Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Перспективы глубокой переработки зерна в России 7
1.2. Перспективы микробиологического получения органических кислот 8
1.3. Лимонная кислота, её характеристика и применение 13
1.4. Продуценты ЛК 17
1.5. Селекция продуцентов 25
1.6. Условия биосинтеза лимонной кислоты у дрожжей Y. lipolytica 31
1.7. Механизм биосинтеза лимонной кислоты у дрожжей Y. lipolytica 35
1.8. Глюкоза - субстрат для микробных трансформаций 38
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объекты исследования 43
2.2. Культивирование дрожжей
2.2.1. Состав и подготовка основной среды 43
2.2.2. Подготовка посевного материала 4 4
2.2.3. Методы культивирования дрожжей 4 4
2.3. Метод получения мутантов – активных продуцентов лимонной кислоты 46
2.3.1. Получение мутантов при облучении ультрафиолетом (УФ) 46
2.3.2. Индукции мутаций нитрозогуанидином (НГ) 46
2.3.3. Состав питательных сред для скрининга мутантов 47
2.4. Аналитические методы 47
2.4.1. Методы контроля роста дрожжей 47
2.4.2. Определение концентрации глюкозы 48
2.4.3. Определение концентрации органических кислот 49
2.4.4. Определение концентрации ЛК химическим методом 49
2.4.5. Определение трео-Ds-изолимонной кислоты энзиматическим методом 50
2.4.6. Анализ содержания азота 51
2.4.7. Определение содержания белка
2.5. Методы расчета технологических параметров ферментации 52
2.6. Определение активности ферментов з
2.6.1. Получение бесклеточных экстрактов 53
2.6.2. Методы определения активности ферментов 53
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение
3.1. Отбор продуцента и условий культивирования, оптимальных 55 для получения ЛК из глюкозы
3.2. Получение мутантных штаммов Y. lipolytica с применением УФ- 60 облучения и N-метил-N -нитро-N-нитрозогуанидина
3.2.1. Обработка Y. lipolytica ВКМ Y-2373 ультрафиолетовым облучением (УФ) 60
3.2.2. Обработка Y. lipolytica ВКМ Y-2373 с N-метил-N -нитро-N- 61 нитрозогуанидином (НГ)
3.2.3. Отбор продуцентов
3.2.3.1. Селективная работа на средах с ацетатом и цитратом 64
3.2.3.2. Отбор продуцентов на твердой среде с мелом или индикатором 65 бромкрезоловым зеленым
3.2.4. Отбор продуцентов в жидкой среде 69
3.3. Получение мутантов с применением комбинированного мутагенеза 70 и оценка их кислотообразующей активности
3.4. Характеристика мутанта Y. lipolytica № 15 76
3.5. Биосинтез лимонной кислоты у Y.lipolytica №15 из глюкозы в ферментере 77
3.6. Способы культивирования, обеспечивающие продолжительный и 80 стабильный синтез ЛК из глюкозы у мутанта Y.lipolytica № 3.6.1. Использование мембранного модуля для биосинтеза ЛК 81
3.6.2. Отъемно-доливной метод культивирования 84
3.7. Особенности роста мутанта Y. lipolytica № 15 и синтеза ЛК при 88
использовании рапсового масла в качестве источника углерода
3.8. Проверка синтезирующей активности мутанта Y. lipolytica № 15 на средах 98
с ферментолизатом осины в колбах
3.9 Аминокислотный состав биомассы продуцента 101
Заключение 106
Выводы 110
Список сокращений и условных обозначений
Список литературы
- Лимонная кислота, её характеристика и применение
- Метод получения мутантов – активных продуцентов лимонной кислоты
- Получение мутантных штаммов Y. lipolytica с применением УФ- 60 облучения и N-метил-N -нитро-N-нитрозогуанидина
- Получение мутантов с применением комбинированного мутагенеза 70 и оценка их кислотообразующей активности
Лимонная кислота, её характеристика и применение
Процесс получения итаконовой кислоты сходен с используемым в настоящее время процессом получения ЛК. Субстратом является меласса, которая должна присутствовать в достаточных количествах при одновременном дефиците фосфора и железа. Соли цинка, магния и меди обязательно должны присутствовать в среде, т.к. потребность продуцента в них высока. Поскольку итаконовая кислота токсична, то при накоплении ее в среде более 7 % рост продуцента снижается и синтез кислоты ингибируется. Дробные добавки гидроксиаммония позволяют нейтрализовать ее токсичность.
