Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор: 7
1.1. Са2+-АТФаза плазматических мембран: 7
1.1.1. Очистка и реконструкция 7
1.1.2. Общая функциональная характеристика 9
1.1.3. Топология молекулы 14
1.1.4. Регуляция активности кальмодулином 19
1.1.5. Другие модуляторы активности 26
1.1.6. Разнообразие изоформ 38
1.1.7. Системы экспрессии 52
1.1.8. Медицинские аспекты 5 6
1.2. Семейство Х+Х-АТФаз: 61
1.2.1. №+,К+-АТФаза 61
1.2.2. Желудочная Н+Х-АТФаза 66
1.2.3. р-субъединицы Х+,К+-АТФаз 67
1.2.4. ЕҐ,К+-АТФаза нежелудочного типа: 69
1.2.4.1. Идентификация мРНК и гена 69
1.2.4.2. Проблема классификации 73
1.2.4.3. Вопрос о истинной (З-субъединице 75
1.2.4.4. Каталитические свойства 77
1.2.4.5. Тканеспецифичность экспрессии и внутриклеточная локализация 81
1.2.4.6. Физиологическая роль 82
1.3. ІҐ-трансгидрогеназа 92
2. Результаты и их обсуждение 95
2.1. Са2+-АТФаза плазматических мембран: 95
2.1.1. Картирование регуляторных участков 95
2.1.2. Получение МА 101
2.1.3. Тонкое картирование эпитопов МА 102
2.1.4. Мембранная топология молекулы 111
2.2. Н+-трансгидрогеназа: 115
2.2.1. Разработка нового метода очистки 115
2.2.2. Изучение структурно-функциональной организации 119
2.3. ІҐ,К+-АТФаза нежелудочного типа: 123
2.3.1. Получение специфических антител к а-субъединице 123
2.3.2. Исследование тканеспецифичности экспрессии гена ATP1AL1 125
2.4. Каталитическая субъединица №+,К+-АТФазы: 129
2.4.1. Проблема трансмембранной топологии С-концевой половины 129
2.4.2. Получение библиотеки антител, специфичных к участкам а-субъединицы Na+X-АТФазы 131
2.4.3. Изучение трансмембранной организации Ка+,К+-АТФазы 133
2.5. Мышечная Р-субъединица Х^К^-АТФаз 137
3. Экспериментальная часть 143
4. Выводы 170
5. Благодарности 172
6. Список сокращений 173
7. Список литературы 175
- Общая функциональная характеристика
- Тканеспецифичность экспрессии и внутриклеточная локализация
- Изучение структурно-функциональной организации
- Получение библиотеки антител, специфичных к участкам а-субъединицы Na+X-АТФазы
Введение к работе
Актуальность проблемы. Фундаментальным свойством живой клетки является наличие градиента концентраций различных ионов относительно как наружной мембраны, так и мембран внутриклеточных компартаментов. Зависимыми от внутриклеточной концентрации ионов являются Такие физиологически важные процессы как возбудимость и сократимость клеток, все виды клеточного движения, секреция гормонов и пищеварительных ферментов, высвобождение нейромедиаторов и транспорт метаболитов. Среди всего многообразия ионов, участвующих в метаболизме целой клетки и ее органелл, ключевую роль играют ионы водорода, калия, натрия и кальция. Нарушение внутриклеточного баланса именно этих катионов вызывает необратимые метаболические сдвиги, губительные для клетки, а на уровне организма в целом является одной из причин возникновения и развития многих тяжелых заболеваний.
В клеточных мембранах существует большое многообразие систем транспорта ионов, важнейшую роль среди которых играют мембранные системы активного транспорта катионов - ионзависимые АТФазы. Одни из них отвечают за поддержание градиента концентрации ионов, другие используют созданный градиент как движущую силу для катализа тех или иных биохимических реакций. В свою очередь различные ионы, участвующие в клеточном гомеостазе, требуют наличия широкого спектра систем транспорта этих ионов через мембраны клеток и их органелл.
Большая, физиологическая значимость транспорта ионов предопределяет интенсивность исследований самых различных структурно-функциональных аспектов всего многообразия ионтранспортирующих систем. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в мире за последние годы в этой области, исследование трехмерной и надмолекулярной структуры ионтранспортирующих систем до сих пор находится на начальном этапе своего развития;". поскольку специфические трудности работы со сложноорганизованными мембранными белками не позволяют эффективно использовать метод рентгеноструктурного анализа. Это обстоятельство сдерживает прогресс в изучении реальных механизмов функционирования систем активного транспорта катионов через биологические мембраны.
