Введение к работе
Актуальность темы. На протяжении столетий биологически активные вещества микробного происхождения имели большое значение для человечества. Одними из широко используемых и перспективных метаболитов терапевтического назначения являются эр го алкало иды, выделенные из склероций грибов рода Claviceps (ergot). Разнообразные по структуре, они используются для купирования и профилактики приступов мигрени, остановки послеродовых кровотечений, лечения болезни Паркинсона, шизофрении, опухолей молочной железы и мастопатии, артериальной гипотонии. Среди эргоалкалоидов клавинового ряда одним из наиболее перспективных является агроклавин. Этот алкалоид, а также его многочисленные производные способны эффективно связываться с рецепторами нейромедиаторов и влиять на зависимые от них физиологические процессы. Препараты на основе агроклавина являются ингибиторами секреции пролактина и могут быть использованы для лечения мастопатии и некоторых опухолей молочной железы, а также в качестве антипаркинсонического средства. Значительный интерес к агроклавину проявляется в связи со способностью блокировать деление опухолевых клеток и усиливать противоопухолевое действие иммунной системы организма. Высокая и разнообразная биологическая активность агроклавина позволяет использовать его в фундаментальных исследованиях как биохимический реактив. В этом качестве алкалоид предлагается крупными компаниями ICN Pharmaceuticals, Sigma-Aldrich и др.
В литературе имеются данные о распространении агроклавина среди микроскопических грибов и некоторых растений, а также о путях его биосинтеза.-В отличие от пептидных эргоалкалоидов, получаемых как из паразитарных, так и сапрофитных культур грибов рода Claviceps, для выделения агроклавина используют только сапрофитные культуры. Несмотря на многочисленность проведенных ранее исследований эффективная технология получения агроклавина отсутствует. Описана зависимость образования алкалоида от состава среды и условий выращивания культур. Однако, данных о перспективных продуцентах агроклавина недостаточно, а методы поиска новых продуцентов сложны и требуют длительного времени. Оптимальные с точки зрения алкалоидообразова-ния физиологические потребности продуцентов штаммоспецифичны. Уровень накопления агроклавина у известных штаммов-продуцентов невысок. Целевой продукт, как правило, выделяется в составе смеси соединений сходной структуры, для отделения примесей требуется многоэтапная очистка.
Таким образом, имеющиеся данные не могут служить в полной мере базой для разработки биотехнологии получения препарата агроклавина.
Цель и задачи работы. Целью работы являлось создание способа микробиологического получения агроклавина и разработка экспресс-метода поиска его новых продуцентов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Для достижения этих целей необходимо было решить следующие задачи: - получить высокопродуктивную культуру методом мутагенеза коллекционного штамма-продуцента из рода Claviceps;
исследовать зависимость алкалоидобразования у полученного мутанта от условий культивирования; определить наиболее благоприятные для биосинтеза агроклавина состав среды и условия выращивания продуцента;
оптимизировать условия хранения мутантного штамма-продуцента;
разработать лабораторный регламент получения агроклавина.
подобрать олигонуклеотидные праймеры и условия проведения ПЦР для амплификации гена диметилаллилтриптофансинтетазы (ДМАТ-синтетазы) микроскопических грибовродовС/яи'се/«иРешс/7/ш»г.
Научная новизна работы. На основании анализа хемотаксономических и
филогенетических признаков штамм Claviceps sp. ВКМ F-2609 идентифицирован как Claviceps fusiformis. Методом двухступенчатого ультрафиолетового мутагенеза получен мутантный штамм С. fusiformis с повышенным содержанием агроклавина в суммарной смеси эргоалкалоидов. Установлено, что преимущественное накопление данного метаболита обусловлено, в основном, низкой активностью агроклавингидроксилазы, катализирующей превращение агроклавина в элимоклавин. Впервые созданы олигонуклеотидные праймеры и подобраны условия проведения ПЦР для выявления гена ДМАТ-синтетазы микроми-цетов родов Claviceps и Penicillium. Полученные результаты использованы для создания экспресс-метода поиска продуцентов агроклавина и других алкалоидов с полной тетрациклической эрголиновой структурой.
Практическое значение. Получен стабильный мутантный штамм С. fusiformis с 106 с повышенным уровнем накопления агроклавина, сохраняющий биосинтетическую активность в течение более двух лет. Оптимизированы состав среды и условия его выращивания. Разработана биотехнология получения алкалоида агроклавина с выходом до 3 г/л. Создан лабораторный регламент получения препарата агроклавина.
Разработан экспресс-метод поиска новых продуцентов агроклавина и других эргоалкалоидов среди микроскопических грибов с использованием ПЦР. На примере анализа зараженного зерна показана возможность использования данного метода для поиска и обнаружения продуцентов эргоалкалоидов в природных объектах.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на VII Молодежной конференции ботаников (Санкт-Петербург, 15-19 мая 2000), на Первом Съезде микологов России (Москва, 11-13 апреля 2002), на Первом всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 20-21 февраля 2003), на 7-м Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов "Биотехнология-2003 (Пущино, 24-25 ноября 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 4 статьи, 5 тезисов докладов, лабораторный регламент, заявка на выдачу патента РФ № 2003109799, приоритет от 08.04.2003.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, списка литературы лУ/'ссылок), приложения. Работа изложена на 126стр. машинописного текста, включает 22 таблицы и 36 рисунков.
