Содержание к диссертации
Введение
1 Введение 4
2 Тритерпеновые гликозиды голотурий и их таксономическое распределение 9
2.1. Введение 9
2.2. Структуры и таксономическая специфичность гликозидов голотурий отряда Aspidochirotida 10
2.2.1. Гликозиды голотурий семейства Holothuriidae 11
2.2.2. Гликозиды голотурий семейства Stichopodidae 18
2.3. Структуры тритерпеновых гликозидов голотурий отряда Dendrochirotida 23
2.3.1. Гликозиды голотурий семейства Cucumariidae 23
2.3.2. Гликозиды голотурий семейства Phyllophoridae 36
2.3.3. Гликозиды голотурий семейства Sclerodactylidae 40
2.3.4. Гликозиды голотурий семейства Psolidae 43
2.4. Гликозиды голотурий химически малоисследованных групп 46
3 Обсуждение результатов 47
3.1. Гликозиды голотурий отряда Aspidochirotida 47
3.1.1, Гликозиды средиземноморских голотурий рода Holothuria семействаHolothuriidae 47
3.1.2. Гликозиды голотурии Australostichopus mollis семейства Stichopodidae 57
3.1.3. Гликозиды голотурий семейства Synallactidac 72
3.1.4. Тритсрпеновые гликозиды и филогения отряда Aspidochirotida 89
3.2. Гликозиды голотурий семейства Cucumariidae отряда Dendrochirotida 92
3.2.1. Введение 92
3.2.2. Гликозиды голотурии Cucumariafrondosa 93
3.2.3. Гликозиды голотурии Cucumaria okhotensis 128
3.2.4. Физиологическая активность гликозидов Cucumariafrondosa 133
4 Экспериментальная часть 141
4.1. Приборы и материалы 141
4.2. Биологический материал 142
4.3. Стандартные методики 143
4.3.1. Моносахаридный анализ 143
4.3.2. Сольволитическое десульфатирование 143
4.3.3. Псриодатнос окисление 143
4.4. Установление строения гликозидов 144
4.4.1. Гликозиды голотурии Holothuria tubulosa 144
4.4.2. Гликозиды голотурии Holothuria sp 144
4.4.3. Гликозиды голотурии Holothuriapolii 144
4.4.4. Гликозиды голотурии Australostichopus mollis 145
4.4.5. Гликозиды голотурии Synallactes nozawai 147
4.4.6. Гликозиды голотурии Pseudostichopus trachus 148
4.4.7. Гликозиды голотурии Cucumariafrondosa 149
4.4.8. Гликозиды голотурии Cucumaria okhotensis 153
Выводы 155
- Структуры и таксономическая специфичность гликозидов голотурий отряда Aspidochirotida
- Структуры тритерпеновых гликозидов голотурий отряда Dendrochirotida
- Гликозиды голотурий семейства Sclerodactylidae
- Гликозиды голотурий семейства Cucumariidae отряда Dendrochirotida
Введение к работе
Актуальность проблемы. Голотурии и некоторые виды губок уникальны тем, что содержат нехарактерные для других групп животных вторичные метаболиты -тритерпеновые гликозиды. До их обнаружения в голотуриях соединения этого класса считались метаболитами исключительно высших наземных растений. Первоначально интерес к вторичным метаболитам голотурий определялся высокой ихтиотоксичностью экстрактов из этих животных, что и послужило стимулом к развитию структурных исследований тритерпеновых гликозидов. В дальнейшем был также выявлен и широкий спектр их биологической активности: гемолитические, цитостатические, антигрибковые, противоопухолевые, иммуномодулирующие свойства. Сейчас гликозиды голотурий являются действующими началами лекарственных препаратов и биологически активных пищевых добавок, используемых как в медицине, так и в ветеринарии.
По мере накопления данных о химическом строении тритерпеновых гликозидов голотурий различных систематических групп, стала очевидной специфичность этих соединений для таксонов разного уровня. Появилась возможность использовать тритерпеновые гликозиды в качестве хемотаксономических маркеров. Кроме того, анализ особенностей строения основных и минорных гликозидов, выделенных из голотурии-продуцента, может быть использован для построения гипотетических схем биосинтеза тритерпеновых гликозидов.
Голотурии семейства Holothuriidae (отряд Aspidochirotida), обитающие на мелководье в тропической зоне мирового океана, изучены достаточно полно. Однако, представители этого семейства, населяющие зоны умеренного и субтропического климата, например, Средиземноморье, практически не изучались. В то же время известно, что гликозиды атлантической Holothuria forskalii, отличаются от гликозидов голотурий - обитателей тропиков. Поэтому изучение гликозидов средиземноморских представителей рода Holothuria было интересно не только с химической точки зрения, но и в плане хемосистематики.
Представлял интерес и состав гликозидных фракций голотурий семейства Synallactidae (отряд Aspidochirotida), включающего в основном глубоководных обитателей. Так, к началу наших исследований была известна структура только одного гликозида из голотурии Pseudostichopus trachus, однако, принадлежность данного вида к семейству Synallactidae оспаривалась рядом систематиков.