В то же время список существующих ионтранспортирующих систем на сегодняшний день далеко не полон, и даже грандиозное продвижение в секвенировании генома человека не дает оснований полагать, что з ближайшее время будут полностью определены первичные структуры всех мембранных белков, поскольку структурное многообразие часто увеличивается за счет альтернативного сплайсинга.
Исходя из вышеизложенного, необходимо отметить, что изучение связи между химической структурой, пространственной организацией и принципами функционирования мембранных белковых комплексов, а также поиск новых элементов систем ионного транспорта, необходимых для жизнедеятельности организмов, является одной из основных проблем современной физико-химической биологии.
Цель работы. Основной целью настоящей работы явилась характеризация структуры разных уровней нескольких мембранных ионтранспортирующих белков, а именно Са2*-АТФазы плазматических мембран, изоформ Х*,К*-АТФаз и Н*-трансгидрогеназы.
Наиболее распространенными в животном мире системами активного транспорта ионов являются катионтранспортирующие АТФазы (Н*-. К*- и №*,К*-АТФазы и Са2*-АТФаза плазматических мембран). Используя энергию гидролиза АТФ, эти сложные биологические машины осуществляют два взаимосвязанных и противоположно направленных процесса: выброс ионов водорода или натрия и одновременный перенос ионов калия в клетку в случае Х*,К*-АТФаз и выведение ионов кальция в случае Са2*-АТФазы. Таким образом, происходит тонкая регуляция ионного состава и объема клетки и обеспечивается постоянстве неравновесного распределения катионов между клеткой и средой.
Одним из потребителей протонного градиента относительно внутреннее митохондриальной мембраны, а также клеточной мембраны бактерий является Н*-транспортирующая никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназа (Н*-трансгидрогеназа), использующая перенос протона для смещения равновесия NADP+NADH -> NADPH + NAD. Физиологическая роль данной реакции до сих пор не осознана полностью, однако о ее важности говорит значительная консервативность структуры Н*- трансгидрогеназы бактерий и животных.
В исследование структуры входит прежде всего определение аминокислотное последовательности фермента, установление субъединичного состава, идентификация участков, ответственных за каталитические и регуляторные свойства, а затем определение его трехмерной структуры.
В связи с естественными сложностями установления трехмерной структура мембранных белков в данной работе основной акцент был сделан на использование иммунохимических методов, связанных с получением специфических MOHO- V поликлональных антител к указанным системам. Антитела позволяют в первую очередь зондировать пространственную организацию фермента, прежде всего трансмембранную укладку полипептидной цепи, а изучение влияния антител на каталитические свойства фермента дает возможность определять функционально важные участки молекулы белка Решение этих задач требует как тонкого картирования эпитопов, так и получения антител с предопределенной специфичностью.
Другим аспектом применения антител является выделение изучаемого белка методом иммуноаффинной хроматографии с целью изучения субъединичного строения той или иной системы, т.е. получения информации о четвертичной структуре. Данный подход особенно ценен в изучении белков, синтезируемых клетками в малых количествах. Детекция изучаемого фермента в органах и тканях при помощи антител позволяет создать основу для выяснения конкретной физиологической роли той или иной системы на уровне целого организма.
Учитывая данные по изучению ионтранспортирующих систем, полученные другими исследователями, основное внимание было направлено на получение коллекций моноклональных антител (МА) к вышеупомянутым объектам и характеризацию специфичности (локализацию эпитопов) полученных антител, а также применение данных антител для тестирования трансмембранной организации Са2*"АТФазы плазматических мембран и №*,К*-АТФазы. Получение же ингибирующего МА к Н*-трансгидрогеназе и тонкое картирование его эпитопа позволило создать модель расположения доменов Н*-трансгидрогеназы Е. со//.
В исследовании ранее малоизученной Н*,К*-АТФаэы нежелудочного типа (продукт гена alp1al1) усилия были сфокусированы на изучении тканеспецифичной экспрессии и иммуногистохимической локализации в тканях с максимальным уровнем экспрессии гена.
Кроме того, проводили поиск новых изоформ субъединиц ионтранспортирующих ферментов на уровне транскриптов.
Научная новизна и практическая ценность работы. Определена первичная структура новой р-субъединицы Х*,К*-АТФаз, присутствующей только в мышечной ткани (поэтому названной рт) В сравнении с другими членами семейства р-субъединиц Х*,К*-АТФаз гипотетический белок рт имеет необычные структурные черты, такие как наличие N-концевого домена, богатого остатками Glu, а также необычный тип гликозилирования своего эктодомена.
