Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Автолиз и автолитические процессы у микроорганизмов 11
1. Ферменты автолитического комплекса 11
2. Регуляция активности автолитических ферментов 15
3. Характеристики процесса автолиза 18
Глава 2. Способы стабилизации ферментов 21
1. Использование добавок 23
2. Химическая модификация 27
2.1 Поперечное связывание бифункциональными реагентами 29
2.2 Введение новых полярных или поверхностно заряженных групп 31
2.3 Гидрофилизация поверхности белка 34
2.4 ПЭГ- или углеводородное связывание 35
2.5 Другие способы стабилизации ферментов 38
Глава 4. Объекты и методы исследований 42
1. Объекты исследования 42
2. Общие методы 43
3. Биохимические методы 43
4. Методы математической обработки данных 47
Глава 5. Сравнительная характеристика способов ферментативной деструкции клеток дрожжей 49
Глава 6. Модификация ферментов химическими шаперонами 58
1. Модификация протеиназ различными гомологами АОБ и ГСЛ 61
1.1 Модификация протеиназ молекулами С7-АОБ 61
1.2 Модификация протеиназ молекулами тирозола 73
1.3 Модификация протеиназ молекулами С \2-АОБ 79
1.4 Модификация протеиназ молекулами гомосеринлактона 86
2. Модификация амилаз 91
2.1 Модификация амилаз молекулами С7-АОБ 91
2.2 Модификация амилаз молекулами тирозола 96
3. Модификация целлюлаз молекулами Су-АОБ 99
Глава 7. Стабилизация алкилоксибензолами ферментов автолитического комплекса дрожжей 112
Выводы 121
Список литературы 123
- Регуляция активности автолитических ферментов
- Поперечное связывание бифункциональными реагентами
- Методы математической обработки данных
- Модификация протеиназ молекулами гомосеринлактона
Регуляция активности автолитических ферментов
Ферменты автолитическгого комплекса относятся к конститутивным и регуляторные системы, контролирующие скорость их синтеза и активность, принципиально не отличаются от систем регуляции других ферментов. При росте микроорганизмов в соответствующих физиологических условиях деятельность автолизинов и других автолитических ферментов сбалансирована с деятельностью синтетического аппарата клетки. В процессе клеточного цикла наблюдается определенная связь между синтезом ДНК, делением клетки и активностью автолизинов, принимающих участие в освобождении пространства для наращивания клеточной стенки и разделения дочерних клеток. Автолитическая активность увеличивается в период репликации перед началом деления клетки и затем падает (Hinks et al., 1978 a, b). Полагают, что первичным регулятором автолитических процессов являются нуклеазы, контролирующие скорость превращения про- иРНК в иРНК (Ogata, 1976). На уровне трансляции регуляторную роль исполняют протеиназы, участвующие в белковом процессинге и освобождающие активную форму автолизинов.
Обсуждается и другая форма активации автолизинов, осуществляющаяся при участии белка (молекулярного шаперона), специфически соединяющегося с автолизином в эквимолярном соотношении и повышающим его сродство к субстрату, что в несколько раз увеличивает активность фермента (Эль-Регистан, Бабаян, 1987). На субстрат-ферментную специфичность, определяющую кинетику ферментативных реакций, влияют не только количество активной формы фермента, но и структура субстрата. На этом уровне каталитическая активность автолизинов регулируется функциональностью тейхоевых (ТК) и липотейхоевых кислот (ЛТК) (Chatterjee et al., 1969; Mosser, Tomasz, 1970; Cleveland et al, 1975, 1976 a, b; Тульская и др., 2000). Цепи ТК, располагающиеся в клеточной стенке гибко связывают молекулы полимеров пептидогликана, допуская его лабильное расширение и сжатие. Физиологическую роль ТК связывают с регуляцией ионного обмена и с активностью автолитических ферментов (Тульская и др., 2000). Структурным участком ТК, ответственным за фермент-субстратное сродство автолизинов и ПГ, является холин, взаимодействующий с муреиназами и удерживающий их в клеточной стенке (Tomasz, 1968). ТК играют также роль протекторов, защищая автолизины от действия протеиназ. Наконец, ТК и ЛТК образуют системы обеспечения клеточных оболочек ионами Mg , активирующими автолизины (Lambert, 1977; Gmeiner, 1977). Ферменты, модифицирующие ТК -фосфохолинэстеразы, удаляют фосфохолиновые остатки, изменяют структуру ТК, вследствие чего теряется сродство