Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 7
1.1. Гликозиды, выделенные из растений рода Panax 7
1.1.1 Гликозиды тетрациклических спиртов ряда даммарана, выделенные из растений рода Panax 7
1.1.2 Гликозиды пентациклического тритерпеноида, олеаноловой кислоты, выделенные из растений рода Panax 38
1.1.3 Гликозиды стеринов, выделенные из растений рода Panax 43
1.2. Тритерпеновые гликозиды, выделенные из женьшеня Panax ginseng С. А. Меу. и биомассы клеточной культуры, полученной на его основе 45
1.2.1 Тритерпеновые гликозиды, вьщеленные из корней Panax ginseng С. А. Меу 45
1.2.2 Тритерпеновые гликозиды, выделенные из надземной части растений Panax ginseng С. А. Меу 48
1.2.3 Тритерпеновые гликозиды, выделенные из биомассы клеточной культуры, полученной на основе Panax ginseng С. А. Меу .". 51
1.3 Вещества негликозидной природы, выделенные из корней женьшеня Panax ginseng С. А. Меу 53
1.4. Методы выделения и установления структуры тритерпеновых гликозидов женьшеня 56
1.5 .Методы качественного и количественного определения тритерпеновых гликозидов женьшеня 58
1.6. Полусинтетические аналоги гликозидов женьшеня 60
1.7. Биологическая активность тритерпеновых гликозидов женьшеня 61
2. Обсуждение результатов 62
2.1. Сравнительное исследование гинзенозидов в корнях дикорастущего и культивируемого в Приморском крае женьшеня Panax ginseng С. А. Меу. 62
2.1.1 Вьщеление и идентификация тритерпеновых гликозидов, содержащихся в товарных корнях культивируемого женьшеня Panax ginseng С. А. Меу 62
2.1.2 Количественный анализ нейтральных гликозидов тетрациклических тритерпеновых спиртов даммаранового ряда методом ВЭЖХ 68
2.1.3 Сравнительное изучение содержания гинзенозидов в дикорастущих корнях Panax ginseng С. А. Меу., собранных в Приморье 71
2.1.4 Сравнительное изучение содержания гинзенозидов в корнях женьшеня Panax ginseng С. А. Меу., культивируемого в Приморье 76
2.2. Гинзенозиды надземной части женьшеня, культивируемого в Приморье 86
2.3. Гинзенозиды биомассы культуры клеток женьшеня 89
2.3.1 Гинзенозиды культуры клеток Panax ginseng различных линий 89
2.3.2 Динамика накопления гинзенозидов в каллусной культуре (линия Д-25), полученной в АО БИОМАШ на основе корней культивируемого приморского женьшеня 92
2.3.3 Содержание гинзенозидов в различных клеточных линиях Panax ginseng С. А. Меу., полученных в БПИ ДВО РАН 94
3. Экспериментальная часть 98
Выводы 104
Литература 106
- Гликозиды тетрациклических спиртов ряда даммарана, выделенные из растений рода Panax
- Вьщеление и идентификация тритерпеновых гликозидов, содержащихся в товарных корнях культивируемого женьшеня Panax ginseng С. А. Меу
- Сравнительное изучение содержания гинзенозидов в корнях женьшеня Panax ginseng С. А. Меу., культивируемого в Приморье
- Содержание гинзенозидов в различных клеточных линиях Panax ginseng С. А. Меу., полученных в БПИ ДВО РАН
Гликозиды тетрациклических спиртов ряда даммарана, выделенные из растений рода Panax
