Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1 Микроорганизмы - продуценты белка 8
1.2 Микробные продукты и субстраты для их получения 20
1.3 Представители семейства гречишные как источники сред для получения кормового белка 31
1.4. Факторы, влияющие на синтез и секрецию белков дрожжами 37
2. Собственные исследования 44
2.1. Материал и методы исследования . 44
2.2. Результаты исследований и их обсуждение 46
2.2.1. Выделение и идентификация дрожжей из дрожжесодержащих материалов 46
2.2.2. Химический состав и питательная ценность зеленой массы горца сахалинского в условиях Северной Осетии 90
2.2.3. Технология приготовления питательной среды на основе горца сахалинского 96
2.2.4. Получение микробной биомассы на питательной среде их горца сахалинского 103
2.2.5. Оценка экономической эффективности использования горца сахалинского для приготовления питательных сред при производстве дрожжевого белка. 111
Заключение 114
Выводы 119
Предложения производству 120
Список использованной литературы 121
- Представители семейства гречишные как источники сред для получения кормового белка
- Факторы, влияющие на синтез и секрецию белков дрожжами
- Химический состав и питательная ценность зеленой массы горца сахалинского в условиях Северной Осетии
- Получение микробной биомассы на питательной среде их горца сахалинского
Введение к работе
Культивирование микроорганизмов с целью получения питательных веществ для человека и животных представляет собой пример раннего и актуального до сих пор внедрения в промышленное производство методов биотехнологии.
Необходимость использования данных биотехнологических процессов определяется остротой насущных проблем современности: экологической, продовольственной, энергетической. Очевидна целесообразность применения в пищу веществ, имеющих постоянный состав и высокую биологическую ценность, которые можно получать в строго контролируемых условиях. Однако потенциал этой отрасли производства еще далеко не исчерпан. Ее развитие лимитируется, главным образом, экономическими факторами: стоимость получения микробных продуктов, не уступающих по питательной ценности традиционным, зачастую превышает таковую натуральной сельскохозяйственной продукции. Фактор флуктуации стоимости соевых бобов - альтернативного источника кормового белка - вместе с относительно высокой ценой на большинство субстратов для микробного синтеза делают производство микробной биомассы (так называемого белка одноклеточных), как правило, рискованным. Но, тем не менее, на разработку технологий получения микробных белков в течение последних нескольких десятилетий направлены значительные усилия исследователей.
Существует много микроорганизмов, которые превращают неорганический азот в органическую форму за счет различных источников энергии.
Микроорганизмы очень быстро растут. Поросенок или цыпленок могут удваивать вес за 1 месяц, а дрожжевая клетка за 3 часа. Причем около половины микробной клетки, растущей при соответствующих условиях, состоит из белка. Высокие скорости синтеза белка микробной системой составляют самое большое преимущество в сравнении с традиционным сельским хозяйством.
4 Микроорганизмы можно выращивать на дешевом, непищевом субстрате, каким служат клетчатка, метанол, водород и др. Биомасса может быть источником белков, липидов, полисахаридов, витаминов, каратиноидов.
Изучена способность продуцировать клеточные белки водорослей, дрожжей, грибов, бактерий. Однако в соответствии с комплексом требований, предъявляемых к микроорганизмам-продуцентам (высокая скорость роста, устойчивость к инфекциям, легкая осаждаемостъ, эффективность утилизации источников энергии, высокое качество белка), наибольшим потенциалом, по-видимому, обладают дрожжи. Эта группа микроорганизмов используется для получения целых клеток (корма, пища), макрокомпонентов (белки, липиды, ферменты, нуклеиновые кислоты), экстрагируемых соединений (коферменты, витамины), продуктов деструкции (аминокислоты, нуклеотиды), продуктов метаболизма клеток (этанол, глицерин, углекислота, органические кислоты и др.).
