Введение к работе
Актуальность проблемы.
Болезнь Марека (БМ) - высококонтагиозное вирусное заболевание птиц гряда куриных), проявляющееся образованием опухолей и процессами де-іелинизации нервных тканей, наносит значительный экономический ущерб 'Омышленному птицеводству.
На сегодняшний момент определены три серотипа вируса БМ (ВБМ). К рвому серотипу относятся онкогенные и аттенуированные неонкогенные гаммы. Ко второму - природные непатогенные штаммы вируса герпеса кур ГК). К третьему - антигенно-родственный ВБМ вирус герпеса индеек ТИ).
Согласно принятой классификации возбудителем данного заболевания яв-ется ДНК-содержащий ВБМ, который в настоящее время относится к под-мейству Gammaherpesvirinae (Calnek B.W. and Witter R.L., 1991; Сюрин B.H. др., 1991). Однако в многочисленных сообщениях о структуре генома ВБМ и :рекрестных антигенных реакциях с вирусом простого герпеса (ВПГ) челове-., его предлагают отнести к подсемейству Alphaherpesvirinae (Becker Y.,1992; slecluse H.J. and Hammershmidt W., 1993; Brunovskis P. and Velicer V.,1995; umigaY.,1998).
Хотя три серотипа различимы в серологических реакциях, они имеют мно-| общих антигенов. Сыворотка против одного серотипа ВБМ обычно переметно реагирует с антигенами других серотипов, но гораздо слабее, чем с мологичными штаммами (Pratt I. et al.,1994; Oho M. et al., 1995).
Эффективным инструментом для идентификации вирусных антигенов яв-нотся моноклональные антитела (МАТ), которые позволяют изучить струк-ФУ и функции отдельных белков вируса (Nazerian К. et al., 1996; Lee L.F. et .,1992; Witter R.L.,1995). Так, недавно, Bullow V.V. и Biggs P.M.(1993) под-$ердили, что антиген-А ВБМ является группоспецифическим, но, тем не ме-ге, имеет и типоспецифические детерминанты. Davidson I. и Malkinson М.
(1995г) показали, что серотип-общие нейтрализующие домены располагают в термостабильных олигомерных формах вирусного антигена В (В-АГ) с ві сокой молекулярной массой, а термолабильный мономерный комплекс В-/ имеет серотип-ограниченые эпитопы.
В последнее время, для идентификации патогенных и непатогеннь штаммов и изолятов ВБМ широко применяют такие высокочувствительш методы исследований генома, как рестрикционный анализ, полимеразная це ная реакция (ПЦР), молекулярная гибридизация и секвенирование (Bumste; N. et al.,1997; Davidson I. et al.,1995; Silva R.F.,1992; Zhu G.S., Ojima T. al.,1992).
Применение рестрикционного эндонуклеазного анализа показало сущее венное различие между образцами ДНК 1, 2 и 3 серотипов, а также меж, ДНК вирусов низкого и высокого пассажа в культуре клеток (Izumiga Y. al.,1998; Lindermaier W., Bauer H. J., 1994; Ross I. et al.,1993).
Результаты проведения ДНК-ДНК гибридизации между геномами ВБМ ВГИ показали, что уровень гомологии нуклеотидных последовательностей г нов, кодирующих гликопротеин A (gA) составляет 73%, а сравнение генов, к дирующих гликопротеин В (gB) трех серотипов ВБМ выявило наличие в ні существенных различий (Потехин СВ. и др.,1998). Многие годы значительнь процент от всех вакцин, применяемых для профилактики БМ приходился препараты на основе штамма FC-126 ВГИ, выделенного Witter R.L. (1970) индеек. Однако в последние годы, в связи с селекцией полевых высоковир лентных штаммов ВБМ данный тип вакцин значительно снизил эффекта ность, а порой и полностью утратил способность защищать птицу от БМ. В соковирулентные мутанты содержат антигены-мишени, несоответствующ таковым на вакцинном вирусе (Witter R.L.,1992; Коровин Р.Н., Зеленскі В.П.,1989; Gingerich Е., 1989; Prajapat K.S.et al.,1990).
