцитах отсутствует галактозилтрансфераза, синтезирующая Р1-3-связь между остатком галактозы и JV-ацетилглюкозамина, однако на мембране эритроцитов найдены гликолипиды, содержащие фрагмент Lec, а также его фукозилированные производные: Lea (Gaipi-3[Fucal-4]GlcNAc) и Leb (Fucal-2Gaipi-3[Fucal-4]GlcNAc) [30, 31]. Подобные гликолипиды, содержащие дисахарид типа 1, были найдены в плазме крови [31, 32], откуда они адсорбируются на поверхность эритроцитов. Хотя к АВН-антигенам применяется термин "антигены групп крови", они составляют основные аллогенетические антигенные детерминанты большинства типов эпителиальных клеток, а также найдены в первичных сенсорных нейронах. Более того, филогенетические исследования показали, что данные структуры появляются эволюционно раньше в эктодермальной и эндодермальной тканях, чем в мезенхимальных гематопоэтических тканях, в том числе в эритроцитах [30, 33-35]. Поэтому используется расширенный термин "histo-blood group antigens".
Как видно из рисунка, коровой частью гликолипидов мекония является Lecpi-3 Lac, а дальнейшее удлинение углеводной части происходит за счет добавления лактозаминовых блоков [38]. Показано [40], что ткани эмбриональной эндодермы распознаются антителами к Lecpi-3 Lac, также авторами сделан вывод, что "исчезновение" данной антигенной активности дифференцированных клеток является результатом маскировки тетрасахарида дополнительными углеводными (олиголактозаминовыми) цепями. Также с помощью моноклональных антител было показано, что эпителиальные муцины кишечника характеризуются экспрессией АВН антигенных детерминант исключительно типа 1 (то есть на основе Lec) [41, 42]. АВН детерминанты типа 1 экспрессируются на эндодермальных тканях, таких как выстилающий эпителий и железистый эпителий [42].
Таким образом, на тканях эктодермального и мезодермального происхождения экспрессируются олигосахариды исключительно с цепями типа 2 (LacNAc), тогда как ткани эндодермального происхождения экспрессируют углеводы, содержащие тип 1 (Lec). При этом фрагмент Lec находится как в коровой части, так и в периферической иммунореактивной части молекулы, а внутренние цепи построены на основе iV-ацеталлактозамина. Данная закономерность наблюдается как в случае гликолипидов, так и в случае гликопротеинов [30, 38].
Методы синтеза олиго-7У-ацетиллактозаминсодержащих олигосахаридов
Другим преимуществом DMM-защиты является высокая степень стереоселективности гликозилирования: образования а-аномеров ни разу не наблюдалось. Выходы Р-аномеров в реакциях гликозилирования iV-DMM-защищенными донорами составили порядка 70%, что сопоставимо с выходами гликозилирования JV-фталимидными гликозилдонорами. Замена iV-диметилмалеимидной защиты на JV-ацетильную также проходила с выходом порядка 70-80%.
Авторы работы [125] провели сравнение выходов реакции гликозилирования различными гликозилдонорами: тиогликозидами, бромидами, Р-ацетатами, имидатами и оксазолинами JV-трихлорцетильных производных глюкозамина и лактозамина. Гликозилирование тиогликозидами в присутствии NIS/TfOH проходило с наибольшими выходами (60-85%), поэтому в дальнейшем для синтеза использовали именно данный метод . Кроме того, в процессе синтеза была исследована зависимость результатов реакции гликозилирования тиогликозидами JV-трихлорцетильных производных глюкозамина и лактозамина от типа защитных групп глюкозаминового остатка гликозилдонора. Показано, что выходы гликозилирования в случае использования бензильной защиты выше, чем при использовании ацильных (бензоильной или ацетильной). Авторы также отмечают легкость удаления iV-трихлорацетильной защиты с помощью метанолиза, выход реакции количественный. В ходе работы были синтезированы сиалил-лакто-ІМ-неотетраоза, сиалил-лакто-1М-тетраоза, их фрагменты и аналоги:
Выходы при гликозилировании гликозилбромидами в присутствии AgOTf были сопоставимы с выходами при использовании тиогликозидов (60-85%), однако гликозилбромиды аминосахаридов неустойчивы при хранении, поэтому их необходимо синтезировать непосредственно перед реакцией гликозилирования, что не всегда удобно. OBn 9Bn BnOl
Тетралактозаминовый фрагмент синтезировали блок-синтезом по схеме 2+2, затем 4+4. При гликозилировании 3 ,4 -диола в присутствии катализатора Сузуки выход дилактозамина составил 25%, что авторы объясняют высокой активностью JV-трихлорацетильных доноров, так как при этом наблюдалось образование 23% диаддукта (Схема 3 А). При гликозилировании моногидроксипроизводного (Схема 3 В) выход составил 85%.