В состав семейства Cucumariidae (отряд Dendrochirotida) входят массовые промысловые виды голотурий рода Cucumaria, которые, как правило, содержат сложные гликозидные суммы. Изучение гликозидов различных видов Cucumaria представляет не только научный, но и прикладной интерес, так как они являются сырьем для изготовления ряда лекарственных препаратов и биологически активных
пищевых добавок. Поэтому знание состава ijn—ці,ц,)щі^щииіцмп пичных видов
ВИвЛИОТЕКА <
II II І* ф
кукумарий, точных структур гликозидов и проявляемой ими биологической активности необходимо для расширения практического применения этих препаратов. В связи с этим изучались гликозиды из двух видов голотурий рода Cucumaria: атлантической С. frondosa и камчатской С. okhotensis.
Целью данной работы является:
-
выделение и установление структур тритерпенових гликозидов из 6 видов голотурий семейств Holothuriidae, Stichopodidae и Synallacridae (отряд Aspidochirotida), а также из 2 видов голотурий рода Cucumaria (семейство Cucumariidae, отряд Dendrochirotida);
-
анализ особенностей химического строения гликозидов в целях разрешения
некоторых спорных вопросов систематики класса Holothuroidea;
3) выяснение возможности и перспективности использования гликозидов
промысловой голотурии С. frondosa в составе иммуномодулирующих
препаратов.
Научная новизна и практическая иетюсть работы. Из 8 видов голотурий
было выделено 36 тритерпенових гликозидов: для 25 новых соединений установлены полные химические структуры, а 11 - идентифицированы с известными. Впервые из голотурий выделены гликозиды, содержащие: сульфатную группу при С-3 остатка хиновозы, два остатка 3-О-метилксилозы, а,Р-ненасыщенный кето-фрагмент в боковой цепи агликона. Впервые из одного вида голотурий выделено 3 пары гликозидов, являющихся изомерами только по положению двойной связи в ядре агликонов. Кроме того, выделены новые гликозиды, содержащие глюкозу во втором положении углеводной цепи, вместо типичной для большинства гликозидов хиновозы. Показано, что для средиземноморских представителей рода Holothuria специфичны голотурины групп А и В, как и для видов Holothuria, обитающих в тропиках. Изучен гликозидный состав голотурии Australostichopus mollis, учитывая полученные данные, а также данные сравнительной морфологии произведен пересмотр её таксономического статуса. На основе анализа структур 7 гликозидов, выделенных из голотурий Synallactes nozawai и Pseudostichopus trachus предложено считать последнюю принадлежащей к семейству Synallactidae. Установлено отличие фракции моносульфатированных гликозидов нового вида голотурии - Cucumaria okhotensis, от гликозидов аналогичных групп других изученных представителей рода Cucumaria. Изучен гликозидный состав промысловой голотурии Cucumaria frondosa. Показана перспективность применения в медицине и ветеринарии гликозидных препаратов из С. frondosa в качестве иммуностимуляторов.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 3-й Европейской Конференции по* ''«Морским Природным Соединениям», Мюнхен, 2002;
международной конференции по сапонинам «Phytochemistry & Application of Plant Saponins», Пулавы (Польша), 2004.
Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 6 статей в научных журналах: Journal of Natural Products, Canadian Journal of Chemistry, Biochemical Systematics and Ecology, Natural Products Research и 2 тезисов.
Структура диссертации. Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора, посвященного структурам тритерпеновых гликозидов голотурий, Обсуждения результатов, где описаны и проанализированы полученные результаты, Экспериментальной части, а также Выводов и Списка литературы, включающего 150 цитируемых работ. Работа изложена на 171 странице, содержит 43 таблицы, 6 схем и 6 рисунков.
Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.х.н. Авилову С.А., академику Стонику В.А., д.б.н. Калинину В. И., к.х.н. Антонову А.С. за консультации и помощь в работе. Автор благодарит д.х.н. Калиновского А.И. за съемку и интепретацию ЯМР-спектров, Дмитренка П.С. за результаты масс-спектрометрии, д.б.н. Левина В. С, к.б.н. Смирнова А. В. и д.б.н. Гудимову Е. Н. -за определение голотурий, а также к.б.н. Аминина Д. Л. и к.б.н. Агафонову И.Г. - за проведение биоиспытаний.
Часто используемые сокращения: ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; (HR)FABMS - масс-спектрометрия (высокого разрешения) с ионизацией быстрыми атомами; (HR)MALDI-TOF - масс-спектрометрия (высокого разрешения) с лазерной десорбцией/ионизацией усиленной матрицей; COSY - корреляционная спектроскопия; DEPT - неискаженное усиление переносом поляризации; НМВС - гетероядерная многополосная корреляция; HSQC - гетероядерная одноквантовая корреляция; NOESY - спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО) и обмена.