Показано, что белковые продукты генов млекопитающих, гомологичные ATP1AL1 человека, следует рассматривать как одну изоформу Н*,К*-АТФазы нежелудочного типа. Данные гены имеют высокий уровень экспрессии в прямой кишке млекопитающих (за исключением человека), коже и некоторых урогенитальных органах (особенно в коагулирующей железе крысы). Более подробный анализ указывает на то, что данная АТФаза специфична для апикальных мембран эпителия соответствующих органов.
Одной из характерных особенностей данной работы явилось широкое внедрение при решении проблем структурно-функциональных взаимоотношений библиотек экспрессированных фрагментов генов исследуемых ферментов с последующим установлением их функциональной и иммунохимической активности. Этот подход, являясь
более эффективным, с успехом заменил широко распространенный ранее метод пептидного картирования.
Тщательно охарактеризованные моноклинальные антитела — исключительно полезный инструмент в исследованиях биополимеров. Антитела, специфичные к определенным изоформам ферментов, находят широкое применение, например, для иммунохимической детекции соответствующих изсформ в тканях организма. Например, в данной работе показано, что одно из МА реагирует только с 4-й изоформой Са-АТФазы плазматических мембран (ИРМСА4), а другое — распознает все известные изоформы Са2*-АТФазы высших животных. Это позволяет определять содержание hPMCA4 относительно общего пула фермента.
При помощи анализа связывания охарактеризованных МА с интактными эритроцитами и мембранными пузырьками получено подтверждение теоретической модели трансмембранной укладки N-концевой половины молекулы Са2*'АТФазы плазматических мембран и С-концевой половины а-субъединицы №',К*-АТФазы.
Кроме того, показана практическая возможность использования С-концевого домена Са2*-АТФазы для продукции, детекции и аффинной очистки рекомбинантных белков, что с успехом применено для получения высокоочищеннсй Н*-трансгидрогеназы Е. coli. Несмотря на то, что к настоящему времени уже предложено немало различных «партнеров» для создания гибридных белков, например, гексагистидиновая последовательность (которая также широко применялась в данной работе), использование аффинной хроматографии на кальмодулине имеет определенные преимущества, например, позволяет проводить выделение химерных белков в строгих восстановительных условиях.
Таким образом, открыто как существование новых компонентов систем транспорта ионов (р„), так и получена обширная информация по различным аспектам структуры и функции хорошо известных и важных систем. Вся полученная информация существенно расширяет возможности дальнейших исследований функционирования систем транспорта ионов через биологические мембраны.
Работа выполнена в ИБХ РАН в в сотрудничестве со Швейцарским Институтом Технологии (Цюрих, Швейцария), Медицинским Колледжем Огайо (Толидо, США), Гетеборгским Университетом (Ґетеборг, Швеция). Автор приносит благодарность всем коллегам, учавствовашим в выполнении работы и обсуждении ее результатов.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российской академии наук, Российского фонда фундаментальных исследсзаний, Научного совета по белковой инженерии, Международного научного фонда, Министерства науки и технологий Российской Федерации, Шведского совета по естественным наукам, Американского фонда гражданских исследований (CRDF) и ИНТАС
Общая функциональная характеристика
Попытки выделить РМСА такими методами, как ионобменная хроматография и гель-фильтрация оказались неудовлетворительными для получения высокоочищенного активного препарата [26]. РМСА может быть получена в довольно чистом виде из мембран эритроцитов при помощи солюбилизации ее в неионном детергенте и аффинной хроматографии на иммобилизованном кальмодулине с элюцией ЭДТА. Впервые это удалось сделать в Швейцарии Ниггли, используя тритон Х-100 [5], а позднее — и с использованием дезоксихолата [27]. Авторами был получен белок с электрофоретической подвижностью 125 кДа и примесью 205 кДа (наиболее вероятно — димер РМСА, его количество возрастает при длительном хранении). Выход общей активности составил 19.5% с обогащением в 500 раз. [5]. Позднее процедуру удалось существенно улучшить за счет добавления фосфатидилхолина и глицерина [28] в буферы для очистки, повысив удельную активность в 2 раза и выход общей активности до 49% [29]. Позднее метод был также адаптирован и для небольших объемов эритроцитов [30].