Полученный тетрасахарид был превращен как в гликозилакцептор - удалением аллильной защитной группы (выход 97%), так и в донор - десилилированием с последующим получением имидата, выход 94% на две стадии. Реакцию гликозилирования проводили в присутствии триметилсилилтрифлата, выход составил 93%. Замена iV-трихлорацетатов на TV-ацетаты прошла с 89% выходом.
В работе [127] для синтеза линейных ди-, три- и тетралактозаминов использовали методику one-pot synthesis (Схема 4), которая основана на различии реакционной способности гликозилдоноров в зависимости от используемых защитных групп. Более высокая реакционная способность одного из гликозилдоноров позволяет активировать его в более мягких условиях, недостаточных для активации другого донора , который в данной реакции играет роль гликозилакцептора. В итоге, образующийся промежуточный продукт можно активировать непосредственно в реакционной смеси добавлением новой порции катализатора и гликозилировать им очередной гликозилакцептор.
В качестве гликозилдоноров использовали тиогликозиды 7V-(2,2,2-трихлорэтокси)карбонильных (TV-Тгос) производных лактозамина. Выходы двойных one-pot гликозилирований составили 35-55%, выходы на стадии удаления защитных групп - 30%, что нехарактерно для iVroc защиты [128]. Аналогичным образом был синтезирован ряд других олиголактозаминов [129-131]. Авторы отмечают, что данная стратегия синтеза имеет преимуществом то, что она минимизирует количество стадий перезащит, а также количество стадий выделения и очистки промежуточных производных, что, в свою очередь, делает данную стратегию применимой для автоматического синтеза больших олигосахаридов, дополняя стратегию твердофазного автоматического синтеза [132]. Недостатком данного подхода, на наш взгляд, является образование большого количества побочных продуктов
Например, в работе [125] показано, что для активации гликозилдоноров, содержащих бензильные группы требуется меньшее количество ТГОН, чем для гликозилдоноров, содержащих ацильные группы. схожей структуры (изомеров), что 1) уменьшает общий выход реакции; 2) значительно усложняет выделение продукта реакции, так как требует большого количества хроматографических (ВЭЖХ) очисток.
Большое количество работ посвящено синтезу фукозилированных производных олиголактозаминов, содержащих, как правило, повторяющиеся фрагменты Lex. Возможны две стратегии синтеза таких соединений [133]: 1) наращивание углеводной цепи с помощью Lex-донора; 2) синтез защищенной олиголактозаминовой цепи с последующим введением фукозы после селективного удаления защитной группы при С-3 глюкозаминового остатка.
При гликозилировании фукозилированным блоком, как и в случае синтеза нефукозилированных олиголактозаминов, чаще всего используют гликозилфториды или имидаты, а для защиты аминогруппы - JV-фталимидную группу [134-137].
Нестандартный подход для синтеза фукозосодержащих олиголактозаминов описан в работах [133, 138, 139]. В качестве гликозилдоноров использовали трихлорацетимидаты 2-азидо-2-дезоксипроизводных три- и тетрасахаридов. Парадоксальность данного подхода заключается в том, что 2-азидо-2-дезоксипроизводные известны как лучшие гликозилдоноры для синтеза 1,2-г/ис-гликозидов (в данном случае а-аномеров) аминосахаров [107]. Высокая Р-стереоселективность в данном случае достигалась за счет "нитрильного эффекта" [140], который заключается в том, что в случае проведения реакции гликозилирования трихлорацетимидатами в ацетонитриле, реакция идет по SNI механизму, и молекулы растворителя экранируют г/ис-сторону, делая таким образом предпочтительным образование даранс-гликозидов.
