Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I Бактерии рода Azotobacter и перспективы использования их в сельском хозяйстве (Обзор литературы) 7
ГЛАВА II ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Материалы и методы 37
Характеристика штаммов .... 37
Хроматографические препаративные методы выделения веществ 38
Хроматография в тонком слое (ТСХ) . 40
Спектрометрические методы идентификации веществ 43
2. Выделение индивидуальных веществ из клеточных липидов Azotobacter chroococcum
и исследование их химических и физико-химических свойств 44
Биологические методы определения антибиотической активности .... 52
3. Получение препарата азотобактера . . 53
ГЛАВА III ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Объекты исследования 55
2. Липидные вещества клеток . ... 57
Выделение суммарных клеточных липидов, их разделение и идентификация 57
Нейтральные малополярные липиды(углеводо-роды, воска, триглицериды, убихиноны, фе-
нольный липид) и антибиотик ... 63
3. Убихиноны 68
4. Фенольный липид 76
5. Антибиотик 89
6. Полярные липиды 109
ВЫВОДЫ "... 114
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 115
ПРИЛОЖЕНИЕ 140
- Бактерии рода Azotobacter и перспективы использования их в сельском хозяйстве (Обзор литературы)
- Характеристика штаммов
- Липидные вещества клеток .
Введение к работе
Предусмотренное Продовольственной программой дальнейшее повышение эффективности сельскохозяйственного производства требует внедрения научно обоснованной системы земледелия. Одним из средств, способствующих повышению урожайности полей, является использование удобрений для сельскохозяйственных культур. В этом аспекте заслуживают внимания бактериальные препараты, получаемые
На ОСНОве СВОбодНОЖИВуЩИХ бактерий Azotobacter chroococcum.
Последние обладают широкими синтетическими возможностями, из которых наибольший интерес представляет их способность связывать азот воздуха, и тем самым, обогащать пахотный слой почвы, улучшая азотное питание растений. В СССР с 30-х годов широкое применение получил бактериальный препарат азотобактерин в качестве ана> лога азотных удобрений. Позднее было обнаружено, что те же юикро-организмы способны синтезировать ряд биологически активных веществ, таких как, витамины группы В, ауксины, гиббереллины, кини-ны, которые оказывают стимулирующее действие на рост и развитие растений.
Новое направление в использовании азотобактера связано с открытием его антибиотических свойств. Работами советских ученых впервые было показано, что некоторые штаммы образуют фунги-статические вещества, с широким спектром действия, что позволяет использовать эти организмы с целью оздоровления растений. /Мишустин, Петрова, 1958; Мишустин и др., 1969/. В этом направлении ведется работа в лаборатории бактериальных удобрений Всесоюзного научно-исследовательского института микробиологических средств зашиты растений и бактериальных препаратов (ВНЙИбак-препарат). В ходе исследования почв различных почвенно-климати-ческих зон из 56$ образцов, полученных из южной зоны СССР, были - 5 -выделены и отселектированы штаммы азотобактера, обладающие антибиотической активностью в отношении фитопатогенных микроорганизмов /Новогрудская, 1973; Алешина и др., 1976/. В настоящее время во ВНИИбакпрепаратов разработана технология получения сухого препарата азотобактерина, в котором сохраняется максимальное количество живых клеток, способных синтезировать наряду с ростоак-тивирующими агентами; антибиотические вещества, подавляющие рост фитопатогенных грибов /Алешина и др., 1981; Орловский и др., 1982/. Многолетние испытания опытных образцов совместно с Куйбышевским, Костромским, Волгоградским и Воронежским сельскохозяйственными институтами показали эффективность сухого препарата при использовании его под овощные культуры. Применение азотобактерина снижает количество растений, пораженных болезнями, способствует повышению урожая на II-42&, улучшает качество урожая /Новогрудская и др., 1978; 1981/.
Создание наиболее ценных удобрений должно базироваться на отборе оптимальных культур азотобактера, что, в свою очередь, связано с всесторонним исследованием физиологии, биохимии и химии этих микроорганизмов.
В настоящее время достаточно подробно изучены аминокислотный состав суммарного белка и свободных аминокислот азотобактера /Зайцева, 1965/, азотфиксирующая активность различных штаммов /Федоров, 1952 ; Рубенчик, I960; Зиновьева, 1962 ; Мишустин, 1972; Новогрудская, 1973/, способность к витаминообразованию /Красильников, 1958 ; Наумова, 1961; Мишустин и др., 1968 ; Новогрудская, 1973 /, к образованию антибиотика /Мишустин и др., 1958; 1969; Новогрудская, 1973/. Однако, до сих пор отсутствуют какие-либо сведения о таких важнейших компонентах бактериальной клетки как липиды, которые во многом определяют ее жизнеде- ятельность. Кроме того, липиды и липофильные вещества могут представлять специальный интерес в силу своей биологической активности. Что же касается антифунгальных веществ, то пока они не были получены в химически чистом виде, что в значительной степени затрудняет стандартизацию бактериальных препаратов по антибиотической активности. Очевидно, что исследования в указанных направлениях будут способствовать более эффективному практическому использованию азотобактера.
