Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Галофильные бактерии и бактериородопсин в современной биотехнологии 6
1. Галобактерии 6
1.1. Применение галофильных бактерий в биотехнологии 6
1.2. Halobacterium salinarum 9
2. Пурпурные мембраны и родопсины галобактерии 10
3. Бактериородопсин: структура и функции 14
4. Основные способы изменения параметров фотоцикла бактериородопсина 19
4.1. Физико-химические воздействия 20
4.2. Замена хромофора 21
4.3. Точечные замены аминокислот 24
5. Техническое применение бактериородопсина 36
5.1. Бактериородопсин как фотохромный молекулярный материал 37
5.2. Создание голографических изображений на пленках, содержащих бактериородопсин 39
5.3. Голографическая интерферометрия 40
5.4. Обработка видеоизображений 42
5.5. Молекулярная память на основе бактериородопсина 44
5.6. Молекулярные фоторецепторы на основе бактериородопсина 47
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 49
1. Выбор объектов исследования 50
2. Окислительная модификация триметилциклогексенового кольца ретиноидов 53
3. Синтез аналогов ретиналя 58
4. Хромофорная полость бактериородопсина 62
5. Анализ данных по влиянию точечных мутаций аминокислотной последовательности на свойства бактериородопсина 64
6. Аналоги бактериородопсина 74
6.1. Культивирование//, salinarum 74
6.2. Получение аналогов бактериородопсина 77
6.3. Стабильность препаратов бактериородопсина при длительном хранении 79
6.4. Особенности фотоцикла аналогов бактериородопсина 81
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 85
1. Синтез аналогов ретиналя 87
2. Получение препаратов пурпурных мембран 92
3. Получение аналогов бактериородопсина 95
ВЫВОДЫ 97
БЛАГОДАРНОСТИ 98
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 99
АКТ ОБ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПРЕПАРАТОВ БАКТЕРИОРОДОПСИНА 117
Введение к работе
В природе обнаружено достаточно малое количество белков, функции которых связаны с преобразованием световой энергии, однако исключительно важная роль, которую они играют в процессах жизнедеятельности различных организмов, стала причиной повышенного интереса ученых к проблеме их строения и функционирования. По мере исследования свойств и механизма функционирования этих белков, был выявлен ряд особенностей, позволяющих использовать некоторые из них в технических целях, а так же разработан набор методов направленного изменения свойств белка в соответствии с технологическими требованиями.
Одним из наиболее простых и доступных преобразующих свет белков является обнаруженный в пурпурных мембранах (ПМ) галобактерий Halobacterium salinarum (ранее называемых Н. salinarium и Н. halobium) бактериородопсин (БР). Он был открыт Oesterhelt D. и Stoeckenius W. в 1971 году [1]. Экстремальные условия, в которых существует в природе данный вид бактерий (крайне высокая концентрация солей, повышенные температуры и интенсивное солнечное облучение), способствовали отбору белков, обладающих высокой устойчивостью к таким денатурирующим внешним воздействиям.
Хромофором БР является протонированный альдимин ретиналя с s-аминогруппой остатка Lys-216. Поглощая квант света, БР претерпевает цикл спектральных переходов (фотоцикл), сопровождающихся изомеризацией белка, депротонированием и репротонированием альдиминной связи и переносом протона.
Фотоцикл БР можно описать следующей последовательностью интермедиатов: В568 -» J625 -» К590 -» L550 -» M4i2 -» N560 -» О640 -» В568.
Уникальная стабильность, в сочетании с наличием фотохромных свойств
БР, наряду с простотой его производства в больших количествах обеспечивают широкий диапазон технических приложений, в которых он может быть использован [2]. Однако на сегодняшний день осуществимы только оптические устройства на основе БР, поскольку их интеграция в современные приборные системы наиболее проста.
Оптические приложения основаны на применении пленок БР -полимерных матриц различного состава с включенными в них молекулами белка. Впервые в мире такие пленки, названные "Биохром", были получены и исследованы в России в рамках проекта "Родопсин" в 1980-х годах. Была продемонстрирована эффективность и перспективность их применения в качестве фотохромных материалов и сред для голографической записи [3].
В последнее десятилетие усилиями ряда исследовательских коллективов достигнут определенный прорыв в использовании препаратов природного и модифицированного БР для создания различных устройств на их основе. Были предложены прототипы трехмерной опто-электронной памяти, фотохромных голографических сред, пространственных модуляторов оптического сигнала и биосенсоров. Одним из практических результатов проводимых в этой области исследований стало то, что в 2001 году фирма Munich Innovative Biomaterials, GmbH (МІВ) представила на рынок голографический интерферометр FringeMaker-plusR на основе пленки мутантного BPD96n-
Поскольку на функционирование БР влияет модификация как белковой, так и хромофорной частей, возникает необходимость поиска новых сочетаний модификаций хромофор-белок, позволяющих получить перспективные для технического использования препараты БР. Настоящая работа направлена на реализацию этой задачи, ее целью было комплексное исследование влияния одновременной модификации белковой и хромофорной частей на свойства БР (максимумы поглощения, время регенерации апобелков с аналогами ретиналя, особенности кинетики М-интермедиата фотоцикла и стабильность препаратов).