Изучение углеводной специфичности галектинов в составе клеточной мембраны
При синтезе линейного трилактозамина 9 дилактозаминовый фрагмент получали последовательным наращиванием по одному моносахаридному остатку, а затем использовали блок-синтез по схеме (2+4). Исходным соединением для синтеза являлось глюкозаминовое производное 52 [183]. Его гликозилированием гликозилбромидом 53, синтезированным из соответствующего Р-этилтиогликозида [184], был получен дисахарид 54 с выходом 61% при 16% возврате исходного производного 52 (Схема 12). Побочный а-аномер не выделялся. Образование рі-4-гликозидной связи подтверждается положением сигнала протона при С-4а (8 3.932 м.д.), а также характеристической величиной КССВ Уіьдь 7.9 Гц в его Н-ЯМР спектре.
Лактозаминовое производное 54 дезацетилировали, затем введением ортоэфирной защиты, ацетилированием и раскрытием ортоэфирного цикла был получен дисахарид 55 с суммарным выходом на четыре стадии 59%. Наличие ОН-группы при С-ЗЬ подтверждается сильнопольным смещением сигнала протона при С-ЗЬ (8 3.54-3.68) по сравнению с ацетилированным аналогом 54 (8 4.870 м.д.).
Гликозилированием дисахарида 55 бромидом 21 был получен трисахарид 56 с выходом 65% при 20% возврате гликозилакцептора 55. Побочный а-аномер 57 образовывался в количестве 15%. Действием цинка в смеси уксусной кислоты и уксусного ангидрида на трисахарид 56 проводили замену Тгос-защиты на TV-ацетил, и с выходом 77% получали производное 58. Образование рі-3-гликозидной связи подтверждается данными Н-ЯМР -спектроскопии (8 3.69 м.д. для протона при С-ЗЬ; J\c c 7.9 Гц). Дезацетилированием трисахарида 58, затем введением бензилиденовой защиты и ацетилированием было получено производное 59 с суммарным выходом на три стадии 70%. Бензилиденовый цикл селективно раскрывали в присутствии цианбор гидрида натрия и с выходом 91% получали трисахарид 60 с ОН-группой при С-4с и бензильной группой при С-бс, о чем свидетельствует корреляция положения сигналов протонов в спектре Н-ЯМР при С-4с (8 3.58-3.70 м.д.) и С-бс (8 3.872 и 4.027 м.д.) с положением сигналов протонов при С-4 и С-6 (8 3.70-3.81 м.д.) в соединении 52.
Гликозилированием трисахарида 60 гликозилбромидом 53 был получен тетрасахарид 61 с выходом 47% при 24% возврате исходного трисахарида 60. Образование рі-4-связи следует из данных Н-ЯМР-спектроскопии: J\A,IA 7.9 Гц, практически совпадают сигналы протонов при С-4с и С-4а (8 3.885 и 3.902 м.д.), С-5с и С-5а (8 3.50-3.60 м.д.), а также С-бс и С-ба (8 3.66-3.74 м.д.). Также был выделен побочный а-аномер 62 в количестве 2% (8 4.00-4.13 м.д. для сигнала протона при С-4с; Ju,2d 2.7 Гц). AcO AcO
Схема 12. a: AgOTf, TMM, MS-4A, CH2C12; b. MeONa/MeOH; с MeC(OEt)3, TsOH, MeCN; d. Ac20/Py; e. 80% водн. АсОН; f. Zn, AcOH, Ac20, NEt3; g. PhCH(OMe)2, TsOH, MeCN; h NaCNBH3, THF, HCl/Et20. Из побочного а-аномера 57 заменой Troc-защиты на TV-ацетил получали производное 63 с выходом 63% (Схема 13). Его гидрогенолизом с последующим ацетилированием был получен перацетат 64 с выходом 74%. Данные Н-ЯМР спектроскопии подтверждают наличие al-3-гликозидной связи: КССВ ./iC;2c 3.3 Гц, 8 3.788 м.д. для сигнала протона при С-ЗЬ. Из него дезацетилированием и удалением iV-трифторацетамидной защиты был получен трисахарид 65 с выходом 96%. уьп ОВп