автолизинов к ПГ клеточной стенки. ЛТК в отличие от ТК являются ингибиторами автолизинов (Tomasz, Waks, 1975; Suginaka, 1979). Механизм их действия основан на том, что встроенная гидрофобным концом в цитоплазматическую мембрану ЛТК, соединенная через холин с автолизином, удерживает его в мембране, не допуская фермент к субстрату - ПГ. При действии деацилаз ЛТК, отщепляющих ацильный гидрофобный остаток молекулы, они теряют способность удерживаться в мембране, что приводит к потере их ингибирующих свойств. Помимо ЛТК ингибирующими функциями обладают некоторые мембранные липиды, такие как кардиолипин или дипальмитоилфосфатидилглицерин (Cleveland et al., 1976 a, b; Suginaka et al., 1979). Поэтому мембранные липиды и механизмы их метаболических превращений играют важную роль в регуляции автолитических процессов и автолизе клетки. На фермент-субстратные отношения влияет также изменение структуры ПГ, в частности его О, N- ацетилирование; предполагают, что ПГ стенок септы после разделения клеток модифицируется и становится устойчивым к действию автолизинов (Cleveland et al., 1976 a, b; Kawagishi et al., 1979). Еще один механизм регуляции активности автолизинов сопряжен с их инактивацией протеиназами, в которой доминирующую роль отводят сериновым протеиназам (Murao et al., 1979). Специфические природные ингибиторы сериновых протеиназ, в частности низкомолекулярный пептид MAPI, регулируя активность протеолиза, вторично влияют на функциональность автолизинов. Наконец, большое значение для эффективности автолитических процессов имеет такая интегральная характеристика клетки как ее трансмембранный потенциал. Полагают, что активность автолизинов находится под контролем энергизованного состояния мембраны. До сих пор обсуждались механизмы внутриклеточной регуляции автолитических процессов, обеспечивающие их гармоничное функционирование в клетках развивающихся микробных культур. Однако существуют и внеклеточные регуляторы, которые в зависимости от их концентрации в культуре контролируют интенсивность автолитических процессов в клетках разного физиологического возраста. К числу таких ауторегуляторов относятся факторы сІ2 (фсЬ), синтезируемые микроорганизмами различных таксономических групп, имеющие однотипное действие и оказывающие влияние на рост и дифференцировку продуцентов (в связи с чем и были названы факторами d2). Факторы d2, активным началом которых являются свободные ненасыщенные жирные кислоты (СНЖК), влияют на фазовое состояние мембран (Светличный и др., 1983; Коновалова и др., 1985). Действие низких концентраций фd2, которые увеличивают жидкостность мембранных липидов, приводит к повышению активности мембранных ферментов, в том числе гидролаз, и, таким образом, к ускорению прорастания гипометаболических или анабиотических клеток микроорганизмов (Коновалова, 1985).
Сверхкритическое повышение уровня фс12 в развивающейся микробной культуре вызывает дестабилизацию структуры мембран, что обуславливает ингибирование энергодающих процессов клетки и является причиной индуцированного автолиза и гибели клеток. С этих позиций ф 12 является эндогенным индуктором автолиза клеток в постстационарной фазе, т.е. спонтанного автолиза, связанного со старением культуры (Светличный и др., 1983; Бабусенко и др., 1991). Аналогичным действием обладают ауторегуляторные факторы AMI миксобактерий, за биологическое действие которых также отвечают НСЖК (Rosenbluh, Rosenberg, 1990). Возрастание концентрации AMI индуцирует автолиз части клеток плодового тела миксобактерий, что обеспечивает выход из автолизирующихся клеток аутоиндукторов спорообразования. В результате суммарная концентрация спорогенов повышается до уровня, достаточного для индукции образования миксоспор (Sudo, Dworkin, 1973). Аналогичный процесс образования покоящихся цистоподобных форм был описан для бактерий родов Bacillus, Micrococcus, Arthrobacter, Escherichia и др, а также одноклеточных эвкариот Saccharomyces cerevisiae (Мулюкин и др., 1997; Демкина и др., 2000). Таким образом, стадия автолиза в постстационарной фазе роста микробных культур является не только стадией гибели клеток, но должна рассматриваться как необходимый этап в процессах образования покоящихся форм, предназначенных для переживания и сохранения вида.