Структуры и таксономическая специфичность гликозидов голотурий отряда Aspidochirotida
Согласно системе Поусона и Смайли, относительно немногочисленный отряд Aspidochirotida объединяет 3 семейства, включающих, в свою очередь, 35 родов, в составе которых насчитывается около 340 видов [4, 5J. Голотурии отряда Aspidochirotida с биологической и с химической точек зрения являются достаточно полно изученной группой, т.к. они оказались наиболее удобными и доступными объектами исследований как для биологов-систематиков, так и для химиков. Более того, по мере изучения тритерпенових гликозидов аспидохиротид стало возможным коррелировать химические данные с данными морфологии и систематики. Анализ специфических особенностей структур гликозидов различных таксономических групп привел к разработке гипотетической схемы филогенетических отношений химически изученных представителей отряда Aspidochirotida (схема 1, стр. 10) [6]. Нигрелли [71 и Яманоучи [8], которые независимо друг от друга выделили токсичные фракции из экстрактов голотурий Actinopyga agassizi и Holothuria leucospilota. Основные исследования по установлению строения нативных агликонов были выполнены группами Чанли и Соботки [9, 10]. В результате работ иностранных исследователей, а также сотрудников ТИБОХ ДВО РАН сначала были установлены структуры продуктов кислотного гидролиза гликозидов -артсфактных генинов, а затем и полные структуры нативных гликозидов. По результатам этих работ опубликована серия обзоров [11, 12,13]. В основу номенклатуры гликозидов голотурий положено гипотетическое тритерпеновое соединение с 18(20)-лактонным циклом - "голостан" (1) [14]. Голостановый скелет лежит в основе большинства изученных гликозидов голотурий, однако, в последнее время выделен ряд соединений, не содержащих 18(20)-лактона и являющихся неголостановыми производными. Необходимо отметить, что все изученные представители отряда Aspidochirotida содержали только голостановые гликозиды. 2.2.1. Гликозиды голотурий семейства Holothuriidae Голоту рины Для представителей трех родов семейства Holothuriidae: Holothuria, Actinopyga, Pearsonothuria типичными гликозидами, а, следовательно, хемотаксономическими маркерами, являются голотурины групп А и В. Каждая группа голотуринов состоит из нескольких «родственных» соединений.
Голотурины группы В (2) - биозиды, содержащие в углеводной цепи остатки ксилозы, сульфатированной по С-4, и хиновозы. Голотурины группы А (3) -тетраозиды, содержащие, по сравнению с голотуринами группы В, дополнительный блок 3-0-метилглюкоза-(1-»3)-глюкоза, присоединенный к С-4 остатка хиновозы. Агликоны голотуринов групп А и В относятся к голостановому типу и содержат характерный 12а-окси-9(П)-еновый фрагмент. Индивидуальные соединения внутри каждой группы отличаются только деталями строения боковых цепей агликонов и наличием или отсутствием 17а-гидроксигруппы. Первым выделенным из голотурий иативным гликозидом был голотурии В (4) из Holothuria leucospilota структура которого была установлена группой Китагавы в 1978 году [15, 16] на основе изучения продуктов ферментолиза гликозида 4, десульфатирования исходного голотурина и метилирования десульфатированного производного, а также анализа ЯМР спектров голотурина В (4) и его производных. Позднее голотурии В (4) был выделен из Holothuria at га [17], //. edulis [18] и Actinopyga flammea [19]. Следующим нативным голотурином группы В был гликозид 5, названный голотурином В и выделенный из H.floridana [20,21] и Н. atra [22]. Голотурии В( (5) или эхинозид В был выделен также из двух видов рода Actinopyga - A. echinites [23, 24] и А. таигШапа [25]. Последняя наряду с голотурином В] (5) содержала новый минорный голотурин группы В -24-дегидроэхинозид В (5а), отличающийся от 5 только строением боковой цепи [26]. В составе гликозидной фракции A. agassizi не было обнаружено голотуринов группы В, но имелись голотурины группы А [27]. Индивидуальный голотурин А (6) впервые был выделен из голотурии И. leucospilota группой Китагавы в 1979 году [28, 29]. Структуру агл икона устанавливали по данным ЯМР, а углеводной цепи - по данным метилирования, моносахаридного анализа и ферментолиза. Позднее голотурии А (6) был выделен в нашем институте из голотурий: Я. squamifera [30], Я. atra [31] и Я. grisea [32]. Кроме того, из голотурий Я. scarba, Н. edul ts, Я. axiologa, голотурии А был выделен японскими исследователями [26], а из голотурии Я. техісапа -американскими [33]. Двумя новыми структурными вариантами голотуринов группы А были голотурии Ai (7) и голотурии А2 (8), выделенные из спиртовых экстрактов Я. floridana [32, 34, 35] и Я grisea [32]. Голотурии А2 (8) был идентифицирован также в гликозидной фракции Я. edulis [36] и Actinopyga echiniies, где он был назван эхинозидом А [23, 24]. Этот же гликозид 8 в виде десульфатированного производного был выделен из гликозидных фракций голотурий Я. scarba, Я. axiologa и Я. atra [26]. Из голотурии A, agassizi наряду с голотурином A (6) был выделен гликозид 9, названный 24-дегидроэхинозидом А, отличающийся от голотурина А2 наличием 24(25)-двойной связи в боковой цепи агликона [27]. Из голотурии A. mauritiana соединение 9 было выделено в виде десульфатированного производного [26].