В сравнении с любыми другими микроорганизмами дрожжи играют значительную роль в пищевой промышленности. В последние годы производство дрожжевых продуктов расширилось в результате внедрения новых продуцентов ценных веществ, при культивировании их на дешевом сырье.
Дрожжи очень широко распространены в природе и в окружающей человека среде. Они активно размножаются в тех субстратах, где имеются доступные растворимые источники углерода - простые сахара, спирты, органические кислоты, т.е. в соках, сиропах, на плодах, в нектаре цветов, в сокотечениях деревьев, на поверхности листьев, в воде и почве.
Известно достаточно фактических данных о положительном влиянии дрожжей на нормофлору кишечника. Дрожжи обогащают ферментируемый субстрат незаменимыми аминокислотами, витаминами, органическими кислотами и другими биологически активными веществами, а клеточные стенки дрожжей, содержащие полимеры глюкозы и маннозы, обладают лакто -
5 и бифидогенными, а также сорбционными свойствами и при попадании в кишечник стимулируют рост собственной микрофлоры, выводят оттуда патогенные бактерии и их токсины.
Исходя из изложенного, актуальность выделения и изучения новых, высокопродуктивных штаммов разных видов дрожжей и изыскание новых источников субстрата для их культивирования очевидна, а само направление исследований - перспективно.
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилось выделение из различных природных источников и идентификация штаммов местных видов дрожжей; разработка технологии их выращивания на питательной среде из горца сахалинского (Poligonum sachalinense Fr. Schmidt) для получения микробной биомассы.
В соответствии с поставленной целью были определены задачи:
- выделить из природных микробиоценозов высокопродуктивные штаммы
дрожжей, способных расти на растительных субстратах;
- идентифицировать видовую принадлежность выделенных штаммов
дрожжей и изучить их характеристики;
- изучить химический состав горца сахалинского;
разработать технологию производства питательной среды на основе зеленой массы горца сахалинского;
подобрать оптимальный состав питательных сред для максимального накопления биомассы выделенными местными штаммами идентифицированных видов дрожжей;
- определить уровень белка в биомассе местных штаммов
идентифицированных видов дрожжей;
изучить влияние температуры культивирования на рост и содержание клеточного белка в дрожжах;
установить влияние объема посевного материала на рост дрожжей рода Metschnikowia;
- подобрать оптимальные режимы культивирования местных штаммов
идентифицированных видов дрожжей.
Научная новизна работы:
- впервые в условиях РСО-Алания выделены и идентифицированы
местные штаммы разных видов дрожжей и изучены их видовые
характеристики;
показана возможность эффективного использования зеленой массы горца сахалинского в качестве растительного сырья для питательной среды с целью получения биомассы дрожжей;
установлена перспективность использования для получения микробной биомассы на питательной среде из зеленой массы горца сахалинского местных штаммов дрожжей рода Metschnikowia, способных интенсивно накапливать биомассу;
впервые во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) задепонированы культуры 7 штаммов 3 видов дрожжей: Metschnikowia pulcherrima, Hanseniaspora uvarum, Cryptococcus flavescens, идентифицированных в РСО-Аяания.
Практическая значимость работы:
- получены местные штаммы дрожжей рода Metschnikowia, обладающие
высокой продуктивностью и скоростью роста на среде из горца сахалинского;
- разработана технология производства питательной среды на основе
нетрадиционного растительного сырья - горца сахалинского,
интродуцированного в республику с о. Сахалин, урожайность зеленой массы
которого в агроклиматических условиях Северной Осетии составляет до 1500
ц/га;
- установлена экономическая эффективность использования для
культивирования дрожжей питательной среды из горца сахалинского, по
сравнению с другими видами сырья растительного происхождения.
7 Положения выносимые на защиту:
1. Морфологические, биохимические и культуральные свойства,
идентифицированных местных штаммов видов дрожжей: Metschnikowia
pulcherrima, Hanseniaspora uvarum, Cryptococcus flavescens.
2. Показатели химического состава зеленой массы горца сахалинского в
условиях РСО-Алания.