Эритроциты представляют собой наиболее удобный источник для выделения РМСА, поскольку они содержат, по всей видимости, только один тип мембран — плазматические. Очистка РМСА из других тканей осложняется присутствием большого количества других мембран и ассоциированных белков, в том числе кальмодулин-связывающих. Все же удалось выделить РМСА из обогащенной фракции плазматических мембран из сердца [31-37], скелетной мышцы [38], гладкой мышцы [39]) и из синапса [39,40], из ацинарных клеток [41] и из проростков редьки [42]. Проблематичным оказалось выделение РМСА из печени, поскольку РМСА этого органа не связывает кальмодулин. Это удалось сделать лишь с использованием аффинной хроматографии на моноклональном антителе, но белок был выделен в неактивной форме, поскольку элюция с сорбента осуществлялась 4М мочевиной [43].
Очищенная РМСА была успешно реконструирована в азолектиновые (из фосфолипидов сои) пузырьки, приготовленные при помощи ультразвуковой обработки. Детергент можно удалять двумя способами: дезоксихолат — диализом, а тритон Х-100 — абсорбцией на полимере SM-2 [44]. Первый способ дает более плотно-замкнутые липосомы и позволяет наблюдать транспорт Са (внедрение Са) и стимуляцию Са2+-АТФазной активности Са2+-ионофором А23187 (за счет устранения градиента Са2+). Реконструированный насос является подходящим объектом для изучения стехиометрии ионного транспорта. РМСА принадлежит к АТФазам Р-типа, т.е. образует фосфорилированный интермедиат (ацилфосфат) по остатку аспарагиновой кислоты во время рабочего цикла (для таких АТФаз характерно наличие абсолютно консервативного мотива DKTGT(L,I)(T,I), а также ингибирование ванадатом).
Прежде всего нужно отметить существование нескольких систем активного транспорта Са2+ в клетке помимо РМСА: Са2+-АТФазы сарко-эндоплазматического ретикулума (SERCA), а также присущего плазматическим мембранам Na+/Ca2+-обменника. Чтобы отличить при биохимических экспериментах активности этих трех систем, используют несколько приемов. Транспорт Са2+, опосредованный Са2+-АТФазами и обменником, можно различить с использованием безнатриезых сред и ингибированием АТФаз ванадатом, лантаном или кадмием [45]. Для отличия активности РМСА от SERCA применяют либо кальмодулин, специфически активирующий РМСА, либо тапсигаргин, селективный ингибитор SERCA [46]. Этот ингибитор теперь широко применяется, его использование более удобно, чем измерение кальмодулин-активируемой активности, поскольку последняя может зависеть от уровня эндогенного кальмодулина, степени протеолического расщепления РМСА и других факторов. Также очень важно отметить, что, в отличие от других АТФаз, фосфорилирование РМСА увеличивается в присутствии солей La3+ [47].
Считается, что РМСА состоит из одной полипептидной цепи, включающей в себя около 1200 аминокислотных остатков. В высокоочищенных препаратах РМСА при электрофоретическом анализе наблюдается только одна полоса, поэтому вполне обоснованно считается, что РМСА имеет только одну субъединицу. Скорее всего, РМСА в норме негликозилирована, однако это нельзя строго исключить. Сообщалось также, что очищенная РМСА сердца крысы ингибируется на 20% при обработке нейраминидазой [34].
Нужно также упомянуть об интересном открытии, пока неподтвержденном в работах других авторов — очищенная из эритроцитов РМСА, содержит поли(3-гидроксибутират) и полифосфат [48]. Эти вещества присутствуют в мембранах многих клеток, в частности, в бактериях они образуют потенциал-зависимые Са2+- каналы, благодаря им же происходит трансмембранный перенос ДНК при трансформации. В той же работе показано, что РМСА функционирует и как полифосфаткиназа. Если данное открытие — не артефакт, то возможно, что эти вещества ассоциированы с РМСА в один комплекс и/или важны для ее работы. В таком случае уникальна ли РМСА среди других АТФаз?