Целью настоящего исследования является изучение клеточных липидов культуры азотфиксиругощей бактерии Azotobacter chroococ-СШ1 92, выделение, очистка, изучение химических и физико-химических свойств новых липидов и липофильных метаболитов, в том числе антибиотика, обладающего активностью в отношении грибов, возбудителей болезней растений.
Бактерии рода Azotobacter и перспективы использования их в сельском хозяйстве (Обзор литературы
С момента открытия Бейеринком в 1901 году/Вeijerinck, 1901/ аэробного азотфиксирующего микроорганизма, названного им Azotobacter chroococcum $ последний постоянно привлекает к себе внимание исследователей. Интерес к роду Azotobacter вызван не только тем, что процесс биологической фиксации азота является одним из важнейших и интереснейших явлений природы, но и стремлением использовать азотфиксацию для решения нрнктических задач.
Большое число работ посвящено морфологии, таксономическому положению, биохимии, физиологии, активности азотфиксации, распространению азотобактера /Prazmovsky,1912; Омелянский, 1916, 1923, 1926 ; Виноградский, 1930, 1932, 1936, 1938, 1952; Костычев и др., 1926, 1931; Шелоумова, 1938, 1941; Бачинская, 1935; Сушкина, 1949 ; Федоров, 1952 ; Блинков, 1959 ; Рубенчик, I960 ; Зиновьева, 1962 ; Зайцева, 1965 ; Доросинский, 1965 ; Мишустин, 1968, 1972; Apte е.a., 1981; Берне, І982;Беррис, 1982/.
В результате многочисленных исследований были выяснены особенности бактерий рода Azotobacter . В молодом возрасте клетки представляют собой палочки с закругленными концами, размер которых колеблется в пределах 2,0-7,0x1,0-2,5 мкм. Клетки обычно располагаются парами, одиночно, реже короткими цепочками. В клетках азотобактера нет ядра, однако, найдены образования, дающие положительную реакцию по Фольгену, хорошо воспринимающие ядерную окраску и переходящие из материнской клетки в дочерние /EisenstarkH др., 1950 jFloetmann , 1954; Apte е»а. 1981/. Молодые клетки, покрытые тонкой капсулой, которая иногда отсутствует, подвижны; движение клеток осуществляется за счет пе-ритрихальных жгутиков. Размножаются клетки путем деления , происходящего в результате образования поперечной перегородки или перешнурования. По мере развития и старения они теряют подвижность, укорачиваются, принимают кокковиднуго форму; в протоплазме обнаруживается ячеистое строение, а затем появляются зерна, содержащие волютин, гликоген, жировые капли и другие вещества, которые сильно преломляют свет /Гиляровский, 1913; Омелянский, 1923/. При этом, пигментирующие виды азотбактера принимают окраску от желтоватой до коричнево-черной. С возрастом клетки покрываются толстой слизистой капсулой, состоящей главным образом из полисахаридов и содержащей 0,023$ азота /Maztin, 1965, 1966/. Стадия появления капсулированных клеток (цист), образование которых может быть индуцировано путем переноса клеток в середине экспоненциальной фазы роста на среды с н-бутанолом или -оксибутира-том /Reuech, Sadoff, 1979/, считается стадией покоя; в этом состоянии азотобактер хорошо переносит внешние воздействия /Beijerik, 1901; Омелянский, 1916 ; Prazmovsky,I9I2 ; Бычковская, 1965/. Попадая в благоприятные условия, цисты начинают размножаться, проходя целый ряд морфологических и структурных изменений: набухает и лопается капсула, через разрыв выходит зернистая клетка, которая постепенно удлиняется, приобретая вид гомогенной подвижной палочки / Tchan e.a.J962; Parker, 1966/. В старых культурах и в условиях, резко отличающихся от нормальных, наблюдается большое многообразие причудливых, инволюционных форм /Шніів, 1921; Вино градский, 1932 ; Красильников, 1931; Бачинская, 1935/. Однако, эти формы нежизнеспособны и быстро погибают: оболочка лопается, содержимое выходит наружу /Bisset, Hale, 1953; Lewis, 1937/. Как правило, клетки азотобактера грам-отрицательные.