3. Технология приготовления питательной среды для производства
биомассы микроорганизмов на основе зеленой массы горца сахалинского.
4. Технологические свойства местных штаммов дрожжей вида
Metschnikowia pulcherrima.
Апробация работы. Основные положения работы доложены на Международной научно - практической конференции «Современные проблемы формирования стратегии устойчивого развития регионального АПК» (Владикавказ, 2003), а также на научных конференциях Горского ГАУ в 2003 -2006 гг.
Представители семейства гречишные как источники сред для получения кормового белка
Некоторые авторы отмечают, что корма животного происхождения и высокобелковые корма растительного происхождения (жмыхи и шроты) являются дефицитными и дорогостоящими. Концентраты, занимающие в структуре рационов большую часть, часто бывают неполноценными по протеину и лимитирующим аминокислотам, а традиционные зеленые корма (люцерна, клевер и другие) малоэффективны, нужен поиск новых нетрадиционных кормовых культур, необходимых для балансирования рационов по протеину, лизину, метионину и другим питательным веществам (А.Х. Караев, И.Д. Тменов,1998).
Род Poligonum был впервые описан Линнеем (Linnaeus,1753). Он является самым многочисленным родом семейства Гречишных (Poligonaceae) и включает в себя 200 видов.
А.А. Татаринова (1985) А.П. Лаханов (І995) в разные годы изучали разные виды горцев различных экологических зон возделывания для рекомендации к использованию в качестве кормового растения в кормлении сельскохозяйственных животных и отметили хорошие их кормовые достоинства. В 70-80-е годы наблюдения за динамикой их сезонного развития и накоплением биомассы проводились И.А. Берзаком (1988).
Ряд авторов в разные годы также занимались изучением разных видов горца (ЮЛ. Жуков, Р.А. Доценко, 1989; Л.П. Недварас, В.И. Марчюленис, 1985; Н.П. Демидас, 1985; А.И. Лашин, 1988; Ю.С. Золотухина, 1988; П.В. Капцов, Р.А. Доценко, 1987; Ф.А. Гусев, 1985; И. Нечитайло, 1985; Л.А.Татаринова, 1985; Т.Д. Бысова, 1990).
Изучением горца забайкальского занимались В.М. Кузнецов (1957, 1959), А.Ф. Захарова (1957), А.И. Сметанникова (1963). Исследования проводились ими с целью изучения биологических физиологических и анатомических особенностей горца. Изучалась динамика роста растений в высоту, прохождение фенологических фаз, углеводный обмен, содержание пигментов в листьях, продуктивность надземной массы, урожай семян и некоторые другие особенности растений. Еще раньше, в 1952 г, испытание горца забайкальского в культуре как дубильного растения начал Ф.С. Первухин (1960).
Горец сахалинский или сахалинская гречиха, как отмечают в своей работе Б.Г. Цугкиев, А.Л. Комжа (1999), интродуцирована в ботанический сад Горского ГАУ из Ставропольского ботанического сада. Б.Г. Цугкиев провел работу по внедрению этой нетрадиционной культуры в кормопроизводство. Многолетние наблюдения показали, что горец сахалинский по своим технологическим и экономическим параметрам является одной из наиболее перспективных кормовых культур (Б.Г. Цугкиев и др., 1992; А.И. Тютюнников и др., 1996).