Началом химического исследования женьшеня считают 1854 год, когда американский химик Гаррикс С. (Garriques S.S.) впервые сообщил о выделении из Panax quinque folium L. аморфного вещества, которое назвал «сапонин - панаквилон» [2]. Название «сапонин» происходит от латинского слова sapo-ыьто, так называют вещества из растений, водные растворы которых образуют стойкую мыльную пену. Они обладают гемолитической активностью и являются ядами для животных, дышащих жабрами [20]. Интерес химиков именно к этому классу соединений был вызван, в какой-то мере, легкостью их обнаружения. Ведь достаточно было встряхнуть водные растворы таких веществ и образовавшаяся устойчивая пена указывала на наличие сапонинов и чем дольше она не разрушалась, тем выше была концентрация этих веществ в растворе. Такая необычайная легкость обнаружения сапонинов и, одновременно, трудность выделения и установления структуры таких сложных соединений способами, существовавшими в то время, долгие годы не давали покоя ученым, побуждая вновь и вновь пытаться разгадать тайну химических веществ, определяющих целительную силу женьшеня [2]. Шестидесятые годы 20-го века стали тем рубежом, когда накопленная информация по химии сапонинов женьшеня, опираясь на достижения в области развития методов выделения природных соединений и установления их молекулярной структуры, позволила добиться значительных успехов в решении этой проблемы. В 1962 году российские ученые Еляков Г.Б. и Стригина Л.И. сообщают о выделении из корней Panax ginseng С. А. Меу. первого нейтрального сапонина - панаксозида А и устанавливают строение его углеводной составляющей [8, 9], а японские химики Шибата Ш. и др. (Shibata Sh.), подвергнув кислотному гидролизу сумму нейтральных сапонинов женьшеня, выделяют сапогенин - панаксадиол 1 и определяют его природу [21]. Позже Еляков Г.Б. и др. сообщат о выделении еще одного сапогенина - панаксатриола 2, который по структуре был подобен панаксадиолу, но имел на одну гидроксильную группу больше [10]. Дальнейшие исследования показали, что панаксадиол 1 и панаксатриол 2 являются артефактными сапогенинами [22] и образуются в условиях кислотного гидролиза сапонинов. При этом происходит изменение конфигурации асимметрического центра С-20 и циклизация боковой цепи нативного тритерпенового спирта [23-25]. Поэтому для получения нативных сапогенинов гликозидов женьшеня многие авторы стали предпочтительно использовать ферментативный гидролиз [26, 27]. Нативные сапогенины получили названия протопанаксадиол 3 и протопанаксатриол 4, в которых приставка «прото» подчеркивала их первоначальность и, одновременно, структурное родство [22, 28] (рис. 1).
Сапогенины 3 и 4 являются тетрациклическими тритерпеноидами ряда даммарана. Впервые даммарановые тритерпеноиды, даммарендиол-1 5 и даммарендиол-II 6, были выделены из резиноподобной смолы (даммары) индонезийских деревьев сем. Depterocarpaceae. Наличие тетрациклической структуры у 5 и 6 позволило Физер Л. и Физер М. (Fieser L.F., Fieser М.) отнести их к группе метилстеринов [29]. Позже немецкие химики Фишер Ф. и Зейлер Н. (Fisher F., Seiler N.) выделили другие даммарановые тритерпеноиды - бетулафолиентриол 7 и бетулафолиентетраол 8 из листьев белой березы Betula alba L. и показали, что их структуры близки к даммарендиолам 5 и 6 [30, 31] (рис. 2).
Наличие общего скелета при минимальных структурных различиях у тритерпе-ноидов 3, 4 и 5, 6, 7 облегчило, на том этапе исследования, задачу установления строения агликонов гликозидов женьшеня. В ходе структурных исследований даммара-новых тритерпеноидов, выделенных из разных источников, было доказано, что протопанаксадиол 3 и протопанаксатриол 4 являются гидроксипроизводными даммарендиола-П и имеют ( -конфигурацию хирального центра С-20 [32, 33].
Тритерпеновые гликозиды, впервые выделенные из корней женьшеня {Panax ginseng C.A.Meyer), российские ученые назвали панаксозидами [10], а японские -гинзенозидами [28] (рис. 3).