Последовательным дезацетилированием, введением ортоэфирной защиты, ацетилированием и раскрытием ортоэфирного цикла (Схема 15) из дилактозаминового производного 61 с суммарным выходом на четыре стадии 48% было получено производное 68 с одной ОН-группой в терминальном галактозном остатке, о чем свидетельствует сдвиг сигнала протона при C-3d в сильное поле (8 3.708 м.д.) по сравнению с сигналом протона при C-3d в соединении 61, имеющим ацетат при C-3d (8 4.913 м.д.). Гликозилирование производного 68 гликозилбромидом 32 приводило к гексасахариду 69 с выходом 47% при 24% возврате гликозилакцептора 68. Побочный продукт (предположительно а-аномер) не выделялся, его количество по ТСХ не превышало 5% от основного продукта реакции. Заменой Troc-защиты на TV-ацетил получали производное 70 с выходом 70%. Данные Н-ЯМР спектроскопии полностью соответствуют ожидаемой структуре, в частности образование Р1-3-гликозидной связи подтверждается положением сигнала протона при C-3d (8 3.37-3.75 м.д.) и КССВ 71е,зе 8 Гц.
Гидрогенолизом производного 70 с последующим ацетилированием был получен перацетат трилактозамина 71 с выходом 80%. Его дезацетилированием и удалением iV-трифторацетамидной защиты был получен целевой трилактозамин 9 с выходом 89%. ,0_/v NHCOCF3 NHAc
Поэтому в качестве временной защиты аномерного центра остатка глюкозамина использовали триметилсилилэтильную группу. Для этого гликозилбромидом 21 гликозилировали триметилсилилэтиловый спирт (соотношение донор/акцептор 1:1.3), выход продукта 72 составлял 82% (Схема 17). При дезацетилировании производного 72 метилатом натрия в метаноле образовывалась многокомпонентная смесь продуктов из-за того, что JVroc защитная группа оказалась неустойчивой в данных условиях. Поэтому для реакции дезацетилирования производного 72 подобрали более мягкие условия, не приводящие к разрушению iVroc защитной группы: в качестве растворителя использовали смесь метанола и хлористого метилена, реакцию проводили при пониженной температуре (4С). Последовательным дезацетилированием в мягких условиях и бензилиденированием действием а,а-диметокситолуола в присутствии и-толуолсульфокислоты получали производное 73 с одной свободной гидроксильной группой при С-3 с выходом 71%. Гликозилирование соединения 73 гликозилбромидом 74, полученным из перацетата галактозы, при соотношении донор/акцептор равным 1.5:1 приводило к образованию дисахарида 75 с выходом 75%. Побочный продукт (предположительно а-аномер) не выделялся, его количество по ТСХ не превышало 5% от основного продукта реакции. Удаление бензилиденовой защитной группы и последующее ацетилирование диола давало производное 76 с выходом 89%. Данные Н-ЯМР спектроскопии подтверждают образование рі-3-гликозидной связи: сигнал протона при С-За смещен в сильное поле (8 3.863 м.д.) по сравнению с ацетилированным по С-За соединением 72 (8 5.086 м.д.), КССВ Уіьдь 8.1 Гц. Далее TMSEt-группу удаляли действием трифторуксусной кислоты в хлористом метилене, полученное 1а-ОН производное ацетилировали и хроматографией на силикагеле выделяли продукт 77 с выходом 84%, а также его Р-аномер с выходом 7%. Основной а-аномер 77 после кристаллизации был получен с выходом 72%.
Гликозилирование 3-трифторацетамидопропанола гликозилбромидом 78, полученным из соответствующего ацетата 77, при соотношении донор/акцептор 1:2, с последующей заменой Troc-защиты на TV-ацетил приводило к Р-аномеру 79 с суммарным выходом 59%; предполагаемый а-аномер не выделяли, его количество по ТСХ не превышало 5% от основного продукта реакции. Конфигурация остатка глюкозамина подтверждается характеристической величиной КССВ J\a & 8.1 Гц. Дезацетилированием и удалением iV-трифторацетамидной защиты из производного 79 был получен целевой дисахарид 10 с выходом 96%.