Цугкиевым Б.Г. и Гревцовой С.А. (1997) было исследовано 6 видов горцев: горец сахалинский, горец Вейриха, горец мясокрасный, горец перечный, горец растопыренный, горец птичий в разных фазах развития. По данньш этих авторов у разных видов горцев содержание «сырого» протеина в натуральном состоянии колеблется от 1,5 % до 3,07 % в фазе бутонизации, наибольшее его содержание отмечено в горце сахалинском - 3,07 %, а наименьшее в горце мясокрасном - 1,51 %. Содержание «сырой» клетчатки в наибольшем количестве установлено в горце сахалинском - 11,6 % (фаза бутонизации), а наименьшее - в горце растопыренном - 1,38 % (фаза бутонизации). Количество кальция колеблется в пределах: от 0,18 %(фаза цветения) в горце сахалинском, до 1,1 % в горце перечном (фаза цветения). Наличие сухого вещества колеблется от 9,00 % (горец растопыренный) до 30,70 % (горец сахалинский) в фазе бутонизации. Этими же авторами установлено, что при повышении содержания сухого вещества повышается также процентное содержание клетчатки, в зеленой массе всех видов горцев, с резким уменьшением содержания протеина - до 0,38 %.
Аминокислотный состав белка зеленой массы горцев включает в себя 18 аминокислот. Белок горца сахалинского оказался наиболее богат лизином и метионином (АЛ. Якимов, 1965).
По данным других авторов в период уборочной спелости в сухом веществе листьев содержится: 19,3-28,1 % протеина: 12,7-14,0 % клетчатки; 3,0-10,6 % Сахаров; 3,6-9,4 % золы; 52,3-63,8 % БЭВ. В золе содержится: 16,0-25,2 % калия; 9,9-34,9 % кальция; 6,7-16,0 % фосфора. Аскорбиновой кислоты содержится в листьях 500 мг/ %; в стеблях - 142 мг/% (Т.К. Чумбалов., 1969; АЛ. Якимов, 1965,1966).
Наибольшее количество минеральных элементов в зеленой массе горцев содержится на ранних фазах развития, уменьшаясь к концу вегетативного периода. Количество витаминов в вегетативных частях горцев изменяется в процессе развития растений. Наибольшее содержание рутина наблюдается в фазе бутонизации (у горца Вейриха 1,7 %, горца сахалинского 1,1 %), уменьшаясь почти вдвое у горца Вейриха, в 4 раза у горца сахалинского к концу вегетативного периода (АЛ. Якимов, 1965). Максимальное содержание аскорбиновой кислоты в зеленой массе различных видов горцев отличается в различные фазы вегетации: у горца Вейриха - в фазе бутонизации - 547,4 мг/% у горца сахалинского в фазе цветения 872,9 мг/% (А.П. Якимов, 1965; А.И. Тютюнников и др., 1996). Из всех видов горцев, горец сахалинский и горец Вейриха получили наибольшее распространение в сельском хозяйстве. Горец сахалинский обладает мощной корневой системой. Стебли полые, ветвистые. Листья на коротких черешках, с сердцевидным или округлым основанием. Соцветия - короткие пазушные метёлки. Плод темно-бурый орешек. Растение - холодо - и морозоустойчивое, под снежным покровом хорошо зимует, быстро растущее (СИ. Лебедев, 1982). Может быть использован в борьбе с эрозией почв и при создании снегозадерживающих кулис (П.П. Джунковская, 1972). Анализ химического состава в фазе вегетации (в воздушно-сухом состоянии) выявил 12,57 % «сырого» протеина, 3,55 % «сырого» жира, 25,55 % «сырой» клетчатки, 6,36 % «сырой» золы и 51,36 % - БЭВ. Это растение хорошо поедается в молодом возрасте животными и хорошо силосуется.
Горец сахалинский распространен в восточной Азии, на Сахалине, преимущественно по берегам рек, вдоль дорог. Иногда образует большие заросли. Растение морозостойкое, светолюбивое, быстрорастущее, высокоурожайное по массе, а также сравнительно устойчивое к болезням и вредителям. Успешно произрастает на различных типах почв, исключая кислые и заболоченные. В начале июня формирует большую укосную массу, а через два месяца дает второй урожай (Г.М. Балабас, 1960; A.M. Черняева, 1960; В.М. Кудрявцева, 1964; А.И. Тютюнников, Б.Г. Цугкиев, 1995).