К настоящему времени из растений различных видов рода Panax выделено и идентифицировано более 130 тритерпеновых гликозидов. И все эти соединения кроме полного систематического названия имеют короткое тривиальное. Например, гликозид с систематическим названием 3(3,6а,12р,20(8)-тетрагидроксидаммар-24-ен-6-О-Р-В-глюкопиранозил-20-О-3-В-глюкопиранозид называют гинзенозидом-Rgi (ginsenoside-Rgi) либо панаксозидом А. Как правило, в таких названиях закладываются определенные принципы. Например, японские ученые Шибата Ш. и flp.(Shibata S.) еще в 60-е годы для названий гликозидов, выделенных из женьшеня, стали использовать видовое определение растения, к которому добавляли заглавную латинскую букву (R -radix, корень, F - folium, лист ), указывающую, из какой части растения выделен данный гликозид, и подстрочную прописную букву либо аббревиатуру, состоящую из букв и цифр, определяющих положение соответствующего пятна гликозида на ТСХ пластинке (от «а» - полярных соединений до «h» - неполярных) [28]. Исходя из этого, можно сказать, что название ginsenoside-Rg указывает, что такой гликозид впервые выделен из женьшеня Panax ginseng С.А.Меу. (ginsenoside); «R» - означает, что использовались корни, a «gi», прописная буква и цифра, определяют положение пятна одного из неполярных, судя по букве «g», гликозидов на ТСХ пластинках. В краткой форме это записывалось: G-Rgi или (только для гинзенозидов) Rgi. В дальнейшем эти принципы стали использовать многие авторы, присваивая подобным образом тривиальные названия вновь выделенным гликозидам из различных видов женьшеня и называя их псевдогинзенозидами (pseudoginsenoside от P. pseudo-ginseng), нотогинзено-зидами (notoginsenoside от P. notoginseng), квинквинозидами (quinquenoside от Р. quinquefolium), вина-гинзенозидами (vina-ginsenoside от Vina-Ginseng - аглийского названия P. vietnamensis) и чикусетсусапонинами (chikusetsusaponin от Cikusetsu-Ninjin - японского названия P. japonicus). В русскоязычной литературе для гликозидов женьшеня существует название - панаксозиды, предложенное российскими учеными под руководством ЕляковаГ.Б. [8]. Семь основных гликозидов, впервые выделенных из корней женьшеня, получили название - панаксозиды A-G, причем индексация велась от неполярных (А) до полярных (G) соединений [10]. В 1971 году, когда была полностью выяснена структура даммаранового гликозида Rgi, выделенного из корней корейского Panax ginseng С.А.Меу., было проведено его прямое сравнение с близким по структуре панаксозидом А, выделенным российскими учеными из корней приморского женьшеня. Результаты показали полную идентичность этих гликозидов [34]. Позже структура панаксозида А была подтверждена и рентгеноструктурными исследованиями [35]. К сожалению, это был единственный, из опубликованных в литературе, пример прямого сравнения панаксозидов и гинзенозидов. Соотнесения остальных панаксозидов с гинзенозидами были сделаны нами уже в ходе выполнения настоящей работы [36] (рис. 3). Следует отметить, что различные тривиальные названия гликозидов женьшеня, первоначально опубликованные в литературе, после уточнения структуры и выяснения дублирующих названий в последующих публикациях сводятся, как правило, к единственному окончательному варианту и очень редко даются в нескольких вариантах. Например, в 1973 году Ким Дж. и Стаба Е. (Kim J.Y., Staba E.J.) сообщили о выделении некоторых сапонинов из корней P. quinquefolium L., которые назвали панквилинами (panquilins A-G) [37]. Позже они выяснили, что эти гликозиды идентичны по структуре гинзенозидам-Rb-g, выделенным ранее из Panax ginseng С.А. Mey., о чем сообщили в докладе на симпозиуме по женьшеню в Корее [38]. В 1980 году Вей Дж. и др. (Wei J.X.) выделили шесть гликозидов из P. notoginseng (Burk.) F.H.Chen и назвали их санчинозидами Сі, Сз, Di, D3, Ei и Е2 (sanchinoside). При этом они показали, что два из них, Сі и Еь идентичны гинзенозидам-Rgi и -Rbi соответственно [39]. А в дальнейшем, после установления структуры остальных гликозидов, санчинозиды стали называть уже нотогинзенозидами (notoginsenoside) [40].
У всех гликозидов, выделенных из растений рода Panax, углеводные компоненты присоединены по одной или по двум гидроксильным группам тритерпенового агликона. По аналогии с гликозидами олеаноловой кислоты даммарановые гликозиды, имеющие углеводную часть, связанную с одной гидроксильной группой агликона, называют - монодесмозидами, а с двумя - бисдесмозидами [41], поэтому названия моно-, ди-, три- и т.д. гликозиды в дальнейшем будут использоваться, чтобы указать количество моносахаридных остатков в составе тритерпеновых гликозидов. Следует добавить, что углеводные цепи даммарановых гликозидов, выделенных из растений рода Panax, состоят из моносахаридных остатков гексоз, D-глюкозы (D-глюкопирано-зы) и L-рамнозы (L-рамнопиранозы) и пентоз, L-арабинозы (L-арабинопиранозы или L-арабинофуранозы) и D-ксилозы (D-ксилопиранозы). Причем остаток L-рамнозы содержат только гликозиды протопанаксатриола 4, а остаток L-арабинофуранозы -только гликозиды протопанаксадиола 3.