Поперечное связывание бифункциональными реагентами
Химические модификации, отличные от поперечного связывания, могут также существенно повышать стабильность ферментов. Наиболее известная модификация - это введение новой полярной или заряженной группы на поверхность белка. Для того, чтобы изменить 17 из 24 доступных остатков лизина лактатдегидрогеназы из сердца свиньи использовался монофункциональный метилацетимидат (Tuengler, Pfleiderer, 1977). При таком ацетамидировании сохранялся заряд, но значение рК увеличивалось (с 10,2 до 12,5). Модифицированный фермент показывал большую стабильность к нагреванию, щелочным значениям рН и даже к перевариванию трипсином.
Увеличение времени полужизни варьировало от 8 до 50 раз в зависимости от температуры. Однако сохранение заряда не всегда необходимо для стабилизации белков монофункционалями. Так ос-химотрипсин был алкилирован, используя акролин с последующим боргидридным восстановлением, что обеспечивало сохранение позитивных зарядов, и ацилирован уксусным или янтарным ангидридом для нейтрализации или реверсии положительных зарядов, соответственно (Torchilin et al., 1979). Все вещества реагировали с аминогруппами белка. Термостабильность фермента повышалась по мере возрастания степени замещения доступных аминогрупп белка — максимально при замещении до 90%. Дальнейшее замещение вызывало резкое падение термостабильности. Было показано, что достигнутая стабилизация в большей степени зависела от степени модификации, чем от вида используемого модификатора. Например, и алкилирование, и ацилирование стабилизирует фермент, если при этом степени замещения свободных аминогрупп белка эквивалентны. Это предполагает, что положительные заряды на поверхности белка не важны для сохранения нативной конформации. Противоположные результаты были получены Купо с соавторами (Сиро et al., 1980; Сиро et al., 1982), которые исследовали стабилизацию химотрипсиногена О-метил изомочевиной после гуанидирования остатков лизина в молекуле белка. Действие данной реакции аналогично ацетамидированию, обсужденному выше (Tuengler, Pfleiderer, 1977), но при взаимодействии гуанидиновых групп с остатками лизина получался гомоаргинин. При этом сеточный положительный заряд сохранялся. Было доказано, что, когда оставшиеся доступными остатки лизина нейтрализовали ацетилированием, полученные производные были менее активны, чем нативная форма, а супергуанидированная форма (полученная дальнейшим гуанидированием измененных карбоксильных групп белка) была еще менее стабильна. Этот вывод, в противоположность заключению Торчилина (Torchilin et al., 1979), демонстрирует важность осторожного выбора химических реагентов и стехиометрии реакции в экспериментах по химической стабилизации белков.
Другой пример - модификация перкосидазы хрена (ПХ). Было показано, что после модификации ПХ бис-сукцинимидами ее термостабильность возрастала от 6 до 23 раз (Ryan et al., 1994). Использование бис-имидатов, наоборот, приводило к незначительной стабилизации, несмотря на успехи их применения для поперечного связывания у ряда ферментов (О Fagain et al., 1991; Wong, Wong, 1992). Интересно, что такое отличие отмечено в ПХ-стабилизирующей способности двух видов аминоспецифических бифункционалей. Имидаты взаимодействуют с аминогруппами с сохранением заряда, тогда как сукцинимиды приводят к нейтрализации заряда (Ji, 1983). При нейтральных значениях рН функциональные аминогруппы остатков лизина по большей части протонированы и, следовательно, положительно заряжены. Однако непротонированные группы остатков лизина находятся в равном количестве с заряженными формами. Эти непротонированные группы взаимодействуют нуклеофильно с карбонильной группой N-гидроксисукцинимидного эфира с образование амида. Амид не может нести заряд и, таким образом, положительный заряд исходной аминогруппы теряется (Ji, 1983). ПХ была модифицирована монофункциональным сукцинимидом, с целью выяснить, могут ли какие-либо изменения в стабильности белка быть результатом нейтрализации заряда в отсутствие поперечного связывания. Нейтрализация отталкивания одноименных зарядов может быть ответственна за стабилизацию, наблюдаемую в данном случае. Снижение количества подобных поверхностных зарядов будет уменьшать тенденцию белка разворачиваться при высокой температуре. Существует и альтернативное объяснение. Шесть лизиновых остатков ПХ находятся в позициях 65, 84, 149, 174, 232, 241 (Welinder, 1979, 1985). Как полагают, лизин 174 взаимодействует с гемином простетической группы. Из 5 доступных остатков лизина, по крайне мере, 3 находятся в гидрофобной положительной области (Welinder, 1985). Только лизины 65 и гемиассоциированный 174 находятся в гидрофильных доменах ПХ. Нейтрализация положительных зарядов внутри таких гидрофобных доменов вполне может иметь термостабилизирующее действие.