Диссертационная работа являлась частью плановых исследований по разработке новых оптических материалов на основе аналогов бактериородопсина, проводимых на кафедре биотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова совместно с НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Центром фотохимии РАН, Институтом биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, ОАО ЦНИТИ "Техномаш" и ФГУП «ГосНИИгенетика». Работа проводится в рамках выполнения грантов РФФИ 01-03-32078 и 02-03-06555 и гранта ИНТАС-01-0267.
Галобактерии
Галобактерии относят к архебактериям, которые представляют собой совершенно особую линию эволюции, отличающуюся как от прокариот, так и от эукариот. Эти бактерии распространены там, где есть подходящие условия для их роста: высокое содержание NaCl и других необходимых ионов, в соленых природных водоемах, бассейнах для выпаривания соли, белковых материалах (рыба, мясо), консервируемых с помощью соли [3].
В 1960-х годах начались первые эксперименты по культивированию и выделению галофильных бактерий [4-6]. Всего за прошедший период было выделено около 170 природных штаммов. В основном это были умеренно галофильные микроорганизмы, только несколько штаммов оказались экстремальными галофилами [7].
Бактерии, которым для роста необходимо присутствие NaCl, по степени галофильности делят на несколько типов. Наиболее широко используют классификацию по диапазону концентраций NaCl, в котором могут расти данные микроорганизмы, предложенную Kushner D.J. [8]: галотоллерантные (от 0 до 5% NaCl), экстремально галотоллерантные (0 до 15% NaCl), легкие галофилы (около 3% NaCl), умеренные галофилы (от 3 до 15% NaCl), пограничные экстремальные галофилы ( 15% NaCl), экстремальные галофилы (около 25% NaCl).
В IX издании определителя бактерий Берджи [9] экстремально галофильные архебактерии объединены в порядок Halobacteriales, семейство Halobacteriaceae, которое включает 6 родов и более 20 видов, различающихся формой клеток, способностью к движению, отношением к кислотности среды, устойчивостью к NaCl и другими признаками.
Исследование биохимии галобактерии позволило предложить целый ряд вариантов применения этих микроорганизмов в биотехнологии.
1.1. Применение галофильных бактерий в биотехнологии.
Способность галобактерии выживать в экстремальных условиях повышенной концентрации соли и интенсивной инсоляции обусловлена приобретенной в процессе эволюции высокой стабильностью клеточных компонент к разрушительным внешним воздействиям. Это обуславливает значительный потенциал галобактерии для биотехнологии [10]. Их большим технологическим преимуществом так же является возможность культивирования в открытом резервуаре без риска загрязнения как окружающей среды так и самой культуры. Ниже приведены основные направления использования галофильных бактерий и синтезируемых ими веществ в биотехнологии.
1. Бактериородопсин. Хотя БР обнаружен во многих штаммах экстремально галофильных бактерий, для его производства используют Halobacterium salinarum, содержащий значительные количества БР. Уникальные фотохимические свойства этого белка делают возможным его широкое техническое применение в биоэлектронике. Подробно этот вопрос будет рассмотрен в 5 разделе настоящего обзора литературы.
2. Осмотически активные вещества (осмолити). Основной их функцией в клетках галобактерий является поддержание положительного водного баланса с внешней средой, которая обладает более высокой ионной силой. Такими веществами (см. рис. 1) служат водорастворимые сахара, спирты, аминокислоты и их производные. Они накапливаются в клетках в значительных количествах, а при резком уменьшении ионной силы среды быстро секретируются. Это дает возможность легкого разделения живых клеток бактерий и синтезируемых ими осмотически активных веществ при помощи простой процедуры центрифугирования, что позволяет осуществить их эффективное биосинтетическое производство.
Пурпурные мембраны и родопсины галобактерии
В 1966 г. в поисках доказательства того, что мембраны имеют бислойную структуру с внедренными в нее белками, Oesterhelt D. et. al. [27] обнаружили участки поверхности клеток галобактерий Н. salinarum, выглядевшие под электронным микроскопом более гладкими, чем соседние участки и обычные мембраны. В 1971 г. было определено, что входящий в их состав белок сходен по структуре с родопсином [1, 34], по этой причине он был назван бактериородопсин.