Вьщеление и идентификация тритерпеновых гликозидов, содержащихся в товарных корнях культивируемого женьшеня Panax ginseng С. А. Меу
Для выполнения аналитических исследований корней женьшеня необходимо было иметь набор индивидуальных гинзенозидов в качестве образцов-стандартов. Поскольку корни дикорастущего женьшеня из-за своей труднодоступности не могли быть источником их получения, то для этого мы использовали корни плантационного женьшеня Panax ginseng С. А. Меу., выращенного на плантациях в хозяйстве «Женьшень» (с. Староварваровка, Анучинский район, Приморский край). Товарный женьшень представлял собой разрезанные вдоль и высушенные на воздухе корни. Воздушно-сухие корни женьшеня (1.96 кг), измельченные в порошок, исчерпывающе экстрагировали метанолом при комнатной температуре и экстракты упаривали при пониженном давлении. Полученный сухой остаток растворяли в минимальном количестве воды и последовательно обрабатывали н-пентаном и н-бутанолом, насыщенным водой. Бутанольный экстракт, дополнительно промытый небольшим объемом воды, упаривали и высушивали до постоянного веса. Получали сухой остаток экстрактивных веществ, суммарную гликозидную фракцию (СГФ) (97.4 г). Из СГФ многократной колоночной хроматографией на силикагеле и гидрофобном сорбенте "Полихром-1" были выделены основные гликозиды, гинзенозиды -Rbi 9, -Re 10, -Rb2 11, -Rgi 13, -Re 15, -Rf 16 и -Ro 134, и минорные гликозиды, гинзенозид-Rd 12, HOToraH3eH03Hfl-R2 56 (NG-R2) и зингиброзид-Ri 145 (Z-Ri), а также метиловые эфиры гинзенозида-Ro 141 и зингиброзида-Ri 189 [102].
Структуры тритерпеновых гликозидов, выделенных из культивируемого женьшеня Рапах ginseng С. А. Меу., изображены на рис. 25.
Чтобы отделить даммарановые гликозиды 9-11, которые элюировались как примеси в полярных фракциях при использовании колоночной хроматографии на силикагеле, от гликозидов олеаноловой кислоты 134, 141, 145 и 189, был применен гидрофобный сорбент "Полихром-1". Смесь гликозидов 134 и 145, а также их метиловых эфиров 141 и 189 в дальнейшем удалось разделить на колонке, заполненной кремневой кислотой. Индивидуальные гликозиды были получены в виде хроматографически однородных белых порошков после их высаждения ацетоном из метанольного раствора. Все гинзенозиды были высушены до постоянного веса при пониженном давлении. Лишь гинзенозид-Re 15 удалось получить в виде бесцветных кристаллов после перекристаллизации из водного метанола. Содержание гинзенозидов в суммарной гликозидной фракции было следующим: Rbi 9 - 8.10 г, Rgi 13 - 2.70 г, Re 15 - 2.55 г, Re 10 - 1.20 г, Rb2 11 - 0.98 г, Ro 134 - 0.74 г, Rf 16 - 0.59 г, Z-Ri 145 -0.19 г, NG-R2 56 - 0.06 г и Rd 12 - 0.03 г, что в сумме составило 17.14 г (17.6% от веса СГФ) [102].
Идентификацию гинзенозидов, выделенных из корней женьшеня, проводили на основе полученных нами данных ИК-, ЯМР !Н - и 13С -спектроскопии и масс-спектрометрии, а также данных, опубликованных в литературе [1, 74,160, 161]. Данные ЯМР 13С-спектров полученных тритерпеновых гликозидов приведены в таблицах 4-6.