Угарова и др. (Ugarova et al., 1979) изучали термостабильность ПХ после модификации аминогрупп лизина рядом карбоксильных кислотных ангидридов и ТНБС (тринитробензосульфокислотой). Некоторые из этих соединений изменяли положительный заряд остатков лизина. Такая химическая обработка привела к ограниченной конформационной подвижности (определяемой по круговому дихроизму) и повышенной термостабильности. Остаточная гибкость молекулы, наблюдаемая в варианте модификации 4 из 6 лизинов ПХ, коррелировала с повышенной стабильностью фермента. Отмечено, что стабилизация обеспечивалась степенью модификации (например, количеством модифицированных остатков лизина), а не природой модификатора. При этом модификация всех 6 остатков лизина снижала термостабильность ПХ (Ugarova etal., 1979). Как известно, ферменты могут хорошо функционировать в неводных органических растворителях, таких как гексан или толуол (Klibanov, 1989), однако, водно-смешивающиеся органические растворители часто вызывают инактивацию белка. На примере ПХ было показано, что в смесях воды и органического растворителя нативная и ацилированная формы ведут себя по
Методы математической обработки данных
Результаты исследований отражены в рисунках и оформлены в виде таблиц после их статистической обработки, в ходе которой были определены средние значения определяемой величины, среднеквадратичное отклонение и доверительный интервал (Грачева и др., 1982). Средний результат определения рассчитывали по формуле: определений; п - количество определений. Погрешность отдельного определения рассчитывали по разности: Закономерности воспроизводились в каждом из параллельных опытов. Цифровые данные обрабатывали статистически по Фишеру-Стьюденту при уровне надежности 95%. Величины доверительных интервалов не превышали 5%. Необходимым условием роста и развития живых организмов любого уровня организации является регулируемая ими самими сбалансированность процессов клеточного метаболизма, при которой, с одной стороны, гармонично сопряжены скорости разрушения отдельных клеточных структур и биополимеров с синтезом клеточных материалов de novo, а с другой -обеспечивается баланс обмена веществ между организмом и средой окружения. Если рассматривать клетки как каталитические единицы, то их суммарная метаболическая активность на разных стадиях развития микробных культур будет характеризоваться определенным балансом анаболизма и катаболизма. При этом в клетках любого физиологического возраста в определенных местах клетки необходимо возникает ситуация превалирования процессов распада клеточных биополимерных структур над их синтезом: при росте и делении клеток, цитодифференцировке, обновлении материала клеточной стенки и т.д. (Эль-Регистан, 1988). Развитие состояний автолиза и анабиоза, также как и состояние активного метаболизма имеет свои закономерности клеточной и межклеточной регуляции. Знание этих закономерностей используется для направленной интенсификации процессов в соответствующих биотехнологиях микробного синтеза, получения автолизатов или микробных препаратов.
В Институте микробиологии РАН при изучении ауторегуляции роста и развития микроорганизмов было обнаружено, что микроорганизмы различных таксономических групп в процессе своей жизнедеятельности синтезируют и аккумулируют в культурной жидкости аутогенные метаболиты, влияющие на структурную организацию и функциональную активность мембран - факторы d, (влияющие на дифференцировку клеток), которые контролируют структурную организацию и функциональную активность мембран клеток и, таким образом, влияют на физиологическое состояние микроорганизмов (Эль-Регистан, 1988). Дальнейшие исследования выявили химическую и физиологическую неоднородность фактора d. В его составе были определены: фактор dj -аутоиндуктор анабиоза, при пороговых концентрациях вызывающий обезвоживание микробной клетки, ингибирование метаболических процессов, что сопровождается лимитированием роста микробной культуры, а при дальнейшем повышении его уровня фактор di индуцируют переход клеток в анабиотическое состояние; и фактор d2 - повышающий жидкостность мембран и в сверхпороговых концентрациях нарушающий метаболический баланс клетки в пользу большей активности гидролитических ферментов, и в экстремальных концентрациях приводящий к автолизу. Была разработана схема препаративного выделения и очистки ауторегуляторных факторов di и d2 из культуральной жидкости микроорганизмов различных таксономических групп (Коновалова, 1985; Мулюкин и др., 1996; Иванова, 1998), что позволило определить их химическую природу. Установлено, что вне зависимости от таксономической принадлежности активным началом факторов d2 являются ненасыщенные свободные жирные кислоты НСЖК, влияющие на жидкостнофазное состояние мембран. В малых концентрациях (менее 20 нмоль/мл) НСЖК стимулируют эндогенное дыхание клеток продуцента и экзогенно стимулируемое (малатом и др.) дыхание изолированных мембран Micrococcus lysodeikticus, а в больших - ингибируют его и индуцируют автолиз клеток (Светличный, 1982; Коновалова, 1986; Бабусенко и др., 1991).