Часто горец сахалинский называют "кислицей" употребляют в пищу в сыром или вареном виде её побеги, которые благодаря содержанию в них значительного процента щавелевой кислоты служат хорошим противоцинготным средством (Фон-Фрикен, 1895).
Факторы, влияющие на синтез и секрецию белков дрожжами
Микроорганизмы обладают исключительно высокой способностью изменять свой обмен в зависимости от состава питательной среды и условий культивирования. Влияя на рост и интенсивность обменных процессов, происходящих в организме, эти факторы определенным образом сказываются на физиологическом состоянии клетки, на ее биосинтетической деятельности, на количестве и химическом составе синтезируемых продуктов. Для образования различных продуктов метаболизма, в том числе ферментных белков, токсинов, антибиотиков и других белоксодержащих соединений, организму нужны вещества, которые клетка сама производить не может, но они необходимы для синтеза ее метаболитов. Это источники азотного и углеродного питания, некоторых ростовых факторов, аминокислот, микроэлементов. Кроме того, необходима определенная аэрация, кислотность среды, температура культивирования, а также ряд других факторов, способствующих образованию и выделению того или иного продукта жизнедеятельности микроорганизма (Г.А. Салохина, Н.В. Образцова и др., 1991).
Микроорганизмы в процессе жизнедеятельности используют разнообразные источники азота: как неорганические (аммонийные, нитратные соли), так и органические (белки, продукты их гидролиза, различные экстракты растительного и животного происхождения и др.)- В зависимости от степени и легкости их усвоения, от специфического свойства изменять физико-химические условия среды в процессе роста микроорганизмов во многом может зависеть количество образованного белка.
Как показали исследования, дрожжи Cryptococcus laurentii способны усваивать в качестве единственного источника азота как неорганические, так и органические азотсодержащие соединения. Однако образование и секреция внеклеточного белка происходили лишь при определенном их сочетании. Исключение из среды одной из форм приводило к полному подавлению биосинтеза и секреции белка дрожжами Cr. laurentii. Наиболее высокая протеинпродуцирующая их способность была отмечена при использовании в качестве основного неорганического источника азота сульфата аммония (Г.А. Салохина, Н.В. Образцова и др., 1991).
Литературные данные о стимулирующей роли отдельных источников азотного питания при образовании белков, например ферментов целлюлолитического комплекса, несколько разноречивы. Так, ускорение биосинтеза этих ферментных белков грибами Aspergillus niger (Simpson , 1959) и Myrothecium verrucaria .B. Фениксова, И.В. Улезло, 1965) было отмечено на среде с дрожжевым и кукурузным экстрактами. В то же время эти же источники азота подавляли образование указанных белков у культур Chaetomiumglobosum и Ch. indianum(R.G. Rose, S.N. Basu, 1958).
Причина стимуляции синтеза белков сложными органическими азотсодержащими соединениями еще не совсем ясна. Предполагается, что это связано с обеспечением клеток особо важными индивидуальными аминокислотами, пептидами, структурной их особенностью (В. Лили, Т. Барнет, 1963). Так, стимулция синтеза и секреции мембранно-связанной инвертазы у дрожжей S. cerevisiae была отмечена при использовании в качестве источника азота циклического аргинил-пролина и аргинил-аргинина, но не их дипептидных форм (CD. Litchfield, J.M. Prescott, 1970). Ряд авторов отмечали стимулирующее влияние отдельных аминокислот (Р.П. Зельтии, 1970; Р.В. Фениксова, 1973; Ж.К. Лория и др., 1977). Например, наиболее высокая протеинпродуцирующая способность дрожжей Trichosporon sp. Х-12 (до 700 мг/г сухих клеток) была обнаружена при использовании в качестве источника азота глицина, аргинина либо аспарагина (М. Akaki., Y. Nishida., 1985). Существует мнение, что отдельные органические азотсодержащие соединения могут вызывать и изменения в мембранных структурах клеточной стенки, приводящие к повышению ее проницаемости для белков (D.A.Yphantis, 1967). Так, И.С. Кулаев с соавторами (1985) связывают усиление экспорта белков из клеток дрожжей S. cerevisiae с изменением проницаемости клеточной стенки, происходящим при замене неорганического источника азота на органический. В то же время не все органические азотсодержащие соединения способствуют образованию белков у микроорганизмов. Подавление синтеза и секреции их у различных представителей отдельными аминокислотами наблюдали многие исследователи (M.J. Bissel., R. Tosi., L. Gorini, 1971). В некоторых работах отмечалось ингибирующее влияние и таких азотсодержащих соединений, как пептон, дрожжевой экстракт, причем на синтез не только экзо -, но и эндобелков (R.G. Rose, S.N. Basu, 1958).