ЯК в химической промышленности широко используется как исходное сырье для получения четырехуглеродных соединений, таких как адипиновая кислота, 1,4-бутандиол, тетрагидрофуран, N- метилпироллидон и других. Ароматические и гетероциклические амины янтарной кислоты применяют в производстве некоторых красителей и инсектицидов. Диэтилсукцинат (ароматизатор с цветочным запахом) используется в парфюмерной промышленности. ЯК входит в состав новых видов упаковочного материала, способных разлагаться на нетоксичные продукты (Zeikus et al., 1999; Carole et al., 2004). Отмечается положительное использование сукцината при кормлении животных (Samuelov et al., 1999). Кроме того, в последнее время важными областями применения ЯК стали пищевая промышленность и здравоохранение. Установлено, что ЯК является сигнальным веществом, связывающим энергетическую и гормональную системы организма (Кондрашова, 1991; 2002). ЯК является партнером адреналина в деятельности симпатической нервной системы как активатора физиологических функций. На основании этих исследований предложено использовать ЯК в качестве природного профилактического и лечебного средства (Кондрашова 2002).
В промышленности ЯК производится химическим синтезом из бутана через малеиновый ангидрид (Zeikus et al. 1999; Carole et al. 2004). ЯК, которая используется в пищевой промышленности и здравоохранении, получается с помощью химической переработки янтаря (методом сухой перегонки) (Carole et al., 2004). В растворе ЯК может существовать в нескольких конформерных формах и соотношение конформеров и динамика их взаимных переходов может определять их биологическую активность (Kagaki et al., 1964).
В последние годы отмечается интерес к производству ЯК микробиологическим путем. Это обусловлено большей экологической безопасностью производства, а также высокой чистотой получаемых препаратов. Стоимость ЯК, производящейся микробиологическим путем с использованием селекционированных мутантных штаммов, намного ниже, чем полученной путем химического синтеза (Zeikus et al., 1999). Известными продуцентами ЯК являются анаэробные бактерии Anaerobiospirillum succiniciproducens (Lee et al., 1999b; Samuelov et al., 1999; Lee et al., 2003), Actinobacillus succinogenes (Guettler et al., 1999) и Escherichia coli (Lin et al., 2005 (a, b); Wu et al., 2007), а в качестве источника углерода используются углеводы. Имеются работы по исследованию принципиальной возможности синтеза ЯК аэробными организмами – дрожжами и грибами. В частности, синтез ЯК обнаружен у грибов Penicillium simplicissimum (Gallmetzer et al., 2002), растущих на глюкозе, дрожжей рода Candida при их культивировании на н-алканах (Sato et al., 1972) или этаноле (Ермакова, Мандева, 1981; Мандева, 1981; Мандева c соавт., 1981) и Saccharomyces cerevisiae при росте в среде c глюкозой (Lupianez et al., 1974; Arikawa et al., 1999). Исследована возможность получения ЯК путем восстановления фумаровой кислоты с использованием грибов и бактерий (Moon et al., 2004). Сравнительно недавно в лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов разработан оригинальный способ получения ЯК, включающий микробиологический синтез -кетоглутаровой кислоты из этанола с использованием дрожжей Yarrowia lipolytica и ее дальнейшее окисление до ЯК в присутствии H2O2 (Юсупова, 2011; Kamzolova et al., 2009). Данный процесс позволяет получать ЯК в концентрации 63,4 г/л с выходом 58% от потребленного субстрата. Произведенная микробиологическим способом ЯК выделена из фильтрата культуральной жидкости, очищена и охарактеризована. При выделении из фильтрата выход ЯК составлял 82%, чистота получаемого продукта - 100%. Качество получаемого продукта соответствует квалификации "biochemical grade", что подтверждено результатами исследования окисления ЯК митохондриями печени крыс.
В настоящее время в России ни одна из названных кислот в промышленном масштабе не производится. Организация микробиологического производства данных органических кислот является одной из приоритетных задач в промышленной микробиологии.