У миксобактерий функциями аутоиндукторов автолиза обладают внеклеточные ауторегуляторные факторы AMI, которые также как и факторы d2 представлены ненасыщенными свободными жирными кислотами (Rosenbluh, Rosenberg, 1990). Процессы как индуцированного, так и спонтанного автолиза микроорганизмов проходят в две стадии. На первой - стадии индукции, происходит необратимое нарушение баланса синтетических и деградационных процессов, что является побудительной причиной автолиза (Иванова, 1998). В развивающихся микробных культурах (в постстационарной фазе) функции индукторов автолиза выполняют внеклеточные ауторегуляторные факторы, у миксобактерий - AMI (Rosenbluh, Rosenberg, 1990), у широко круга микроорганизмов про- и эвкариот- факторы d2 (Светличный, 1983; Коновалова и др., 1985). Запороговое повышение концентрации этих ауторегуляторов в культуре обуславливает повышение текучести цитоплазматической мембраны (ЦПМ) до сверхкритического уровня и вследствие этого - нарушение ее структурной организации и функциональной активности (Светличный, 1983; Коновалова и др., 1985). У эвкариот мишенью для действия НСЖК, помимо ЦПМ, служат мембраны клеточных органел, в том числе лизосом. Наиболее перспективным следует считать использование олеиновой кислоты в качестве химического аналога фактора d2, поскольку она обладает наибольшей среди НСЖК стабильностью в отношении перекисного окисления липидов (Loidl-Stahlhofen et al., 1995), является нетоксичным соединением, не требующим удаления из конечного продукта, и была успешно применена в промышленном крупнотонажном производстве автолизатов кормовых дрожжей (БВК) (Бравова и др., 1990). Вторая стадия - собственно авголитическое разрушение клеток -осуществляется при действии клеточных деполимераз, в клетках эвкариот, в основном лизосомальных гидролаз, что сопровождается выходом в инкубационную среду продуктов деградации клеточных полимеров. Скорость и эффективность автолиза как суммарного каталитического процесса зависят от условий внешней среды, селективно оптимальных для каждой из стадий (Бравова и др., 1990; Иванова и др., 1999). На первой стадии - индукции - оптимизирующим условием является подкисление среды (рН 3-4) с целью сохранения индуктора - олеиновой кислоты или НСЖК - в протонированном состоянии для лучшей инкорпорации его в мембраны. На второй стадии поддерживаются оптимальные условия для действия деполимераз, и прежде всего протеиназ. Применительно к автолизу
Модификация протеиназ молекулами гомосеринлактона
В этой части нашей работы исследовали возможные эффекты действия на микробные протеиназы химического аналога другой группы микробных внеклеточных ауторегуляторов, а именно факторов, «ощущающих» плотность клеточных популяций бактерий и относящихся по своей химической природе к гомосеринлактонам (ГСЛ). Известно, что низкомолекулярные метаболиты, относящиеся к классу ацильных производных лактона L-гомосерина, свободно диффундируют через клеточные мембраны и обеспечивают компетентность бактерий, когда клетка становится способной реагировать на повышение внутриклеточной концентрации этих веществ включением групп генов стационарной фазы, в том числе, и автоиндукцию синтеза ГСЛ. Это явление получило наименование «quorum sensing» или «кооперативной чувствительности» (Fuqua et al., 1994). ГСЛ как аутиндукторы генной экспрессии продуцируются грамотрицательными бактериями (Завильгельский, Манухов, 2001).