Характеристика штаммов
. В работе исследовали культуры Azotobacter chroococcum 92, 107, К, 10 Т, а также штаммы других видов азотобактера -Az.vinelandii II и 23, Az„agile 22,
Az.nigricans 819, Az.indicum 1032 и 1033.
Az.chroococcum92 получен селекционным путем в лаборатории бактериальных удобрений Всесоюзного научно-исследовательского института микробиологических средств зашиты растений и бактериальных препаратов (ШИИбакпрепарат), является активным цродуцентом антибиотических веществ. Штамм защищен авторским свидетельством № 922105.
Az.chraococcum 107 получен в лаборатории бактериальных удобрений ВНИИбакпрепарат в результате селекции, основанной на отборе естественных вариантов из малоактивного по биосинтезу антибиотика изолята, выделенного из окультуренной почвы колхоза им.Свердлова Ташкентской области УЗСССР. Штамм защищен авторским свидетельством № 523931.
Az.chroococcum К - стандартный штамм получен из музея Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (ВНИИ с.-х.микробиологии).
Az.chroococcum 10 Т получен из лаборатории микробных препаратов для животноводства от автора Полонской М.С., штамм выделен из пузырьков яичников курицы.
Az.vinelandii Ц получен из музея ВНИИ с.-х. микробиологии. Az.vinelandii 23 получен из музея института микроорганизмов и вирусов АН УССР.
Az.nigricans 819 получен из Всесоюзной коллекции микроорганизмов и вирусов (ВКМВ).
Az.agile 22 получен из музея Института микроорганизмов и вирусов АН УССР.
Az.indicum 1032 получен из ВКМВ. Az.indicum 1033 получен из ВКМВ.
Для культивирования штаммов их выращивали на агаризован-ной среде Федорова следующего состава ( % ): сахароза 2,0; К2НР04 - 0,03 ; WgS04 - 0,03 ; СаНР04 - 0,02 ; K2S04 _ 0,02 ; СаС03 - 0,5 ; агар-агар - 1,75.
Для получения биомассы культуры выращивали в колбах емкостью 750 мл, содержащих 200 мл питательной среды Федорова того же состава. В качестве инокулюма служила суспензия азотобактера, приготовленная смывом исходной культуры с агара и выращенная в колбах в течение 16-20 часов. Дальнейшее выращивание культуры проводили на качалках (200 об/мин) при 28, рН -6,5-7,2 в течение 48-72 часов. Полученную биомассу сепарировали на центрифуге при 8000 об/мин 40 минут. Пасту высушивали сублимационным способом.
Липидные вещества клеток .
В результате предварительных экспериментов было установлено, что максимальное количество липидов извлекается при экстракции лиофильно высушенной биомассы смесью хлороформ-метанол (2:1). Применение других экстрагентов, таких как гексан, хлористый метилен, хлороформ, ацетон, изопропанол, этанол снижает выход липидов в два раза и более. Кроме того, использование спиртов приводит к загрязнению экстракта веществами нелипидной природы,которые затрудняют его последующую обработку. При последующем освобождении экстракта от нелипидных примесей по Фолчу /Polchе.a., 1957/ потеря фосфолипидной фракции достигает 10-15%. Значительные потери фосфолипидов наблюдаются также при экстракции нелиофилизованных клеток: в этом случае получали не более 2/3 того количества липидов, которые извлекали из сухой биомассы. Поэтому в настоящей работе применялась экстракция липидов смесью хлороформ-метанол (2:1) из лиофильно высушенных клеток. Освобождение липидов от нелипидных примесей осуществляли в ходе их хроматографирования на ДЭАЭ-целлюлозе.
При анализе суммарных клеточных липидов азотфиксиругощей бактерии Azotobacter chroococcum 92 методом тонкослойной хроматографии в система (3), (9), (10), (II) обнаружено, что суммарная липидная фракция содержит 16 основных компонентов (минорные компоненты в данной работе не рассматривались)/Придачи-на и др., 1982а/. С помощью стандартов, а также общих и специфических реагентов, липиды ориентировочно охарактеризованы как углеводороды, воска, триглицериды, убихинон, фенольный липид, гликолпипид и фосфолипиды. Предварительное фракционирование суммарных липидов проводили с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе по методу Роузера /Rouser е.а., 1963/. Этим методом суммарные липиды разделяли на 4 фракции: нейтральные малополярные липиды (фракция А), полярные нейтральные липиды (фракция Б), свободные жирные кислоты (фракция В) и фракция кислых фосфолипидов Г (таблица 9, рис.1, схема I).