В данном случае полагают, что такой эффект может быть связан с наличием в пептоне и других источниках органического азота отдельных соединений, которые, не влияя на рост микроорганизмов, ингибируют синтез и секрецию белков (Г.А. Салохина, Н.В.Образцова и др., 1991).
Таким образом, представленные сведения относительно роли азотсодержащих соединений в процессе синтеза и секреции белков микроорганизмами разнообразны и сложны для понимания. И это не удивительно. Противоречивость данных о влиянии одного и того же источника азота на образование внеклеточных ферментных белков различными микроорганизмами может быть обусловлена не только физиологическими особенностями самих продуцентов, условиями их выращивания, но и тем, и это очень важно, что когда речь идет о группе различных белков, то мы имеем дело с системой довольно сложных и независимых изменений, которые под воздействием различных факторов влекут перестройки в процессах синтеза и секреции всего комплекса. Для нормальной жизнедеятельности микроорганизмов не менее важен и выбор источника углеродного питания. Некоторые легкодоступные источники углерода могут обеспечивать рост культуры, но образование того или иного ферментного белка не происходит. Отдельные углеродсодержащие соединения могут выполнять роль индуктора в процессе синтеза фермента. Так, например, наилучшие условия для биосинтеза и секреции амилолитического комплекса ферментных белков дрожжами Endomycopsis fibuligera создаются при использовании ксилозы, фосфодекстринов или крахмала в качестве источников углерода (А.И. Садова и др., 1969).
Химический состав и питательная ценность зеленой массы горца сахалинского в условиях Северной Осетии
Известно, что минеральные вещества необходимы для построения тканей и многих физиологичесіш важных веществ. Из микроэлементов в зеленой массе горца сахалинского наибольшим количеством представлено железо (Fe). Концентрация железа в зеленой массе горца существенно снижается по мере старения растения (таблица 9). Содержание железа в растениях, по литературным данным, колеблется от 17,5 до 1823,6 мг/кг, а по нашим данным содержание железа в зеленой массе горца сахалинского, в зависимости от фазы развития растения, колеблется от 155,2 ± 3,7 до 454,8 ± 9,5 мг/кг.
Медь (Си) широко представлена в различных растениях и содержится в них как в свободном, так и в связанном виде. Медь входит в состав медьсодержащих белков и ферментов растительных кормов. Как видно из таблицы 9 содержание меди в горце сахалинском до бутонизации максимально (5,4 мг/кг), в фазе цветения растения ее концентрация в зеленой массе растения значительно ниже (1,95 мг/кг).
Микроэлемент цинк (Zn) содержится как атом в молекуле ряда ферментов и ферменты нуждаются в его присутствии, поэтому биологическая роль цинка достаточно велика. Цинк играет существенную роль в формировании репродуктивных органов растения. При его недостатке у растений не образуются семена. Известно также, что цинк повышает устойчивость растений к грибковым и бактериальным заболеваниям. По литературным данным, содержание цинка в зеленой массе растений колеблется от 0,55 до 34,0 мг/кг.