Итак, располагаясь в цитоплазматической мембране, РМСА связывает ионы Са2+ и переносит их за пределы клетки, используя энергию АТФ. Общая схема рабочего цикла РМСА аналогична всем АТФазам Р-типа и особенно SERCA. Фермент активируется связыванием Са (кажущаяся КІ по внутренней флуоресценции очищенной РМСА — около 1 10"7 [49]). В Са2+-связанной форме РМСА фосфорилируется Мд2+-АТФ. Затем от фосфорилированного фермента отщепляется Са2+ на другой стороне мембраны (что соответствует состоянию с низкой аффинностью к Са2+ — Kd около 2-Ю"3). Скорость-лимитирующей стадией реакционного цикла считается отщепление фосфата, т.е. гидролиз фосфофермента. Для процесса также необходимо присутствие магния, который катализирует его с Ко.5 около 26 мкМ [50]. По всей видимости, магний необходим для перехода Ei— Е2. Здесь нужно отметить, что РМСА ранее называлась Са2+Мд2+-АТФазой.
Тканеспецифичность экспрессии и внутриклеточная локализация
В тканях кролика при сравнении экспрессии "1а" и "lb оказалось, что в мозге их содержатся равные количества, в то время как в других тканях (аорте, сердце, печени, желудке) имеется только "lb [299].
С использованием поликлональных антител к N-терминальным фрагменам РМСА анализировали иммуноблоттингом распределение изоформ на уровне белка в тканях человека и крысы [336]. Показано, что в эритроцитах и почках человека присутствует смесь изоформ 1 и 4, в мозге — все четыре изоформы, а в сердце — только 4 (здесь нужно напомнить, что на уровне РНК в сердце детектировалсь смесь изоформ 1 и 4 [353]). В то же время в тканях крысы была детектирована только РМСА1 и только в мозге — 1,2,3 (РМСА4 не анализировалаь, так как не удалось получить специфичных антител).
С помощью МА удалось также сравнить относительное содержание варианта Ь для РМСА4 в тканях человека [345]. Согласно этим данным в легких и почках присутствует преимущественно Ъ , а в мозге и сердце этот вариант составляет только часть общей РМСА4. Очень важно сравнить результаты, полученные при помощи анализа транскриптов и детекции реального белка при помощи антител. К счастью, в большинстве случаев эти методы дают сходные результаты. При сравнении разных видов (пока что это возможно только для крысы и человека) можно сделать предварительный вывод, что использование РМСА4 более характерно для тканей человека, а РМСАЗ — для тканей крысы. Отдельно нужно расмотреть мозг, для которого характерно большое разнообразие изоформ и сплайсинговых вариантов. Для детекции обычно применяют гибридизацию in situ или иммуногистохимию [281,357-367]. Наибольшое содержание РМСА характерно именно для нейронов [363]. Надо отметить, что пока не удается создать целостную картину распределения вариантов РМСА по отделам мозга, некоторые данные противоречат друг другу РМСА1 присуща всем отделам мозга. В мозге крысы наибольшее количество РМСА1 содержится в пирамидальных нейронах гиппокампа, а наименьшее — в ядрах гипоталамуса, мозжечке, хороидальном сплетении и мозолистом теле [357,363]. PMCA2 наиболее характерна для клеток Пуркинье мозжечка, ее количество мало в хороидальном сплетении, мозолистом теле, поводке, хвостатом ядре, скорлупе и ядрах гипоталамуса [357,363]. РМСАЗ уникальна тем, что наиболее характерна для мозжечка, мозолистого тела, хороидального сплетения, поводка и гиппокампа, причем зачастую ассоциируется с гранулярными процессами, т.е. каким-то образом связана с растущими клетками. В мозолистом теле и хороидальном сплетении РМСАЗ находится в клетках, выстилающих поверхность желудочков, т.е. может быть связана именно с поддержанием кальциевого гомеостаза цереброспинальной жидкости [357,363]. В то же время экспрессия РМСАЗ в поводке специфична для нейронов, а не глии; РМСАЗ отсутствует в астроцитах и белом веществе. гРМСА4 в мозге крысы [360] отсутсвуєт в мозолистом теле, но обильна в нейронах гипоталамуса, грушевидной и новой коры. В целом ее распределение мРНК гРМСА4 согласуется с кальбиндином-28к. Исследований на уровне белка совсем мало, при помощи иммуноблоттинга со специфическими поликлональными антителами показано, что в мозжечке и коре мозга человека имеются все изоформы, в стволе — 1, 2, 4, а в хороидальном сплетении — только 3 и 4 [336]. При помощи иммуноблоттинга с антителами специфичными к вариантам РМСА показано, что 1а , 2а , 2Ь , За , 3D И 4Ь присутствуют во всех отделах мозга крысы, а вариант 4а специфичен для лобной доли коры [365]. Отмечено также, что варианты ЗЬ и 4Ь склонны к протеолизу С-концевого, а количество варианта 1Ь в мозге крысы незначительно. Распределение транскриптов РМСА в мозге человека хорошо изучено только методом ОТ-ПЦР из биопсий, т.