Всестороннее углубленное изучение антигенных особенностей ВБМ и е взаимосвязей с другими представителями Herpesvirinae будут способствоваті
льнейшем изготовлению новых поколений вакцинных препаратов, препят-вующих селекции ВБМ в природных условиях и появлению высоковиру-нтных патотипов вируса.
Таким образом, представляется своевременным и обоснованным изучение тигенных свойств инфекционных и термоинактивированных препаратов кцинных вирусов БМ с привлечением МАТ.
Данные литературы также свидетельствуют о необходимости разработки лее чувствительных и специфичных диагностических тест-систем, особенно я выявления латентных и персистирующих форм ВБМ.
Перечисленные выше обстоятельства явились основополагающими в оп-делении выбора темы диссертационной работы.
Цель и задачи исследования.
Цель работы - изучить антигенные свойства инфекционных и термоинак-вированных препаратов вакцинных штаммов вируса болезни Марека с ис-льзованием поли- и моноклональных антител, а также ПЦР для выявления и пирования ДНК ВБМ.
В соответствии с целью работы поставлены следующие задачи:
получить высокоактивные иммунопероксидазные антивидовые конъюгаты тги-IgG кур);
изучить фракционный и морфологический состав вирусной популяции в оизводственных сериях вакцины против БМ на основе ВГИ;
получить антигены ВБМ, различающиеся по перекрестной серотипиче-ой активности, применив приемы термоденатурации;
разработать варианты ИФА с применением поли- и моноклональных анти-п для выявления структурных белков ВБМ;
разработать компьютерную программу по обработке данных титрования тигенов в ИФА;
подобрать специфичные праймеры и оптимизировать условия постановки Р для выявления и типирования ДНК вируса болезни Марека.
Научная новизна работы.
Разработан новый способ получения чистого препарата IgG из желтка я кур. Показана возможность исследования полученных гипериммунных сые роток к IgG кур в РДП и в ИФА (подана заявка на получение патента).
Получены и исследованы в ИФА специфичные и стабильные антигенні комплексы в непрогретых и прогретых ультразвуковых лизатах клеток, инф цированных тремя серотипами ВБМ.
Впервые для анализа антигенного сходства поверхностных белков gB и { разных серотипов ВБМ и ВПГ в ИФА были применены МАТ, направленные белкам вируса простого герпеса (ВПГ) человека.
Подобраны специфичные праймеры, комплементарные гену гликопроте на А и последовательностям внутренних инвертированных повторов, позе ляющие выявлять ДНК вирулентных, онкогенных штаммов 1 серотипа и вг цинных штаммов 3 серотипа, определены оптимальные параметры постанов ПЦР для обнаружения вирусной ДНК.
Практическая значимость работы.
По результатам исследований разработаны:
методические указания по применению компьютерной программы для с ределения активности вируса в вакцине против БМ иммуноферментным мет дом;
методические указания для выявления ДНК вируса болезни Марека мет дом ПЦР.
Метод ПЦР может быть рекомендован к использованию для идентифм ции и дифференциации вирулентных, онкогенных штаммов ВБМ Ісеротиі вакцинных штаммов 3 серотипа, а также для контроля за изменениями виру в процессе культивирования при промышленном изготовлении вакцин.
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубл ковано 12 печатных работ. Подана заявка на получение патента: «Способ изг
овления иммунопероксидазных коиъюгатов для индикации и идентификации сыворотках крови кур антител различного происхождения».
Апробация результатов. Материалы работы и ее отдельные разделы до-ожены: на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 0-летию проф. В.А. Першина (Щелково, 1998 г.); Всероссийской конференції молодых ученых и аспирантов по птицеводству (Сергиев Посад, 1999 г.); онференции «Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животно-одстве на современном этапе» (Москва, 1999 г); Всероссийской научной кон-іеренции по ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии іНИИВВиМ, посвященной 75-летию академика И.А. Бакулова (Покров, 2000 ,); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию іНИТИБП «Научные основы производства ветеринарных биологических пре-аратов» (Щелково, 2000 г.); международной конференции «Биотехнология -000» (Пущино, 2000 г.).
Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 44- странице машинописного текста, иллюстрированы 26 рисунками и 22 таб-ицами. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литера-уры, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсужде-ие результатов, выводы, пракпгческие предложения, список литературы из 68 источников, включающий 124 иностранных и приложение, содержащее окументы, подтверждающие практическую ценность работы.