Гинзенозиды 9-13, 15, 16 и 134 ранее были выделены из корней Panax ginseng С. А. Меу., выращенных на плантациях в Корее и Японии [35, 54, 75]. Следует отметить, что HOTorHH3eH03Hfl-R2 56, зингиброзид-Ri 145 и его метиловый эфир 189, а также метиловый эфир гинзенозида-Ro 141 были выделены из корней P. ginseng С. А. Меу. впервые [102]. Гликозид 145, монодесмозид олеаноловой кислоты, был впервые обнаружен в корнях дикорастущего P. zingiberensis Wu et Feng, обитающего на юге Китая [97]. О присутствии метилового эфира гинзенозида-Ro 141 в корневищах подвидов P. pseudoginseng, где его содержание незначительно, также сообщалось ранее [67]. Метиловые эфиры 141 и 189 гликозидов олеаноловой кислоты образованы по карбоксильной группе глюкуроновой кислоты углеводной компоненты этих гликозидов. HoTorHH3eH03Hfl-R2 56, монодесмозид протопанаксатриола 4, впервые обнаружен в корнях культивируемого в Китае женьшеня P. notoginseng (Burk.) F. Н. Chen (0.04%) [40].
Из пентановой фракции экстрактивных веществ корней культивируемого женьшеня методом колоночной хроматографии были выделены: смесь жирных кислот -14:0, 14:1, 16:0, 16:1, 16:3, 17:0, 18:0, 18:1, 20:0, 20:2 и 22:4, р-ситостерин 148, смесь сложных эфиров (3-ситостерина, даукостерин 147 и смесь ацильных производных даукостерина 149 и 152 [187].
Тритерпеновые гликозиды, выделенные нами из товарных корней приморского культивируемого женьшеня, в дальнейшем были использованы как образцы-стандарты для исследования качественного состава и количественного содержания гинзенозидов в различных образцах дикорастущего и культивируемого женьшеня и его клеточной культуры. Для разработки методики определения количественного содержания тритерпеновых гликозидов женьшеня в смесях с помощью отечественного жидкостного хроматографа «Милихром» мы использовали гликозиды тритерпеноидов ряда даммарана, гинзенозиды -Rbi 9, -Re 10, -Rb2 11, -Rd 12, -Rgi 13, -Re 15, -Rf 16 и нотогинзенозид-&2 56. Известно, что raH3eH03Hfl-Rg2 14, как минорный компонент, присутствует в корнях P. ginseng С. А. Меу. (0.03%), выращенных на плантациях в Корее и Японии [75]. Тем не менее, выделить его из товарных корней женьшеня, выращенного в Приморье, нам не удалось. Поэтому для увеличения коллекции гинзенозидов, необходимых для дальнейших исследований, niH3eH03Hn;-Rg2 14 получили щелочным гидролизом гинзенозида-Re 15 по методике [188]. Поскольку данная методика бьша предложена как способ получения нативных сапогенинов, то для повышения выхода целевого гликозида 14 щелочной гидролиз не доводили до полного расщепления исходного гликозида 15. Контроль за ходом реакции проводили с помощью ТСХ. В результате проведенного частичного гидролиза из реакционной смеси был выделены гинзенозиды-Rgi 13 , -Rg2 14, а также смесь гинзенозидов-Rhi 54 и -Fi 53, которую не удалось далее разделить. Выход гликозида 14 составил около 6%, а возврат исходного гликозида 15 - 28.5% (рис. 26) [189].
Сравнительное изучение содержания гинзенозидов в корнях женьшеня Panax ginseng С. А. Меу., культивируемого в Приморье
В Приморье корни женьшеня культивируют на различных плантациях практически во всех 24-х районах края. Это плантации, на которых выращивают от нескольких десятков килограммов до нескольких тонн корня женьшеня в год. Используя методику определения количественного содержание девяти гинзенозидов (9-16 и 56), описанную в главе 2.1.2., мы проанализировали образцы корней женьшеня, культивируемого в 14-ти районах Приморья на 44-х небольших, в основном, плантациях [191]. Часть корней, согласно предварительным опросам, была выращена из семян дикорастущего женьшеня, собранного в уссурийской тайге. Корни культивируемого женьшеня, любезно предоставленные женыденеводами Приморского края, имели вес от 12.0 до 41.0 г и возраст 5-6 лет. Содержание гинзенозидов (мг на г веса сухого корня) рассчитывали как среднее арифметическое значение результатов трех анализов, выполненных для каждого образца. Для сравнительного анализа количественного содержания гинзенозидов в корнях женьшеня использовали индексы «А», «В» и «С», описанные в главе 2.1.3. Полученные результаты представлены в таблице 8.