е. ультраструктурные различия пока неизвестны, но зато лучше изучено распределение сплайсинговых вариантов [359]. Показано, что варианты hPMCAl по сайту А в мозге отсутствуют (есть только 1х ), но присутствуют варианты по сайту С: во всех отделах много hPMCAIa и hPMCAlb, несколько меньшее количество hPMCAIc, a hPMCAle специфична для коры, черного вещества и таламуса. В то же время присутствуют несколько вариантов РМСА2 по сайту A ( w , х , z , но не д ), все они экспрессированы в нижней оливе и мозжечке, с преобладанием формы z . В черном веществе преобладает. hPMCA2x. Среди вариантов hPMCA2 по сайту С преобладает Ъ , вариант с полностью отсутствует. Для пРМСАЗ преобладает вариант х , в существенном количестве присутствует z . Сплайсинг пРМСАЗ по сайту дает одинаковое количество вариантов а и Ъ . Для hPMCA4 характерно наличие только х -варианта и преобладание Ъ , во всех частях мозга, кроме коры. В большинстве ее участков содержится примерно поровну hPMCA 4а и Ь . Нужно также отметить, что в мозге человека уровень экспрессии РМСА4 существенно больше, чем в мозге крысы. При рассмотрении человеческого мозга с точки зрения его отделов, а не изоформ РМСА, нужно отметить преобладание вариантов а в затылочной части коры. Нужно также отметить, что в гиппокампе человека РМСА2 и РМСА4 преобладают над РМСА1 и РМСАЗ [362].
Наиболее интересным в исследовании изоформ РМСА может быть изучение регуляции их экспрессии. Большинство биохимических исследований РМСА проведены на РМСА эритроцитов (безъядерных клетках). Нужно отметить, что время полужизни РМСА невелико (в мозге крысы — 18 ч [368]), поэтому в других клетках регуляция экспрессии РМСА может играть большую роль в поддержании концентрации внтуриклеточного кальция и её изменениях под действием тех или иных эффекторов.
Изучение структурно-функциональной организации
Существование Н+,К -АТФазы нежелудочного типа, вовлеченной в абсорбцию К и секрецию протона в почке и прямой кишке было предсказано во многих физиологических, биохимических и фармакологических исследованиях (для обзора [499-505]). Однако ни разу не удалось осуществить выделение соответствующих ферментов.
Впервые клонировать мРНК ATP1AL1 удалось группе Шуля из прямой кишки крысы [506]. Несколько позднее было осуществлено клонирование кДНК ATP1AL1 человека из библиотеки кДНК кожи [444]. Родственная кДНК была также клонирована из мочевого пузыря жабы Bufo marinus [507], а позднее еще из двух видов млекопитающих: кролика [508] и морской свинки [509]. Частичные последовательности кДНК были также определены для мыши и собаки [510].
Аминокислотная последовательность предполагаемого белкового продукта, выведенная на основании структуры кДНК, состоит из 1039 аминокислотных остатков и содержит структурные мотивы, характерные для Х+,К+-АТФаз [86]. Результаты сравнительного анализа последовательностей іГ-зависимьіх АТФаз позволили сделать предположение, что белок, кодируемый геном ATP1AL1, относится к третьей группе семейства Х+,К+-АТФаз, отличной от Na+,K+-ATOa3 и Н+,К+-АТФазы слизистой желудка, поскольку с ними проявляет всего 63-64% гомологии по аминокислотной последовательности.
К настоящему времени определена также и структурная организация гена ATP1AL1 человека [511,512]. Оказалось, что ген имеет размер около 32 т.п.о. и содержит 23 экзона. Таким образом, ген ATP1AL1 имеет наибольшую длину среди генов Х+,К+-АТФаз (в сравнении с 25 т.п.о. №+,К+-АТФаз и 13.5 т.п.о. для желудочной Н+,К+-АТФазы). В то же время расположение границ экзонов с последовательности мРНК оказывается высококонсервативным для всех Х+,К -АТФаз.
Сайт инициации транскрипции находится на расстоянии 187 п.о. от инициирующего кодона. Анализ 5 -нетранслируемого региона обнаружил многочисленные сайты связывание транскрипционных факторов Sp1 и АР2 и один сайт связывания фактора NF-кВ. БЫЛО обнаружено девять /Ми-повторов (в интронах 3, 13, 14 и 17).