Механизм реализации феномена кооперативной чувствительности заключается в продукции микроорганизмами ГСЛ как внеклеточных сигнальных молекул (аутоиндукторов), концентрация которых в среде роста зависит от плотности клеток в культуре. По достижении некой пограничной концентрации в клетке, они связываются с молекулой регуляторного белка (Bassler, 1999), а образовавшийся комплекс инициирует транскрипцию генов мишени. Например, в основе системы «quorum sensing» у люминесцирующих морских бактерий Vibrio harveyi лежит взаимодействие молекул ГСЛ с белками двухкомпонентной регуляторной системы - киназой и фосфатазой (Bassler et al., 1993, 1994). Аутоиндукторы АИ-1 (N-3-гидроксибутаноил-Ьгомосеринлактон) и АИ-2 (химическая природа неизвестна) взаимодействуют с белками-сенсорами, которые встроены в мембрану и являются двухдоменными киназами-фосфатазами (в зависимости от наличия в среде АИ) двухкомпонентной системы регуляции (Freeman et al., 2000). При низкой концентрации ГСЛ - аутоиндукторов АИ-1 и АИ-2 - белки-сенсоры действуют как киназы и фосфорилируют (с помощью белка-посредника) главный регулятор системы. При высокой концентрации аутоиндукторов АИ-1 и АИ-2 белки-сенсоры действуют как фосфатазы. Иными словами, связывание белков-сенсоров с внешними ГСЛ приводит к конформационным изменениям фермента и аутофосфорилированию передающего домена. Область нашего интереса включала выявление действия ГСЛ как неспецифического структурного модификатора белков при определении стабилизирующих свойств ГСЛ в отношении модельных ферментов в опытах in vitro. Как и в предыдущих экспериментах, вначале была исследована дозозависимость влияния плотностного ауторегулятора бактерий на изменение активности протеиназ ФП «Детерзим 440» (рис. 14). Ферментный препарат обрабатывали ГСЛ двумя способами - прединкубационный (в течение 40 минут) и без прединкубации.
Анализ полученных данных позволил сделать вывод, что ГСЛ, также как и С -АОБ, оказывал ингибирующий активность эффект в широком диапазоне концентраций от 1 до 80 мг/л. Ввиду того, что доверительные интервалы значений ферментативной активности (относительно контроля) для одних и тех же значений концентрации ГСЛ, полученные в прединкубационном и беспрединкубационном вариантах перекрываются, можно предположить, что модификация фермента ГСЛ не зависит от времени контакта с белком. В целом характер концентрационных зависимостей для ферментов, обработанных ГСЛ и Сі2-АОБ, схож. Для полноты сравнения в следующих опытах при изучении стабилизирующего действия ГСЛ в условиях термоденатурации белка ферментативную активность ФП «Детерзим 440» определяли после предварительного прогревания фермента в комплексе с ГСЛ при концентрациях его в 8 и 20 мг/л в течение 15, 30, 45 и 60 минут при температуре 70С. Сравнением служила термостабильность фермента, не обработанного ГСЛ (рис. 15). Как в контроле, так и во всех опытных вариантах наблюдалось снижение ферментативной активности. Существенных различий между контрольным и опытными вариантами не было обнаружено. Следовательно, в отличие от Си-АОБ, у ГСЛ отсутствует протекторная функция, хотя действие обоих факторов при их комплексообразовании с белком имело, в основном, ингибирующий активность характер. Это можно объяснить различным типом взаимодействий белка с С12-АОБ и ГСЛ, что зависит от различий в строении их молекул. Таким образом, нами было исследовано действие трех различных по структуре аналогов факторов di микроорганизмов: С7-АОБ, С -АОБ и тирозола, а также аналога плотностых ауторегуляторов бактерий - ГСЛ на активность микробных протеиназ. Показано, что стимулирующее активность действие при комплексообразовании с протеиназами (250 - 300% от контроля) проявляли 2 гомолога АОБ: С7-АОБ и тирозол, при этом стимуляция катализа была сопряжена со стабилизацией фермента и повышением его устойчивости в денатурирующих условиях. С12-АОБ и ГСЛ проявляли практически одинаковое ингибирующее ферментативную активность действие. Однако в то время, как Сп-АОБ обладал существенным термопротекторным эффектом, у ГСЛ такой