Изучение углеводной специфичности галектинов в составе клеточной
Все реакции проводили с использованием коммерчески доступных реагентов (Acros, Aldrich, Fluka). Растворители для гликозидного синтеза абсолютировали и хранили над молекулярными ситами; твердые реагенты высушивали в течение 2 ч в вакууме (0.1 мм рт. ст.) при 20-40С. Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинках Silica gel 60 F254 (Merck, Германия), вещества обнаруживали 5% водным раствором ортофосфорной кислоты при 150С (углеводы) или раствором нингидрина (3 г/л в смеси бутанол-уксусная кислота; 30:1, амины). Колоночную хроматографию осуществляли на силикагеле Silica gel 60 (0.040 0.063 mm, Merck, Германия), гель-фильтрацию - на колонках с Sephadex LH-20 (Pharmacia, Швеция). Растворители упаривали в вакууме при 30-40С. Для синтеза бромида 32 был использован Р-этилтио-2,3,4,6-тетра-0-ацетил-Р-О-галактопиранозил-(1 — 4)-3,6-ди-О-ацетил 2-дезокси-2-(2,2,2-трихлорэтоксикарбониламино)-Р-0-глюкопиранозид, полученный ацетилированием коммерческого Р-этилтиогликозида iVroc-замещенного лактозамина (GlycoRex, Швеция).
Оптическое вращение измеряли на цифровом поляриметре Jasco DIP-360 при 25С. Температуру плавления определяли на приборе IA 6301 (Electrothermal, Великобритания). Спектры Н-ЯМР регистрировали на приборах Bruker WM 500 МГц и Bruker WM 800 МГц при 30С; значения химических сдвигов (8, м.д.) приведены с использованием D2O (8 4.750), CDC13 (8 7.270), DMSO- f6 (8 2.500), CD3OD (8 3.500) в качестве внутренних стандартов. Отнесение сигналов в спектрах Н-ЯМР проводили с использованием техники подавления спин-спинового взаимодействия (двойной резонанс) и с помощью эксперимента 2D Н, Н COSY. При описании спектров Н-ЯМР прописная латинская буква используется для обозначения моносахаридного остатка начиная с восстанавливающего конца. В случае разветвленных олигосахаридов последовательность букв также начинается с восстанавливающего конца, затем продолжается на Р1-3-антенне, и затем на рі-6-антенне. Масс-спектры регистрировали на MALDIOF спектрометре Vision-2000 (Thermo Bioanalysis Corp., Великобритания), в качестве матрицы использовали дигидроксибензойную кислоту.
Ацетилирование (общая методика) проводили, растворяя исходное соединение в смеси АсгО-Ру (1:2, 1 мл смеси на 0.05-0.15 ммоль) и выдерживая реакционную смесь в течение 12-24 ч при комнатной температуре, реагенты соупаривали с толуолом. Гидрогенолиз (общая методика) проводили над 10% Pd/C (Merck, Германия) в весовом отношении 2:1 субстрата к катализатору в метиловом спирте или смеси метилового спирта с водой (1:1) при атмосферном давлении в течение 3 часов.
Получение гликозилбромидов 21, 74 и 78 (общая методика): к раствору перацетата галактозы, Troc-производного глюкозамина или Lec (0.21 ммоль) в 2 мл сухого дихлорметана и 0.5 мл уксусной кислоты добавляли 0.25 мл (3.4 ммоль) бромистого ацетила, охлаждали до 0С и добавляли 0.13 мл (3.2 ммоль) метилового спирта; реакционную смесь выдерживали 1 час при комнатной температуре и выливали в лед, органический слой разбавляли хлороформом и промывали последовательно водой, насыщенным раствором бикарбоната натрия, водой, фильтровали через слой ваты, упаривали, соупаривали с толуолом и без дополнительной очистки в тот же день использовали в реакциях гликозилирования, считая выход бромида количественным.