При помощи анализа соматических гибридов линий клеток человека и грызунов показано, что ген ATP1AL1 человека локализован на хромосоме 13 [513]. Интересно, что недалеко расположен и ген р-субъединицы желудочной H+,K -АТФазы.
Наименее консервативным регионом белков Atp1al1 является их N-терминальный цитоплазматический домен, кодируемый экзонами 1 и 2. Данная вариабельность N-концевой части может быть увеличена еще больше при помощи использования альтернативных транскриптов, обнаруженных в прямой кишке крысы [514] и почке кролика [508]. Данные мРНК по всей видимости возникают в результате инициации транскрипции внутри интрона 1 и имеют значительные пертурбации внутри их 5 -концов, и соответственно, в рамках считывания. В выведенном белке крысы (названном НК2Ь) полностью отсутствует N-концевой цитоплазматический домен, поскольку первый инициирующий кодон соответствует Met109 «канонического» белка. Напротив, изменения в мРНК кролика приводит к белку, называемому НК2с, с одним делитированным остатком (Arg2) и удлиненным N-концом за счет последовательности длиной 62 аминокислотных остатка. Данная последовательность богата остатками Gly, Pro и оставных аминокислот и не имеет существенной гомологии с каким-либо известным белком. Белок крысы "2Ь" был синтезирован с использованием трансляции in vitro, но его существование in vivo не было продемонстрировано. Однако, нозерн блоттинг со специфическими зондами указывает, что транскрипт 2Ь является доминирующей формой и в прямой кишке, и в почке [514]. Такое противоречие может быть объяснено плохой трансляцией мРНК 2Ь в тканях.
Поскольку белок кролика 2с содержит уникальную последовательность, то удалось получить специфические антитела и детектировать полосу с ожидаемой электрофоретической подвижностью в иммуноблоттинге белков почечной коры кроликов, и клеточной линии кортикального собирающего канальца [508].
Недавно также была проведена ОТ-ПЦР анализ тканей человека с одним праймером, специфичным интрону 1 и другим, специфичным региону, общему для обеих форм мРНК. Было показано существование транскрипта, аналогичного мРНК 2Ь и 2с животных, но с явно меньшим уровнем зкспрессии, чем каноническая форма. Секвенирование интрона 1 гена ATP1AL1 из библиотеки [511], не обнаружило какой-либо рамки считывания, сочетаемой с экзоном 2. Это означает, что трансляция предполагаемого альтернативного транскрипта человека должна приводить к укороченному белку, аналогичному 2Ь-форме крысы.
Эти исследования показывают, что часть нежелудочной Н Х-АТФазы имеет неканонические изменения в N-концевой области. Но физиологическое значение вариабельности N-концевого участка очень трудно понять. Наиболее простым объяснением могло бы быть такое: данные белки не имеют какой-либо специфической функции, и альтернативные транскрипты являются продуктами ошибок аппарата синтеза и модификации мРНК. Альтернативно, структурная вариабельность может отражать некоторые неизвестные различия в метаболизме ионов у данных видов.
Получение библиотеки антител, специфичных к участкам а-субъединицы Na+X-АТФазы
Для получения специфических моноклональных антител к Н+-трансгидрогеназе возникла необходимость получения высокоочищенных препаратов фермента. Для этого был разработан новый способ аффинной очистки рекомбинантных белков, основанный на использовании свойства С-концевого фрагмента РМСА связывать кальмодулин в присутствии ионов кальция.
Нами был создан гибридный белок, содержащий С-концевой фрагмент РМСА, присоединенный к С-концевой области р-субъединицы Н+-трансгидрогеназы. Для этого сначала был модифицирован вектор pSA2 для экспрессии Н+-трансгидрогеназы дикого типа при помощи молчащего сайт-направленного мутагенеза. Полученная конструкция содержала новый сайт узнавания рестриктазы Hind III, позволяющий подстраивать любые фрагменты к С-концевому участку гена, кодирующего р-субъединицу Н+-трансгидрогеназы. Затем в это положение произведена вставка олигонуклеотида, кодирующего пептид — сайт связывания кальмодулина hPMCA4b (30 а. о.) (конструкция рНЕК). Другая конструкция, pHEG, была создана сходным путем, но в отличие от первой она содержала весь С-концевой фрагмент изоформы hPMCA4b (150 а.о.). Эта изоформа была выбрана потому, что продукция ее С-концевого фрагмента проходила с гораздо более высоким выходом, чем в случае изоформы hPMCAIb.