Анализ полученных данных свидетельствует о том, что корни культивируемого и дикорастущего женьшеня Приморского края содержат одинаковый набор гинзенозидов (рис. 33). Общее содержание гинзенозидов в культивируемых корнях в зависимости от года и места сбора варьирует от 6.45 до 42.34 мг/г сухого веса корня, то есть, как и в случае дикорастущих корней, наблюдается большой разброс по их количественному содержанию. Анализ величин индексов «В» и «С» показывает, что корни культивируемого в Приморье женьшеня по сравнению с дикорастущими продуцируют, по относительному содержанию, несколько больше минорных гинзенозидов в каждой группе, особенно гинзенозида-Rd (индекс «С»). Исследования, проведенные в один и тот же год на разных плантациях Партизанского района, показывают, что, несмотря на различия в суммарном количестве гинзенозидов в образцах корней женьшеня, большинство образцов имеют близкие значения индексов «А», «В» и «С» и при этом содержание гинзенозидов группы Rb в образцах корней больше, чем содержание гинзенозидов группы Rg (индекс «А»). В группе гликозидов протопанаксатриола (группа Rg) содержание гинзенозида-Re 15, в большинстве случаев, выше содержания гинзенозида-Rgi 13. Содержание двух минорных гликози-дов Rg2 14 и NG-R2 56 почти равно и составляет 0.3-0.8 мг/г. Количественное содержание гинзенозидов в корнях женьшеня из этого района убывает в такой последовательности: Rbi Re = Rb2 = Rc Rgi Rf Rd NG-R2 = Rg2
В отличие от количественного распределения гинзенозидов в корнях дикорастущего женьшеня из этого района, гинзенозид-Rgi 13 в таком ряду занимает уже не 2-ю, а 5-ю позицию. Совпадение величин индексов «А», «В» и «С», а также количественное преобладание гинзенозида-Re 15 в группе Rg может указывать на идентичность посевного материала. Это предположение было подтверждено последующим опросом поставщиков корней женьшеня.
Необходимо отметить, что гинзенозиды -Rbi 9 и -Rgi 13 часто являются «главными» по количественному содержанию в группах гликозидов протопанаксадиола 3 и протопанаксатриола 4 соответственно. Чтобы оценить долю каждого гинзенозида в сравнении с «главными» гинзенозидами, мы решили проанализировать отношение количественного содержания остальных гинзенозидов в группах Rb и Rg к содержанию «главных» гликозидов 9 и 13 в каждой группе отдельно. Полученные результаты, рассчитанные как отношение количественного содержания отдельных гинзенозидов-Rc 10, -Rb211 и -Rd 12 (Rxi) к содержанию гинзенозида-Rbi 9 [Rxi]/[Rbi] и отношение количественного содержания отдельных raH3eH03 i;oB-Rg2 14, -Re 15, -Rf 16 и NG-R2 56 (Rx2) к содержанию гинзенозида-Rgi 13 [Rx2]/[Rgi], дали представление о распределении относительного содержания гинзенозидов в каждой группе, что было представлено в виде графиков (рис. 34, 35).
Надо отметить, что результаты, представленные в виде графиков и диаграмм, часто используются для сравнения количественного содержания тритерпеновых гликозидов в различных образцах женьшеня [194]. Интересный графический анализ был использован Решетняк О.В. для сравнения различных лекарственных форм на основе женьшеня [196].
Распределение относительного содержания гинзенозидов в группах Rg и Rb для корней женьшеня из различных районов Приморского края в графической форме выглядит следующим образом (рис. 34 б,в и 35 а-в). Исходя из полученных графиков, можно сказать, что корни культивируемого женьшеня имеют свои особенности в каждом районе Приморского края. Например, часть корней культивируемого женьшеня из Дальнегорского района и корни из Партизанского района имеют близкое распределение относительного содержания гинзенозидов в группах Rg и Rb. И если одинаковое распределение относительного содержания гинзенозидов в группах в корнях женьшеня из Партизанского района, согласно опросам, связано с использованием одного и того же посевного материала, то, вероятно, такие же семена были использованы и на некоторых плантациях в Дальнегорском районе. Схожесть по распределению относительного содержания гинзенозидов в группах Rg и Rb можно отметить также для корней женьшеня, культивируемого в Шкотовском, Анучинском и Дальнегорском районах.