Работа французских ученых по гликозидам голотурии A.flammea была одним из первых примеров, когда наряду с основными гликозидами - голотуринами А (6) и В (4) был выделен целый ряд нативных минорных соединений, среди которых были идентифицированы эхинозид А (= голотурину А2) (8), 22 -гидроксиэхинозид А (=голотурину А}) (7), 24-дегидроэхинозид А (9). А также выделены новые соединения: 22-гидрокси-24-дегидроэхинозид А (10), 22-ацетоксиэхипозид А (11), 24(5)-гидрокси-25-дегидроэхинозид А (12), 25-гидроксидегидроэхинозид А (13) [19]. Голотурины групп А и В тесно связаны друг с другом биогенетически и часто этим соединениям сопутствуют их биосинтетические предшественники - 17а-дегидроксипроизводные. Группа Китагавы выделила серию таких гликозидов из голотурии Holothuria pervicax. Соединения, названные первикозидами А (14), В (15) и С (16), удалось выделить только после десульфатирования исходной суммы [37]. Голотурины группы А были выделены также из голотурии Bohadschia graffei, хотя все изученные к тому моменту голотурии рода Bohadschia содержали другую группу тритерпеновых гликозидов, отличающихся от голотуринов и называемых бохадшиозидами. Кроме того, Bohadschia graffei, собранная в различных местах, в качестве основных компонентов гликозидной фракции накапливала разные Ф голотурины группы А. Так, из собранной на Мальдивских островах В. graffei был выделен голотурии А2 (8) [38], а из сборов у берегов Северного Вьетнама -голотурии А (6) [39]. После тщательного сравнительного анализа морфологических признаков Bohadschia graffei и других голотурий рода Bohadschia, проведенного после изучения тритерпеновых гликозидов данной голотурии, ее таксономический статус был пересмотрен. В настоящее время голотурию Bohadschia graffei относят ко вновь описанному роду Pearsonothuria Levin [40]. Бохадшиозиды Для всех изученных представителей разных видов рода Bohadschia характерны тритерпеновые гликозиды, бивитгозиды, которые затем было предложено называть бохадшиозидами - по названию рода голотурий, хемотаксономическим признаком которого они являются. Соединения этой группы являются несульфатированными гликозидами, содержащими четное число (2,4 или 6) моносахаридных звеньев в углеводной цепи, при этом гексаозиды доминируют по процентному содержанию в гликозидных суммах. Бохадшиозиды имеют голостановые агликоны с 12а-окси-9(11)-сновым фрагментом, но в отличие от голотуринов не содержат 17о оксигруппы. Первым изученным представителем рода Bohadschia была голотурия В. bivittata, из которой группой Китагавы была выделена серия гликозидов, получивших названия бивиттозидов А (17), В (18), С (19) и D (20) [41,42).
Структуры тритерпеновых гликозидов голотурий отряда Dendrochirotida
Согласно системе Поусона и Смайли, к обширному отряду Dendrochirotida относятся 7 семейств, включающих 90 родов, в состав которых входит более 550 видов голотурий [4, 5]. Хотя скрининговые исследования (по результатам ТСХ) тритерпеновых гликозидов некоторых голотурий отряда Dendrochirotida были проведены еще в 70-х годах прошлого столетия, до установления структур первых нативных гликозидов голотурий этого отряда прошло гораздо больше времени, чем в случае с Aspidochirotida [45, 54]. Это связано с большой сложностью гликозидных смесей и, следовательно, с трудностью выделения индивидуальных соединений из суммы родственных веществ. Кроме того, большинство видов голотурий рода Cucumaria, в том числе промысловые виды Cucumaria japonica и Cucumaria frondosa, с которых начались исследования, содержат полярные гликозиды с одной, двумя или тремя сульфатными группами. Наличие таких группировок сильно влияет на хроматографическое поведение гликозидов и осложняет выделение индивидуальных веществ с помощью ВЭЖХ. Лишь применение современной выделительной техники и новых подходов позволило изучить гликозидный состав голотурий этого рода. Исследования ученых разных стран в течение последних пяти лет были сконцентрированы на представителях отряда Dendrochirotida, благодаря чему количество изученных представителей данного отряда значительно возросло, но все же не превышает этого показателя среди отряда Aspidochirotida. Сведения о ряде структур дендрохиротид опубликованы в обзорах [55,56]. 2.3.1. Гликозиды голотурий семейства Cucumariidae. Семейство Cucumariidae включает 30 родов голотурий [4, 5], но тритерпсповые гликозиды были выделены только из представителей шести родов {Cucumaria, Pentacta, Duasmodactyla, Staurocucumis, Hemioedema, Mensamaria). Причем род Cucumaria является наиболее изученным с химической точки зрения, т.к. известны структуры гликозидов из семи видов этого рода. Как и в случае с гликозидами голотурий отряда Aspidochirotida, изучение гликозидов представителей отряда Dendrochirotida началось с получения нативиых генинов и установления их структур. Были изучены агликоны, полученные из гликозидных фракций голотурий Cucumaria japonica [54], С. echinata [57], C.frondosa [58], Parathyona sp. [59]. Структуры лефевреозидов Ai (41), A2 (42), В (43) и С (44) устанавливались по данным FAB масс-спектров и спектров ЯМР [60]. Лефевреозиды являлись тетраозидами, три из которых были сульфатированы по С-4 первой ксилозы. Лефевреозид А! (41) представлял собой десульфатированный лефевреозид А2 (42).