Получение гликозилбромидов 32 и 53 (общая методика): раствор 270 мг (0.33 ммоль) соответствующего Р-этилтиогликозида в 10 мл сухого дихлорметана охлаждали до 0С и добавляли 18 мкл (0.37 ммоль) брома. Реакционную смесь выдерживали 1 ч при 0С, упаривали, соупаривали с толуолом и без дополнительной очистки в тот же день использовали в реакциях гликозилирования, считая выход бромида количественным.
Гликозилирование (общая методика): смесь гликозилакцептора (0.1 ммоль), трифлата серебра (0.2 ммоль), тетраметилмочевины (0.2 ммоль) и 300 мг свежепрокаленных молекулярных сит 4А в 5 мл сухого дихлорметана при комнатной температуре перемешивали 30 минут в темноте, добавляли еще 100 мг сит 4А и раствор гликозилбромида (0.2 ммоль) в 2 мл дихлорметана и перемешивали 15-20 ч. Затем реакционную смесь фильтровали, фильтрат концентрировали в вакууме и выделяли продукт реакции хроматографией на силикагеле.
Удаление Troc-группы и JV-ацетилирование (общая методика) проводили добавлением к раствору 0.5 ммоль Troc-производного в 40 мл уксусной кислоты и 2 мл уксусного ангидрида 4 г свежеактивированной цинковой пыли и затем 0.5 мл триэтиламина; через 20-30 ч реакционную смесь фильтровали, фильтрат упаривали, остаток хроматографировали на колонке с LH-20 (CHCI3-CH3OH, 1:1) и выделяли продукт реакции хроматографией на силикагеле.
Дез-О-ацетилирование (общая методика) проводили по Земплену в сухом метиловом спирте, добавляя к раствору ацетилпроизводного 2 М метилат натрия в метиловом спирте до рН 8-9; по окончании реакции ионы Na+ удаляли катионитом DOWEX 50Х-400 (Н+) (Acros, Бельгия) и раствор упаривали.
Дез-О-ацетилирование и удаление JV-трифторацетамидной защиты (общая методика) проводили добавлением 50 мкл 2 М раствора метилата натрия в метиловом спирте к раствору 0.05 ммоль защищенного соединения в 2 мл сухого метилового спирта; через 1 час раствор упаривали, добавляли 2 мл воды, через 6 часов хроматографировали на колонке с катионитом DOWEX-H (элюция 1 М водным раствором аммиака), раствор упаривали и лиофилизовали.
2-Трифторацетамидоэтил-Р-Б-галактопиранозил-(1— 4)-2-ацетамидо-2-дезокси-р-D-глюкопиранозид 16. 4.82 г (10.67 ммоль) азида 15 растворяли в 150 мл смеси метилового спирта с водой (1:1) и подвергали гидрогенолизу над 2.4 г 10% Pd/C. Через 1.5 часа реакционную смесь фильтровали, к фильтрату добавляли 35 мл катионообменной смолы DOWEX в Н+-форме. DOWEX отфильтровывали, промывали 4x20 мл смесью метилового спирта с водой (1:1). Продукт элюировали 1 М водным раствором аммиака, упаривали и получали 3.77 г (8.85 ммоль) 2-аминоэтилгликозида iV-ацетиллактозамина, Rf 0.60 (EtOH-Н20-Ру-АсОН, 3:1:1:1). К нему добавляли 150 мл сухого метилового спирта, 6 мл метилтрифторацетата, 2 мл триэтиламина, и перемешивали 2.5 часа до отрицательной пробы на амин. К реакционной смеси добавляли 50 мл сухого метилового спирта, затем DOWEX в Н -форме до нейтральной реакции среды. Раствор фильтровали и упаривали. Гель-фильтрацией на LH-20 (элюция 0.5% водным раствором уксусной кислоты) выделяли 3.91 г продукта 16 (70% на две стадии), R{ 0.89 (ЕЮН-Н20-Ру-АсОН, 3:1:1:1), R{ 0.40 (/-PrOH-EtOH-H20, 2:3:1), [ab-15.8 (c 1, H20). MS, m/z: 545 (522+23) (A/+Na+).