Такая однородность распределения относительного содержания гинзенозидов в корнях культивируемого женьшеня показывает, что продуцирование даммарановых гликозидов в каждой из групп происходит в определенном соотношении к «главному» из гинзенозидов этой группы. При этом схожесть сохраняется даже при несовпадении величин сравнительного индекса «А», то есть не зависит от суммарного количества гликозидов в группах Rg и Rb.
Анализ полученных результатов относительного распределения содержания гинзенозидов в корнях культивируемого P. ginseng С. А. Меу. Приморского края позволяет выделить два типа корней женьшеня. В первом типе количественное содержание гинзенозидов в корнях женьшеня убывает в каждой группе гликозидов следующим образом: в группе Rg - Rgi Re Rf NG-R2= Rg2, а в группе Rb - Rbi Rb2= Rc Rd. К этому типу относятся практически все корни, выращенные на плантациях Шкотовского района (рис. 34 б), и, частично, Анучинского и Дальнегорского районов (рис. 34 а и 35 6). Для второго типа корней женьшеня наблюдается следующее изменение количественного содержания гинзенозидов: в группе Rg - Re Rgi Rf NG-R2= Rg2, а в группе Rb - Rbi= Rb2 = Rc Rd. Второй тип отличается от первого тем, что тетрагликозиды 9-11 в группе Rb имеют в нем почти одинаковое количественное содержание, а содержание гинзенозида-Re 15 превышает или равняется содержанию гинзенозида-Rgi 13 в группе Rg. Для этого типа показательны корни женьшеня, выращенные в Партизанском районе (рис. 35 в), а также частично в других районах Приморья.
Проанализировав подобным образом данные для корней дикорастущего женьшеня, мы обнаружили, что эти корни имеют такое же распределение относительного содержания гинзенозидов в группах Rg и Rb, как и культивируемые корни, и при этом также можно выделить два типа корней по распределению гинзенозидов. Исходя из этого, можно сказать, что плантационные корни, как и дикорастущие, различаются по способности продуцирования даммарановых гинзенозидов, что сказывается на содержании индивидуальных гликозидов. Это, возможно, является результатом неоднородности популяции приморского женьшеня.
Можно также заметить, что графики относительного распределения гинзенозидов в плантационных корнях из Анучинского и Шкотовского районов наиболее близки к графикам их распределения в корнях дикорастущего женьшеня из Анучинского района.
В суммарной гликозидной фракции образцов корней плантационного женьшеня Приморья в качестве минорных компонентов почти всегда обнаруживаются три гликозида, гинзенозиды-1 2 14, -Rf 16 и NG-R2 56, являющиеся монодесмозидами протопанаксатриола 4 по гидроксильной группе при С-6. Эти гликозиды в качестве углеводной компоненты имеют остатки разных 1,2-дисахаридов: -Glc2-»Glc, -Glc2-»Rha и -Glc2-»Xyl соответственно (рис. 36).
Гликозиды 14 и 56 в корнях приморской популяции Panax ginseng С. А. Меу. присутствуют примерно в одинаковой концентрации, а некоторые экземпляры корней приморского женьшеня содержат только гликозид 56. HoTornH3eH03Hfl-R2 56 ранее был обнаружен в корнях Panax notoginseng (Burk.) F. M. Chen в концентрации -0.03%.
Проанализировав корни плантационного женьшеня, семена которого были получены из КНДР, а также корни, купленные в Китае, мы обнаружили, что, среди минорных гликозидов присутствуют только 14 и 16 (табл. 8). Когда же из корней приморского плантационного женьшеня был получен новый штамм культуры клеток, то среди минорных компонентов мы обнаружили все три гликозида 14,16 и 56 [197].
Этот факт говорит о некоторой обособленности приморского культивируемого и дикорастущего женьшеня.