Лизат клеток Е. coli TG-1, несущих конструкцию pHEG, дал 40% трансгидрогеназной активности от дикого типа, тогда как в клетках, трансформированных плазмидои рНЕК, трансгидрогеназная активность отсутствовала. Иммуноблоттинг общего клеточного белка с биотинилированным кальмодулином и антителами, специфичными к а-субъединице Н+-трансгидрогеназы, показал, что в случае Е. coli, несущей pHEG, был обнаружен продукт экспрессии с М 67 кДа, реагирующий с кальмодулином. Однако в случае Е. coli, несущей рНЕК, не удалось детектировать белковых продуктов, которые отсутствовали бы в клетках дикого типа. В то же время экспрессия ос-субъединицы Н+-трансгидрогеназы не нарушена в клетках, содержащих обе конструкции.
При очистке химерного белка HEG решающее значение для чистоты продукта имел выбор детергента. Оптимальные результаты были получены с использованием смеси бриджа-35, холата и дезоксихолата. В таких смешанных детергентных мицеллах химерный белок эффективно сорбировался на кальмодулин-сефарозе в присутствии ионов Са2+ и элюировался EDTA.
Электрофореграмма мембранных белков Е. coli и очищенного продукта HEG показана на рис. 17, а обобщение результатов очистки — в табл. 6. Чистота полученного продукта оказалась сравнимой с чистотой гексагистидинсодержащей Н+-трансгидрогеназы, (очищенной при помощи металлоаффинной хроматографии) и существенно выше, чем чистота Н+-трансгидрогеназы дикого типа (очищенной при помощи ионообменной хроматографии [618]). Хотя на электрофореграммах все эти препараты выглядят довольно чистыми (результаты не представлены), на рис. 18 видно, что Н+-трансгидрогеназа дикого типа, очищенная без применения аффинных взаимодействий, содержит примесь неизвестного бактериального белка с молекулярной массой примерно такой же, как и у р-субъединицы Н+-трансгидрогеназы. Примесь этого белка отсутствует в препаратах HEG.
Использовалось MA 1D6, распознающее неидентифицированный белок К coli. Таким образом, оказалось возможным получать высокоочищенный препарат химерной Н+-трансгидрогеназы за одну хроматографическую стадию. Достоинства и недостатки аффинной хроматографии на кальмодулин-сефарозе и столь широко используемой ныне металлоаффинной хроматографии различны. Несомненным преимуществом последней является небольшой размер аминокислотой последовательности, добавляемой к целевому продукту. В случае Н+-трансгидрогеназы присоединение гексагистидиновой последовательности к N-концу ее р-субъединицы не приводит к понижению уровня продукции целевого белка [613], чего, к сожалению, не удалось избежать в случае HEG. Однако очистку на иммобилизованном кальмодулине можно проводить в строгих восстановительных условиях (в присутствии ДТТ), что может быть полезным для многих ферментов. Хотя Н+-трансгидрогеназа и не имеет функционально важных остатков Cys [606], в качестве примера достоинства полученного химерного белка можно привести тот факт, что по неизвестной причине очищенная (но не мембранносвязанная) металлоаффинной хроматографией Н+-трансгидрогеназа очень быстро теряет активность при хранении. Очищенный продукт экспрессии конструкции pHEG лишен этого досадного недостатка.
Данная работа — первый пример практического использования аффинной хроматографии на кальмодулине для очистки химерного мембранного белка, продуцированного в бактериях. Хотя сама идея использования взаимодействий кальмодулина и его мишеней для очистки рекомбинантн ых белков была предложена достаточно давно, метод долго не находил широкого применения. В настоящее время данный подход усиленно рекламируется фирмой «Stratagene», которая продает несколько конструкций для создания и очистки химерных белков с коротким кальмодулин-связывающим пептидом киназы легкой цепи миозина [619,620]. Однако в случае Н+-трансгидрогеназы использование аналогичного подхода (конструкция рНЕК) оказалось совершенно неудовлетворительным. Введение в С-концевую область р-субъединицы небольшого положительно заряженного фрагмента могло фатально повлиять на фолдинг и взаимодействие субъединиц Н+-трансгидрогеназы. В то же время использование длинного фрагмента (конструкция pHEG) позволило провести успешную продукцию и очистку химерного фермента. Возможно, решающую роль сыграло то, что С- концевой фрагмент РМСА (150 а.о.) «стабилизирован» по заряду (его pi и pi Н+-трансгидрогеназы примерно равны 5.5).