Лимонная кислота (ЛК) - моноокситрикарбоновая кислота, которая кристаллизуется из водных растворов с одной молекулой воды (моногидрат лимонной кислоты) в виде бесцветных кристаллов ромбообразной формы. Молекулярная масса моногидрата ЛК составляет 210, плотность 1,540 г/см3, температура плавления 70-75 оС. При показателях температуры кристаллизации более 36,6 оС выделяется безводная ЛК, имеющая молекулярную массу 192 и температуру плавления до 153 оС. Кислота разлагается при нагревании до 175 оС, хорошо растворима в воде (1460 г/л при 20 оС) и умеренно - в этаноле (620 г/л при 25 оС). Соли лимонной кислоты – цитраты, плохо растворимы в воде (Карклиньш, Лиепиньш, 1993).
ЛК широко распространена в природе. Особенно много ее в незрелых фруктах и ягодах (лимоны, клюква, яблоки, виноград, брусника и другие) (до 5%) и в соках (до 9%), где ЛК является естественным консервирующим агентом. Лимоны и содержащуюся в них ЛК люди употребляли издавна. Еще Авиценна упоминал о лечебных свойствах лимонов.
В год ЛК получают 1 млн. 600 тыс. тонн, а ее производство увеличивается примерно на 5 % (Berovic and Legisa, 2007; Anastassiadis et al., 2008). В таблице 3 собраны сведения о применении ЛК в различных отраслях промышленности.
ЛК необходима в пищевой промышленности для производства алкогольных и безалкогольных напитков, кондитерских изделий, ее используют для осветления вина, придания терпкости и улучшения вкуса, рафинирования растительных масел, а также для производства сгущенного молока. Также при попадании в организм человека с продуктами питания ЛК стимулирует секреторные функции поджелудочной железы, способствует выделению поджелудочного сока и повышению усвояемости пищи. Значительное увеличение потребления ЛК в мире за последние 10-15 лет связано с появлением низкокалорийных безалкогольных напитков на основе аспартама и других подсластителей. Натриевые соли ЛК (цитрат натрия) способны стимулировать пенообразование и поддерживать механическую устойчивость пены, поэтому ЛК используют в кулинарии при изготовлении выпечки, как антиоксидант, консервант, для контроля рН продукта (Bal A, Marshall, 1998; Christopher et al., 2003). Для человека суточная доза ЛК составляет 50-120 мг/кг.
При производстве молочных продуктов: используется в сливках для стабилизации казеина, выступает в качестве эмульгатора для стабилизации фаз (воды и масла) в сыре и улучшает органолептические свойства продукта (Bal A, Marshall, 1998; Christopher et al., 2003).
Метод получения мутантов – активных продуцентов лимонной кислоты
Для культивирования дрожжей использовали среду Ридер следующего состава (г/л): минеральные соли - (NH4)2S04 - 3,0; MgS047Н2О - 0,7; Ca(N03) 2 - 0,4; NaCl - 0,5; КН2РО4 -0,1; К2НРО4 - 1,0; микроэлементы (мг/л): KJ - 0,1; В - 0,01; Мп2+ - 0,01; Zn2+ - 0,03; Cu2+ - 0,01; Мо2+ - 0,01; Fe2+ - 0,05 (Burkholder, 1944); агар-агар г/л - 20,0. Дрожжевой автолизат «Difco» в количестве 0,5 г/л использовали как источник витаминов, пуриновых и пиримидиновых оснований, а также аминокислот.
В качестве источника углерода использовалась глюкоза (Украина; «Servа» Германия) растительные масла, ферментолизаты древесины.
Исследовалась способность дрожжей синтезировать ЛК. Клетки культивировали в колбах объемом 750 мл с 50 мл минеральной среды Ридер на качалке (180-200 об/мин) в условиях лимитирования роста клеток азотом при температуре 28оС в течение шести суток. Субстрат вносили дробно, его конечная концентрация составляла 20 г/л. Аэрация в этих условиях составляла 1,95 г О2/л/час, концентрация азота в среде - 63 мг/л. Объем посевного материала - 5% от объема среды. Подтитровку вели 10%-ным раствором NaOH, значение рН поддерживали на уровне 5,0-6,0.
Способность дрожжей синтезировать кислоты оценивалась на селективной среде с мелом в чашках Петри. Состав среды (г/л): глюкоза - 20,0; МgSO47H20 - 0,7; Ca(N03)2 - 0,4; NaCl - 0,5; КН2Р04 - 1,0; К2НР04 - 0,1; дрожжевой автолизат - 8,0 мл/л (содержание аминного азота не выше 60 мг/л); микроэлементы по Буркгольдеру (Burkholder, 1944); бакто-агар - 20,0. Стерильный мел (CaCOз - 6,0 г/л) вносили непосредственно перед разливом в чашки в разогретую среду. На полностью остывшую среду репликатором наносили клетки исследуемых культур. Клетки инкубировали в течение 6 суток при 28оС. По величине зоны растворения мела судили об активности кислотообразования.