Соединения 42 - 44 отличались только деталями строения боковых цепей агликонов. Cucumaria echinata В 1990 году группой Комори из С echinata были выделены шесть новых тритерпеновых гликозидов, названных кукумэхинозидами А (45), В (46), С (47), D (48), Е (49) и F (50), структуры которых устанавливались с помощью данных ЯМР и FAB масс-спектрометр и и, а также на основе анализа продуктов химических трансформаций этих соединений [61]. Кукумэхинозиды являлись тетраозидами с линейной углеводной цепью и различались числом и положением сульфатных групп. Структуры лефевреозидов Ai (41), A2 (42), В (43) и С (44) устанавливались по данным FAB масс-спектров и спектров ЯМР [60]. Лефевреозиды являлись тетраозидами, три из которых были сульфатированы по С-4 первой ксилозы. Лефевреозид А! (41) представлял собой десульфатированный лефевреозид А2 (42). Соединения 42 - 44 отличались только деталями строения боковых цепей агликонов. Cucumaria echinata В 1990 году группой Комори из С echinata были выделены шесть новых тритерпеновых гликозидов, названных кукумэхинозидами А (45), В (46), С (47), D (48), Е (49) и F (50), структуры которых устанавливались с помощью данных ЯМР и FAB масс-спектрометр и и, а также на основе анализа продуктов химических трансформаций этих соединений [61]. Кукумэхинозиды являлись тетраозидами с линейной углеводной цепью и различались числом и положением сульфатных групп. Голотурия С. frondosa, собранная у Кольского побережья Баренцева моря, с которой работали сотрудники нашего института, в качестве основного компонента гликозидной фракции также содержала фрондозид А (51). Наряду с основным 52.R1 = H;R2 = гликозидом было выделено минорное соединение - фрондозид А (54), представляющий собой моносульфатированиый тетраозид, отличающийся от фрондозида А (51) только отсутствием терминальной ксилозы [65]. В подфракции наиболее полярных трисульфатированных гликозидов основным компонентом являлся фрондозид С (55), структуру которого установили на основе изучения его десульфатированного производного 56 [66]. Агликон фрондозида С (55) принадлежал к неголостановому ряду, в отличие от большинства агликонов гликозидов голотурий. Структура 56 была однозначно определена по спеїсграм 1 и 2 D ЯМР, а также подтверждалась данными FAB масс-спектров. Конфигурации асси метрических центров при С-20 и С-22 в агликоне фрондозида С (55) были определены как R [66]. В статье автора из Турции, вышедшей в 2001 году в Индийском химическом журнале, описывались структуры двух моносульфатированных пентаозидов, фрондозидов Еі (57) и Е2 (58) и трисульфатированного пентаозида, фрондозида F (59), выделенных из С. frondosa [67]. Соединения 57 и 58 имели одинаковые углеводные цепи, а их агликоны отличались положением двойных связей в ядре и боковой цепи. Структуры гликозидов устанавливались на основе анализа 13С ЯМР спектров смеси двух веществ.
Утверждалось, что гликозид 57 идентичен известному кукумариозиду Аг-2 (64) из голотурии Cucumaria japonica [68] и характеризуется наличием 7(8)- и 25(26)-двойных связей, а гликозид 58 имеет 9(H)- и 24(25)-двойные связи. Однако, учитывая то, что соотношение между компонентами смеси было приблизительно 1:1.2, точное установление структур только по 3С ЯМР спектру становится невозможным, так как вероятность обратной комбинации двойных связей абсолютно Структура трисульфатированного пентаозида, фрондозида F (59) также представляется сомнительной, т.к. соединение 59 имеет 18(22)-лактон, вместо обычного для голостановых гликозидов 18(20)-лактона, и насыщенное полициклическое ядро. Такие уникальные структурные особенности ранее не обнаруживались в тритерпеновых гликозидах голотурий. Несмотря на то, что автор ссылается на использование современных физико-химических методов установления структур, экспериментальные данные вызывают много вопросов. Например, в FAB масс-спектре 59 отсутствовал пик псевдомолекулярного иона, а в COSY ЯМР спектре не наблюдалось корреляции между протонами при С-8 и С-9. Можно предположить, что автор работал с очень сложной смесью гликозидов, имеющих как 7(8)-, так и 9(H)-двойные связи в агликонах, что могло привести к "ненакоплению" их сигналов в 13С ЯМР спектрах. Cucumaria japonica Из тихоокеанской дальневосточной голотурии Cucumaria japonica были выделены тринадцать гликозидов - кукумариозидов семи различных групп. В пределах одной группы вещества отличались строением агликонов, а различия между группами кукумариозидов заключались в деталях строения их пентасахаридных углеводных цепей, а также в количестве и положении сульфатных групп. Структуры гликозидов устанавливались с помощью 1 и 2 D ЯМР-спектроскопии, различных вариантов масс-спектрометрии (LSIMS, FAB). Для ряда веществ проводился моносахаридный анализ углеводных цепей, а также метилирование с последующим метанолизом, распад по Смиту и сольволитическое десульфатирование. Группы кукумариозидов А0, Аь А2 и А4 - моносульфатированные гликозиды. Третьим моносахаридным остатком кукумариозидов группы А0 была ксилоза. Все соединения этой группы (кукумариозиды Ао-1 (60), Ао-2 (61), Ао-3 (62)) имели голостановые агликоны с 7(8)-двойной связью в полициклическом ядре и функциональной группой в положении 16. У кукумариозидов Ао-1 (60), А0-2 (61) этой группой была О-ацетатная, а у соединения 62 - кето-группа. Кроме того, вещества отличались строением боковых цепей [69, 70].