В зеленой массе горца сахалинского, как это показано в таблице 9, во время стеблевания растения (до бутонизации), содержание цинка составляет 12,4 мг/кг, снижаясь в фазе бутонизации до 11Д мг/кг, а в фазе цветения - до 7,6 мг/кг. По литературным данным известно, что марганец (Мп) активирует функции многих ферментов и принимает участие в процессах окисления питательных веществ кормов. Марганец входит как структурная единица в состав ферментов, а также участвует в синтезе аскорбиновой кислоты в растениях. Содержание Мп в растениях колеблется от 13,2 до 114,8 мг/кг. Повышенное содержание марганца в зеленой массе растений, сопровождается повышенным содержанием в ней витамина С.
Максимальное содержание марганца в зеленой массе горца сахалинского нами установлено в фазе бутонизации растения (44,74 мг/кг), а минимальное -во время цветения (17,4 мг/кг).
Нашими исследования показано значительное содержание в зеленой массе горца сахалинского питательных веществ и минеральных элементов, которые являются ценными компонентами питательных сред для культивирования дрожжевых грибов. Особо отзывчивы данные микроорганизмы на микроминеральный состав среды их обитания.
Задача, которую мы поставили перед собой при разработке питательной среды, состояла в том, чтобы, зная оптимальную потребность дрожжей в различных неорганических элементах и других питательных веществах снабдить ими дрожжи в достаточном количестве для получения заданного выхода биомассы. Чрезмерное снабжение питательными веществами только ведет к чрезмерной перегрузке ими клеток и потерям питательных веществ с сепарируемой жидкостью. Значительная потеря солей с сепарируемой жидкостью происходит всегда, даже тогда, когда дрожжи снабжаются ими экономно.
Для нормального питания дрожжам требуется источник углерода - для роста и энергии, источник азота - для синтеза белков и других азотсодержащих соединений, а также различные неорганические элементы - для создания нормальной структуры клетки. Кроме того, дрожжи для своего развития нуждаются в более сложных веществах - «биосе» или «дрожжевых витаминах».
В предыдущем разделе нами был изучен химический состав горца сахалинского и его изменение в зависимости от фазы развития растения. В результате мы пришли к выводу, что сбор сырья для питательной среды, необходимо осуществлять до бутонизации растения, так как именно в этом периоде в растении в максимальном количестве содержатся сырой протеин, зола, фосфор, имеющие наибольшее значение для развития дрожжей.
При применении кислотного гидролиза биомассы данного растения, с целью максимального накопления Сахаров, возможно использование зеленой массы горца сахалинского в фазе цветения, так как в этой фазе растение максимально накапливает сухое вещество со значительным содержанием клетчатки. Нами же выбрана фаза стеблевания (до бутонизации), так как использовали ферментативный гидролиз.
Учитывая богатый химический состав зеленой массы горца сахалинского и относительную ее дешевизну, мы разработали технологическую схему производства питательной среды на ее основе, которая включает в себя выполнение операций, показанных на рисунке 5. Технологический процесс начинается с операций высушивания и измельчения. Необходимость данных действий обусловлена во-первых удобством хранения сырья в высушенном состоянии, во-вторых измельчение сырья до нужного для ферментации размера частиц возможно только в высушенном состоянии.
Получение микробной биомассы на питательной среде их горца сахалинского
Микробная биомасса способна возместить острый дефицит пищевого и кормового белка. При получении микробных белковых препаратов учитывают самое важное преимущество микробных систем перед традиционным сельским хозяйством - высокую скорость роста микроорганизмов, клетки которых наполовину состоят из белка. Недостаток микробной биомассы многие видят в высоком содержании нуклеиновых кислот, которых в ней гораздо больше, чем в традиционной растительной или животной пище. Но для употребления микробной биомассы в кормах нет необходимости снижать содержание в ней нуклеиновых кислот, так как мочевая кислота, возникающая при их деградации, у всех млекопитающих, кроме человека и некоторых приматов, под действием уратоксидазы превращается в алантоин. Алантоин хорошо растворим и легко переходит в мочу. Осуществление процессов получения белка одноклеточных зависит от трех взаимодополняющих факторов: урожая клеток на единицу массы субстрата, концентрации и скорости образования биомассы. Для достижения по этим параметрам максимальных показателей требуются выделение, идентификация и селекция штаммов - продуцентов, создание оптимальных условий культивирования и, в случае необходимости, модификация генетической структуры микроорганизмов с целью увеличения их продуктивности. Изучение зависимости жизнедеятельности микробных клеток от конкретных условий окружающей среды позволяет направленно регулировать рост, развитие и обмен веществ микроорганизмов. Поддерживая определенные условия культивирования, можно управлять ходом ферментационного процесса, получать биомассу заданного состава. Особенно большое влияние на растущую микробную популяцию оказывают такие факторы среды, как состав и концентрация субстрата (прежде всего в отношении источников азота и углерода), температура культивирования, парциальное давление кислорода, биостимуляторы.
