Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из основных проблем современной нейробиологии является выяснение молекулярных механизмов передачи нервного импульса и, как следствие, исследование функционирования рецепторов, вовлеченных в этот процесс.
Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (нАХР) представляют собою классический образец лиганд-управляемых ионных каналов. Эти рецепторы играют важную роль в различных физиологических процессах, как в норме, так и при некоторых патологических состояниях. Существует несколько подтипов нАХР, различающихся по своим фармакологическим свойствам. Вследствие этого направленный рациональный дизайн лигандов нАХР, обладающих различной селективностью и сродством, представляет значительный интерес как для фундаментальных исследований (в качестве инструментов для изучения молекулярных основ передачи нервного импульса), так и для практики (в качестве потенциальной основы для создания новых лекарственных препаратов).
Возможность применения методов направленного дизайна селективных лигандов нАХР обусловлена наличием большого количества высокоспецифичных природных лигандов с известной структурой, в частности, полипептидных токсинов из ядов змей (а-нейротоксины) и моллюсков рода Conns (а-конотоксины). Кроме того, прорывом в изучении структуры нАХР стало открытие и установление пространственной структуры гомолога лиганд-связывающего домена нАХР - водорастворимого ацетилхолинсвязывающего белка (АХСБ). Так, на основании полученных кристаллографических данных о комплексах АХСБ с лигандами сделаны выводы о конформационных перестройках отдельных участков молекулы рецептора, приводящих к открытию ионного канала при связывании агониста.
Тем не менее, для методов рационального дизайна необходимо детальное картирование лиганд-связывающих участков нАХР и АХСБ, определение структурных элементов молекулы лиганда, взаимодействующих с отдельными областями участков связывания, и установление конкретных межмолекулярных взаимодействий. Подобное картирование позволит применить накопленные данные о взаимодействии лигандов с нАХР для конструирования молекул, обладающих высокой селективностью и сродством к определенному типу нАХР.
Данная работа посвящена изучению структурных детерминант пептидных токсинов из ядов змей и моллюсков, определяющих их сродство и селективность к нАХР, а также картированию участков рецептора, вовлеченных во взаимодействие с токсинами. Таким образом, она направлена на решение проблемы рационального дизайна пептидных лигандов нАХР и является актуальной и обоснованной.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось установление подробной топологии участка связывания лигандов в нАХР и определение молекулярных механизмов взаимодействия с ним пептидных токсинов.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1) Установить методологическую применимость вычислительного моделирования при
анализе взаимодействия пептидных лигандов с нАХР, для чего на основании биохимических и
структурных данных о взаимодействии лигандов и рецепторов воспроизвести или же
определить заново возможные конформационные положения различных конотоксинов в
участке связывания ацетилхолина, а также объяснить со структурной точки зрения полученные
в реальных экспериментах данные;
2) Провести апробацию предсказательных способностей получаемых моделей на
основании определения их функционального потенциала на примере комплексов нАХР с
коротким а-нейротоксином и его мутантной формой, а также со слабыми нейротоксинами;
3) На основании полученных данных определить потенциальные пары взаимодействия и
структурные детерминанты токсинов, определяющие их сродство и селективность к
определенному типу рецептора;
4) Предсказать возможные свойства ряда аналогов конотоксина PnIA и провести
сравнение предсказанных и наблюдаемых в эксперименте параметров взаимодействия.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые построены структурные модели нАХР и АХСБ в комплексе с полипептидными лигандами с учетом подвижности отдельных элементов структуры рецептора, в частности петли С (обозначения элементов структуры молекул нАХР, АХСБ и трехпетельных токсинов приведены на рис.1). Установлены области структуры рецептора и соответствующие им участки токсинов, определяющие характер взаимодействия между нАХР и пептидными антагонистами. Показано, что пептидные антагонисты нАХР имеют в целом сходный механизм взаимодействия с каноническим участком связывания ацетилхолина, однако некоторые детали взаимодействия существенно различаются. Впервые методом рационального дизайна сконструированы пептидные лиганды с качественно заданной селективностью и сродством. Практическое значение данного исследования состоит в построении вычислительной модели участка связывания пептидных токсинов, которая может быть использована для рационального дизайна лигандов с заданными фармакологическими свойствами.
Апробация работы. Отдельные результаты работы представлялись на XII Международном симпозиуме по холинергическим механизмам (Аликанте, 2005), VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва-Пущино, 2006), Международном симпозиуме «Нейрорецепторы: структура, механизм действия и роль в патологиях» (Москва, 2007), Международном симпозиуме «Никотиновые холинорецепторы как терапевтические мишени» (Сан Диего, 2007), Российско-немецкой конференции «Новые достижения а изучении рецепторов нейротрансмиттеров» (Франкфурт-на-Майне, 2008), 8 конференции Азиатско-тихоокеанской секции Международного общества токсинологии (Ханой, 2008), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 статей в реферируемых международных журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего 287 цитируемых работ. Работа изложена на 140 страницах, содержит 9 таблиц и 29 рисунков.