Гликозиды голотурий семейства Sclerodactylidae
Кроме основных компонентов, в гликозидной фракции Е. fraudatrix содержится большое количество минорных. Кукумариозид А[ (113) [94], выделенный из подфракции наименее полярных гликозидов, представлял собой десульфатированное производное кукумариозида Gj (109). Все кукумариозиды группы G имели одинаковые линейные тетрасахаридные углеводные цепи, с сульфатной группой при С-4 остатка ксилозы и терминальным остатком 3-О-метил ксилозы и отличались друг от друга структурами агликонов. Наиболее интересным и необычным было строение кукумариозида G2 (100) [95, 100], который имел неголостановый агликон с 18(16)-лактоном и укороченной боковой цепью. Второй минорный гликозид группы G - кукумариозид G3 (114) [90] имел агликон с диеновым фрагментом в боковой цепи и i/wc-конфигурацией 22(23)-двойной связи. Кукумариозид G4 (115) характеризовался наличием 23(24)-двойной Кроме несульфатированных и моносульфатированных гликозидов из Е. fraudatrix были выделены также два дисульфатнрованных соединения, названные кукумариозидами Fj (117) и F2 (118) [94]. По сравнению с кукумариозидами группы G они содержали дополнительную сульфатную группу при С-6 третьего моносахаридного остатка (глюкозы). Eupentacta pseudoquinquesemUa Вторым изученным видом рода Eupentacta была Е. pseudoquinquesemUa, собранная у Курильских островов. В гликозидной фракции этой голотурии были идентифицированы кукумариозиды ( (111) и Н (112) [89]. Neothyone gibbosa Из голотурии Neothyone gibbosa, собранной в Калифорнийском заливе, группой мексиканских ученых был выделен единственный гликозид, названный ими неотиозидом А [102], идентичный по структуре первикозиду А (14), выделенному группой Китагавы из Holothuria pervicax [37]. В 1996 году вышла вторая статья этой группы, в которой сообщалось о выделении еще одного гликозида из голотурии Neothyone gibbosa - неотиозида В (119), который представлял собой моносульфатированный биозид, с углеводной цепью, аналогичной цепи голотуринов группы В [103]. Обнаружение в представителе отряда Dendrochirotida соединений, обладающих специфическими чертами таксономических маркеров отряда Aspidochirotida - необычный, хотя и не единственный случай параллелизмов в структурах гликозидов голотурий. В нашей лаборатории был изучен гликозидный состав двух представителей подсемейства Cladolabinae, голотурий Cladolabes sp. и Cladolabes bifurcaius.
Из этих двух видов были выделены два новых тритерпеновых гликозида, названных кладолозидами А (120) и В (121), различающихся строением несульфатированных углеводных цепей [104]. Кладолозид А (120) - тетраозид, кладолозид В (121) -пентаозид, агликоны кладолозидов А (120) и В (121) идентичны агликонам голотоксинов [52, 53]. Кладолозиды А и В считаются хемотаксономическими маркерами рода Cladolabes, Впервые о гликозидах из голотурий рода Psolus сообщили канадские авторы, которые в 1983 году выделили основной компонент гликозидной фракции голотурии Psoitis fabricii, собранной в заливе Святого Лаврентия, и назвали его псолютурином А (122) [105]. Позднее в нашем институте из этой же голотурии, но собранной у Курильских островов, были выделены два гликозида: псолюсозид А (123) [106], являвшийся основным компонентом гликозидной фракции и минорный псолюсозид В (124) [107]. Структура углеводной цепи псолюсозида А (123) устанавливалась на основе сравнения ЯМР спектров 123 со спектрами его десульфатированного производного, продуктов частичного кислотного гидролиза, а также данных моносахаридного анализа и метилирования, что позволило однозначно определить последовательность моносахаридных звеньев в углеводной цепи. Канадские химики определяли строение углеводной цепи псолютурина А (122) только на основе ЯМР и масс-спектрометрии. Учитывая то, что спектр десульфатированного производного псолютурина А (122) практически полностью совпадал со спектром десульфатированного производного псолюсозида А (123), можно предположить, что они ошиблись, определяя последовательность моносахаридных звеньев. В 1997 году из другой голотурии рода Psolus — P. eximius также сотрудниками ТИБОХ был выделен несульфатированный тетраозид с линейной углеводной цепью - эксимисозид А (125), а псолюсозиды А (123) и В (124) в этой голотурии идентифицированы не были [108]. Psolus patagonicus В 2001 году вышла статья аргентинской группы по гликозидам голотурии Psolus patagonicus, собранной у побережья Аргентины. Из этой голотурии был выделен новый дисульфатированный тетраозид - патагоникозид А (126) с необычным для дендрохиротид агликоном [109]. Агликон характеризовался наличием двух гидроксильных групп в 12а- и 17а- положениях, что является характерным признаком гликозидов голотурий семейства Ilolothuriidae (отряд Aspidochirotida). Из настоящего литературного обзора видно, что гликозиды голотурий отряда Dendrochirotida характеризуются значительно большим структурным разнообразием, чем гликозиды Aspidochirotida. Кроме того, между представителями близкородственных таксонов зачастую наблюдаются значительные различия в структурах гликозидов.