Задавшись целью разработать процесс получения на среде из горца сахалинского белкового продукта, мы остановили свой выбор на нескольких штаммах дрожжей Metschnicowia pulcherrima (А, ДГ, MP, MB, ВР). Получение микробной биомассы осуществлялось нами в несколько стадий: - первая стадия: культуру дрожжей переносят петлей со скошенного сусло-агара в 10 пробирок, закрытых ватными пробками, и помещают в термостат на 36-48 часов при температуре 30-32 С. - вторая стадия: образовавшуюся на поверхности сусло-агара в пробирке дрожжевую массу снимают петлей и переносят из одной пробирки в одну колбу с 50 мл сусла при строгом соблюдении правил стерильности проведения микробиологических работ и техники пересевов. Продолжительность роста дрожжей на сусле в колбах на качалке (при 180-200 об/мин) 16-24 ч. Температура регулируется в пределах 30-32С, - третья стадия: по окончании срока размножения отбирают из колб стерильной пипеткой суспензию дрожжей для проверки на чистоту микроскопирования, затем перенося содержимое в лабораторный ферментатор. На скорость накопления биомассы дрожжей больше всего влияет концентрация сахара в субстрате и количество взятых на засев дрожжей. По литературным данным (А.А. Андреев, Л.Н. Брызгалов, 1986) известно, что в промышленных условиях при высоком (более 1,7 %) содержании РВ, выращивание дрожжей идет замедленно с неполной утилизацией углеводов. Однако, научные работы, проведенные в лабораторных условиях, показывают, что концентрация сахара в перерабатываемой среде, а, следовательно, начальная концентрация его в субстрате может быть значительно увеличена, но при этом дрожжи следует обеспечить достаточным количеством растворенного кислорода. Зависимость накопления микробной биомассы в среде от концентрации РВ мы изучали в следующих условиях эксперимента: температура культивирования 28С, исходный рН 5,5, концентрация РВ в питательной среде 2,5, 3,5, 4,5, 5,5, 7,5 %, посевной материал вносили в среду в количестве 3 % от РВ. Результаты культивирования приведены в таблице 14. Исследованиями установлено, что все штаммы Metschnicowia pulcherrima дают хороший выход биомассы на среде из горца сахалинского. В результате анализа полученных данных мы пришли к выводу о внутривидовой вариабельности дрожжей по продуктивности. Наилучший выход биомассы отмечен у штаммов ДГ и А (12,7 и 12,6 г/л), что составляет 50,8 % и 50,4 % от РВ. Наименьший выход биомассы у штамма ВР - 11,9 г/л, что составляет 47,6 % от РВ. Как видно из таблиц 14 и 15, оптимальный диапазон концентрации сахара лежит в пределах 3,5-5,5 %. При проведении периодического процесса культивирования большое значение имеет определение оптимального количества посевного материала. Известно, что при увеличении его до определенного предела сокращаются лаг фаза, период культивирования. Это приводит к повышению производительности процесса. Количественные характеристики носят индивидуальный характер: зависят от природы субстрата и особенностей продуцента.