Участки мембран, содержащие большое количество БР благодаря характерной окраске были названы пурпурные мембраны (ПМ). ПМ содержат сам белок (около 75% по сухому весу), некоторые липиды, каротиноиды и воду [3, 29, 35]. Обычно они занимают до 50% поверхности клетки и имеют округлую форму [29, 35] и размер около 0,5 мкм. Суммируя результаты исследования свойств ПМ, проводимых в течение последних трех десятилетий, можно отметить следующие их особенности [2, 36] (см. также табл. 1): Состоят из липидов и БР в молярном соотношении 10:1 и весовом 1:3 [37, 38];
Образуют двумерную гексагональную кристаллическую решетку из одинаково ориентированных тримеров БР;
Имеют среднюю плотность 1.18 г/см и показатель преломления 1.45-1.55;
Имеют размер около 0,5 мкм и толщину около 5 нм;
Обладают повышенной устойчивостью: о к действию солнечного света в присутствии кислорода (устойчивы в течение нескольких лет); о к действию повышенных температур (до 80С в водной суспензии и до 140С в сухих пленках) [39]; о практически при любом значении рН (от 0 до 12); о при высокой ионной силе раствора (ЗМ NaCl); о к действию многих протеаз [40, 41]; о к действию неполярных растворителей (например, гексана), но неустойчивы по отношению к полярным растворителям в смеси с водой (этанол, ацетон) [42]
Сохраняют окраску и фотохимическую активность при практически полном удалении воды;
Существует возможность встраивания ПМ в полимерные матрицы без потери фотохимических свойств [36];
Химический анализ [37] показал, что пурпурные мембраны состоят на 75% (по сухому весу) из белка (БР) и на 25% из фосфо- и гликолипидов (рис. 2), что, как отмечено выше, соответствует приблизительно десяти молекулам липидов на одну молекулу белка. Более точно липидный состав ПМ был определен при помощи метода ЯМР на ядрах Н и 31Р в сочетании с масс-спектрометрией [38], хотя следует учитывать, что он может несколько изменяться в зависимости от условий культивирования галобактерий.
Липиды обладают характерной для галобактерий особенностью: они содержат остатки дигидрофитола, присоединенных простой эфирной связью, что значительно повышает их устойчивость по сравнению с липидами ацильного типа, встречающимися у остальных живых организмов.
Бактериородопсин: структура и функции
Родопсины - белки, содержащие остаток ретиналя. Они представляют интерес для исследователей, поскольку они являются наиболее просто устроенными природными преобразователями энергии света в электрохимическую. Хронологически первым был описан зрительный родопсин входящий в состав палочек сетчатки глаза. Уровень исследований БР на сегодня выше, чем зрительного родопсина, хотя последний исследуется более 100 лет а БР - менее 40 лет, что можно связать с простотой получения БР в больших количествах, а также возникновением перспектив его технологического использования.
БР - ретиналь-содержащий протонный насос мембран галофильных бактерий рода Halobacterium, представляет собой трансмембранный белок с молекулярным весом 26 кДа, состоящий из 248 аминокислот и пронизывающий мембрану в виде семи а - спиральных тяжей. а-Спиральные участки расположены в мембране, а неспирализованные выступают за ее пределы, образуя петли. N- и С-концы полипептидной цепи находятся по разные стороны цитоплазматической мембраны: N-конец обращен во внешнюю среду, а С-конец - внутрь клетки (рис. 4) [46].
Упакованные таким образом молекулы БР организованы в тримеры, которые далее образуют кристаллическую гексагональную структуру.
Хромофором БР (см. рис. 4) является протонированный альдимин ретиналя с е-аминогруппой остатка Lys-216, который размещен в гидрофобной части молекулы. После поглощения кванта света происходит изомеризация ретиналя из all-E- в 13Z-форму. Белковое микроокружение хромофора можно рассматривать как рецептор с субстратной специфичностью для all-E- и 13Z- изомеров ретиналя, который подавляет изомеризацию по другим двойным связям, например от all-E- к 7Z-, 9Z- или 11Z-изомерам. Остальная часть полипептидной цепи обеспечивает канал протонного транспорта или экранирует хромофор от влияний внешней среды.
Рис. 4. Схематическая модель трехмерной структуры БР [27]. Семь а-спиралей формируют хромофорную полость и трансмембранный канал переноса протона. Показано положение остатков Asp85, Asp96, Asp212 и Arg82, которые принимают участие в процессе переноса протона.
Несмотря на кажущуюся простоту, очевидно, что БР представляет собой достаточно сложную систему. Прежде всего, путь, который должен пройти Н , чтобы пересечь мембрану, составляет не менее 5 нм, т. е. значительно превышает расстояние, на которое он может быть перенесен при изомеризации остатка ретиналя. Это означает, что поглощение кванта света должно приводить к возникновению напряженной конформации всей молекулы БР, служащей в дальнейшем источником энергии для переноса Н против электрохимического градиента. В организации такого переноса принимают участие а-спиральные тяжи, формирующие две части протонного канала, детальный механизм действия которых пока не известен.
Индуцированный светом протонный транспорт сопровождается рядом конформационных изменений молекулы БР, что приводит к циклическим спектральным изменениям поглощения БР в видимой и УФ областях спектра, совокупность которых называется фотоциклом (рис. 5) [27, 47].