Так, для различных видов голотурий семейств Cucumariidae и Psolidae характерен свой видоспецифичный набор гликозидов, в отличие от аспидохиротид, где специфичность гликозидов проявляется на уровне родов или более крупных таксонов. В то же время гликозиды Mensamaria intercedens, Neothyone gibbosa и Psolus patagonicus обладают чертами, характерными для гликозидов голотурий отряда Aspidochirotida. Наличие таких параллелизмов, большой разброс в структурах гликозидов Dendrochirotida, а также высокая степень сложности гликозидного состава многих видов дендрохиротид значительно осложняет использование тритерпенопых гликозидов голотурий этой группы в целях систематики, однако, не исключает такой возможности [6, 110, 111]. Как говорилось во введении к диссертации, класс I lolothuroidca включает семь отрядов, два из которых: Aspidochirotida и Dendrochirotida, химически изучались, а голотурии остальных пяти отрядов практически не изучены. Из голотурии Paracaudina ransonetii (сем. Caudinidae, отр. Molpadndae) был выделен основной компонент гликозидной фракции - каудинозид А, для которого была установлена только структура агл икона, которым оказался голотоксиногенин (127), и определен моносахаридный состав: ксилоза, хиновоза, глюкоза, З-О-м етил глюкоза в соотношении 1:1:3:11112]. Большинство представителей многочисленного рода Holothuria - обитатели тропической зоны Мирового Океана, и только некоторые виды населяют субтропические и умеренные воды. Атлантическая Holothuria forskalii, обитающая у берегов Испании и Португалии, - единственный химически изученный представитель этой группы видов, причем ее гликозиды характеризовались необычными для других Holothuria структурами [44]. Виды рода Holothuria населяющие Средиземноморье, также до сих пор оставались неизученными. Поэтому выделение их гликозидов было интересно в плане сравнения их структур со структурами гликозидов тропических представителей рода Holothuria. Было проведено сравнительное изучение гликозидного состава трех видов голотурий: Holothuria polii, Holothuria tubulosa и Holothuria sp., собранных в бухте Капо Мицено (Средиземное море) недалеко от г. Неаполя. Из суммарных гликозидных фракций голотурий Н. polii и Н tubulosa были выделены по две подфракции - голотурины групп А и В. Гликозидная фракция Holothuria sp. была представлена только голотуринами группы А.
Гликозиды голотурий семейства Cucumariidae отряда Dendrochirotida
Благодаря восточной медицине, издавна известны ценные свойства, которыми обладают продукты из голотурий. Поэтому массовые виды, в том числе принадлежащие к роду Cucumaria, являются объектами промысла в ряде регионов. Давно известно, что «целебное» действие на организм человека обусловлено наличием в голотуриях тритерпенових гликозидов, проявляющих различную биологическую активность. В нашем институте был детально изучен гликозидный состав дальневосточной промысловой голотурии Cucumaria japonica [68 - 75], а также биологическая активность кукумариозидов различных групп. Более того, на основе фракции моносульфатированных кукумариозидов группы Аг был разработан «препарат КМ», применяющийся в ветеринарии для лечения алеутской болезни норок и как профилактическое средство для повышения резистентности и увеличения продуктивности норок [128, 129]. На основе гликозидов из этой голотурии в ТИБОХе продолжают разрабатываться препараты, предназначенные для применения не только в ветеринарии, но и в медицине. Аналогичная ситуация наблюдается и с промысловой голотурией Cucumaria frondosa, обитающей в морях Северной Атлантики и Западной Арктики. В г. Стонингтон, штат Мэн (США) фирмой «Coastside Bioresources» из С. frondosa изготавливаются многочисленные лекарственные препараты и пищевые добавки, предназначенные как для человека, так и для животных. В их числе пищевые добавки «ArthriSea», «SeaCuMax», запатентованные в США и применяемые для профилактики и облегчения течения артритов и других заболеваний костной и хрящевой тканей у людей. Такие препараты как «Sea Jerky», «Sea-Bones», «SeaFlcx», «EquuSea» разработаны для животных (собак, кошек, лошадей) с возрастными нарушениями двигательной системы. Поэтому, в связи с активным использованием экстрактов С. frondosa в качестве сырья для изготовления различных пищевых добавок и лекарственных препаратов, стало актуальным детальное изучение гликозидного состава этого вида, а также биологической активности, проявляемой как индивидуальными соединениями, так и их композициями.