Интересно, что исследования популяционно-генетической структуры женьшеня на обширной территории современного ареала его обитания в Приморье, выполненные в БПИ ДВО РАН, показали, что современные популяции приморского женьшеня различаются между собой [198]. Мы полагаем, что выяснение процессов продуцирования гинзенозидов в зависимости от популяционной принадлежности корней приморского женьшеня требует дальнейших комплексных исследований.
Содержание гинзенозидов в различных клеточных линиях Panax ginseng С. А. Меу., полученных в БПИ ДВО РАН
Было исследовано 22 каллусных линии женьшеня в течение года, начиная с 24-го пассажа. Из них 18 линий показали стабильный рост и продуцирование гинзенозидов в течение всего периода наблюдения [195, 204]. Все исследованные культуры можно объединить в 4 группы линий: а) - быстрорастущие с высоким содержанием гликозидов; б) - быстрорастущие с низким содержанием гинзенозидов; в) - медленнорастущие, высокопродуктивные по гликозидам и г) - медленнорастущие с низким содержанием гинзенозидов.
Четыре линии показали нестабильный характер продуцирования и нестабильный ростовой показатель. При этом ни одна из 22-х линий культур клеток не потеряла способность к биосинтезу гинзенозидов. Не отмечалось также тенденции существенного уменьшения содержания даммарановых гликозидов в течение длительного периода [195, 204]. Все культуры продуцировали исследуемые гинзенозиды, при этом наблюдалось преобладание содержания гинзенозидов-Rbi 9, -Rgi 13 и -Re 15. Гинзенозиды-Rc 10, -Rg214, -Rf 16 и NG-R2 56 продуцировались в значительно меньших количествах.
Общее содержание гинзенозидов в биомассе различных линий каллусов колебалось от 0.64 до 15.20 мг/г сухой биомассы каллусов. Каллусные линии, полученные из различных частей женьшеня, продуцировали биомассу с примерно одинаковым составом гинзенозидов (табл. 11, рис. 40).
Анализ содержания гинзенозидов в образцах биомассы, продуцируемой большинством полученных каллусных линий женьшеня, показал, что они имеют близкие значения индекса «А» (0.10-0.30), а его величина указывает на значительное преобладание гинзенозидов группы Rg. Индекс «С», рассчитанный для различных образцов клеточных линий, имеет почти одинаковое значение, что указывает на стабильность процесса продуцирования гинзенозидов клеточной культурой (табл. 11). Перспективная каллусная линия R-1 защищена российским патентом [205] (рис. 40).
Различия в продуктивности серий зависили от сезона, в котором инициировали каллусогенез, количества полученных линий и длительности пассивирования. Каллусные культуры также подвержены сезонному колебанию состава и содержания гинзенозидов, как и природный корень женьшеня. Выяснилось, что культивируемые клетки имеют способность увеличивать либо уменьшать содержание отдельных гинзенозидов в зависимости от конкретных условий получения и культивирования, что дает возможность получать биомассу женьшеня для наработки отдельных гинзенозидов [204].
Исследование влияния фитогормонов на количественное содержание гинзенозидов в биомассе каллусных линий R-1 и 1с показало, что ауксиноподобные фитогормоны и цитокинины оказывают воздействие на биосинтез гинзенозидов, увеличивая их количественное содержание [206].
В процессе культивирования клеток и тканей растений в условиях in vitro возникает генетическая изменчивость, обнаруженная у многих видов растений. Исследования генетической изменчивости каллусных линий женьшеня Panax ginseng, выполненные в БПИ ДВО РАН, показали, что культура ткани женьшеня сохраняет генетические особенности исходного вида в течение длительного периода времени [207], что, вероятно, и определяет отмеченную выше стабильность продуцирования гинзенозидов клеточными культурами.
Необходимо отметить, что в одной из двух каллусных культур женьшеня {P. ginseng), полученных Чой К.Т. и др.(СЬоі К.Т.) (Корея), основными гинзенозидами были Rgi 13 и Rg2 14, затем в меньшей концентрации - Rbi 9 и Re 15 и минорными гинзенозидами были Rb2 11 и Rd 12 , а в другой - основными были 9, 11 и 15. О присутствии нотогинзенозида R2 56 авторы не сообщают, но при этом отмечают, что гинзенозид-Rc 10 в некоторых каллусах отсутствует [208].