Голотурия Cucumaria okhotensis является массовым видом, обитающим в Охотском море у берегов Камчатки. Этот вид был описай совсем недавно [130] и его гликозидмый состав еще не изучался. Выделение гликозидов голотурии С. okhotensis было важно не только с научной, но и с прикладной точки зрения, в связи с выяснением возможности использования разных видов дальневосточных голотурий рода Cucumaria в качестве сырья для изготовления медицинских и ветеринарных препаратов. 3.2.2. Гликозиды голотурии Cucumaria frondosa К началу данной работы были достоверно известны структуры только 5 гликозидов голотурии С. frondosa, среди которых был основной компонент гликозидной фракции - фрондозид А (51) [62], а также минорные фрондозиды Aj (54) [65], В (53) [64], С (55) [66] и D (52) [63]. КВ то же время, гликозидная фракция голотурии Cucumaria frondosa представляет собой сложную смесь, дающую на ТСХ целый ряд пятен, соответствующих различным группам гликозидов, что характерно для всех изученных представителей рода Cucumaria. Группа фрондозидов Аз включала моносульфатированные гликозиды, группы фрондозидов А3/А6 объединяли дисульфатированные гликозиды, а группа фрондозидов А7 содержала гликозиды с тремя сульфатными группами. В ходе данных исследований, был детально изучен состав гюдфракций моносульфатированных и трисульфатированных фрондозидов (установлены структуры 15 соединений, 12 из которых - новые), также установлена структура нового дисульфатированного фрондозида А3-1 (157), а гликозиды 51 и 54 (выделенные в индивидуальном виде при разделении гликозидной суммы на подфракции) идентифицированы по данным ЯМР и физическим константам с известными фрондозидами А и At. Моносульфатированные фрондозиды группы Аг При разделении гликозидов С. frondosa на колонках с силикагелем, была выделена подфракция минорных моносульфатированных гликозидов, представляющая собой индивидуальное пятно на ТСХ и получившая название фрондозидов группы Аг, по аналогии с гликозидами голотурии С. japonica. С помощью ВЭЖХ на колонках с обращенной фазой, из этой подфракции было выделено 7 индивидуальных соединений: фрондозиды Аг-1 (144), А2-2 (145), Аг-3 (146), А2-4 (147), Аг6(148), Аг7 (149), А2-8 (150) [131,132]. ЯМР спектры углеводных частей этих веществ практически совпадали между собой (табл. 21, стр. 99 — поэтому приведен спектр углеводной цепи только одного компонента этой группы - фрондозида А2-1 (144)) и со спектрами кукумариозида Аг-2 (64), основного компонента группы А2 из голотурии С. japonica [68], что говорило об идентичности их разветвленных пентасахаридных углеводных цепей, содержащих одну сульфатную группу.
Такое строение углеводных цепей фрондозидов 144-150 подтверждалось наличием пяти сигналов аномерных атомов углерода в ЯМР ,JC и DEPT спектрах и соответствующих им сигналов аномерных протонов в ЯМР Н спектрах с КССВ, характерными для /t-гликозидных связей [116]; характерным сдвигом сигнала четвертого атома углерода остатка первой ксилозы в слабое поле до 75.6 м.д из-за присутствия сульфатной группы; наличием в НМВС и NOESY спектрах корреляций, соответствующих последовательности связей моносахаридных остатков. Сигналы полициклической системы в ЯМР спектрах фрондозида A;-I (144) СН, ,3С, HSQC, НМВС, COSY, NOESY) были сходны с соответствующими синалами в спектрах кукумариозида A2-2 (64) из голотурии Cucumaria japonica [68] {табл. 22, стр. 100), в то время как сигналы боковых цепей в ЯМР спектрах этих соединений отличались. В ЯМР 13С спектре 144 наблюдались сигналы, характерные для 24(25)-двойной связи (123.92 (С-24) и 132.01 (С-25) м.д.), а в ЯМР Н спектре - соответствующий сигнал протона Н-24 при 5.14 (м) м.д. Положение двойной связи при С-24 подтверждалось и наличием в ЯМР ,3С и Н спектрах сигналов терминальных метальных групп: при 17.50 (С-26) и 1.63 (с, Нз-26) м.д. и при 25.53 (С-27) и 1.66 (с, Н3-27) м.д., соответственно. Данные MALDIOF (+) масс-спектрометрии высокого разрешения позволили установить брутто-формулу фрондозида А2-1 (144) как Cs iC SNa по наличию пика псевдомолекулярного иона [М + Na]+c m/z 1341.5098. В MALDIOF (-) масс-спектре наблюдались пики псевдомолекулярных ионов с m/z: 1295 [М - Na]" и 1296 [М - Na + Н]\ а также пики фрагментарных ионов с m/z 1163 [М - Na - ксилоза + Н]", с m/z 1119 [М - Na - З-О-метилглкжоза + Н]\ наблюдаемые из-за отрыва терминальных моносахаридных остатков. Таким образом, фрондозид Аг-1 (144) представляет собой 3-0-{3-0-метил-(3-В-глюкопиранозил-(1- 3)-р-Б-глюкопиранозил-(1- 4)-[р-0-ксилопиранозил-(1-»2)]-р-0-хиновопиранозил-(1-»2)-4-0-натрий сульфат-р-О-ксилопиранозил}-голоста-7,24-диен-ЗР-ол-16-он. Фрондозид А2-2 (145) Сигналы атомов углерода полициклической системы в спектре ЯМР 13С фрондозида Аг-2 (145) были близки к соответствующим сигналами в спектре кукумариозида А7-З (72), выделенного из Cucumaria japonica [75], что говорило об отсутствии заместителей в голостановом ядре агликона фрондозида А2-2 (145). В то же время, сигналы боковой цепи в ЯМР 13С и !Н спектрах фрондозида А2-2 (145) отличались от аналогичных сигналов в спектрах известных гликозидов голотурий. В ЯМР С и DEPT спектрах 145 присутствовали сигналы четвертичных атомов углерода при 144.50 (С-25) и 200.32 (С-24) м.д., сигнал метилсиовой группы при 124.80 (С-26) м.д. и мстильной группы при 17.58 (С-27) м.д. (табл. 23, стр. 101). Наличие кросс-пиков в IIMBC спектре фрондозида А2-2 между протонами метиленовой и метильной групп и сигналом при 200.32 м.д., характерным для кето-группы, указывало на наличие в боковой цепи 145 кето-группы при С-24 и сопряженной с ней терминальной двойной связи - уникального структурного фрагмента для гликозидов голотурий.