Посевной материал готовили путем отсева рабочей культуры на косяки с сусло-агаром, которые затем выращивали в термостате при температуре (28±0,5)С в течение 3-4 суток. Выросшую культуру использовали сразу или поддерживали в холодильнике при температуре +4оС в течение трех суток. Посевной материал для опытов, проводимых в колбах, выращивался следующим образом: культура отсевалась на косяки с сусло-агаром, выдерживалась трое суток в термостате при температуре 28-29оС; пересев дрожжей с косяка в колбу с 50 мл среды Ридер методом «смыва» - первичный инокулюм, источник азота: (NH4)2S04 - 3,0 г/л. Продолжительность выращивания одни сутки; Посевной материал для ферментера выращивался следующим образом: культура отсевалась на косяки с сусло-агаром, выдерживалась трое суток в термостате при температуре 28-29оС; пересев дрожжей с косяка в колбу с 100 мл среды Ридер методом «смыва» - первичный инокулюм, источник азота: (NH4)2S04 - 3,0 г/л. Продолжительность выращивания одни сутки; посев по 5 мл первичного инокулюма в две колбы со 100 мл жидкой среды Ридер. источник азота: (NH4)2S04 - 3,0 г/л. Продолжительность выращивания одни сутки.
Посевной материал выращивали в колбах Эрленмейера объемом 750 мл с минеральной средой Ридер на круговой качалке (180-200 об/мин) при температуре 28-29оС.
Для культивирования дрожжей в колбах: посев по 5 мл первичного инокулюма в две колбы с 50 мл жидкой среды Ридер, источник азота: (NH4)2S04 - 3,0 г/л; продолжительность выращивания 6 суток.
Культивирование природного штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373 и его мутанта Y. lipolytica № 15 проводили в режиме периодического культивирования в ферментере АНКУМ-2М (Россия) объемом 3 л (исходный объем среды 1,5 л) и объемом 10 л (исходный объем среды 5 л). Температуру поддерживали автоматически (28,0±0,5С), концентрацию растворенного в среде кислорода (55-60% от насыщения), рН среды 5,0 (подтитровкой 20%-ным раствором NaOH). Состав среды был следующий (г/л): глюкоза, глюкозосодержащее сырье, рапсовое масло (концентрация указана в тексте); (NH4)2S04 - 3,0; МgS047H20 - 0,7; Ca(N03)2 - 0,4; NaCl - 0,5; КН2Р04 - 2,0; К2НР04 - 0,2; дрожжевой экстракт «Difco» - 0,5; раствор микроэлементов по Буркгольдеру; тиамин - 0,5 мг/л. Культивирование продолжалось 6 суток.
Периодическое и отъемно-доливное культивирование Y. lipolytica № 15 проводилось в ферментерах Biostat В Plus («Sartorius», Germany) объемом 5 л (исходный объем среды 2 л). Температуру поддерживали автоматически (29,0±0,1С), концентрацию растворенного в среде кислорода (25±5% от насыщения), рН среды 5,5 (подтитровкой 40%-ным раствором NaOH).
При периодическом режиме питательная среда имела следующий состав (г/л): глюкоза - 50; NH4C1 - 3,0; MgS047Н2О - 1,0; К2НР04 - 0,2; дрожжевой экстракт «Difco» -1,0. После 24 и 60 ч культивирования вносилось 30 г/л глюкозы. Общее содержание глюкозы составляло 110 г/л. При отъемно-доливном режиме питательная среда имела следующий состав (г/л): глюкоза - 50; NH4C1 - 3,0; MgS04 7Н2О - 1,0; К2НР04 - 0,2; дрожжевой экстракт «Difco» -1,0. Процесс шел в периодическом режиме первые 75 ч, затем часть культуральной жидкости 30% и 40% сливалась, и в ферментер добавлялась свежая питательная среда. Процесс проводили 4 раза для каждого варианта. Состав доливаемой среды был следующий (г/л): NH4C1 - 4,0; MgS047Н2О - 1,0; К2НР04 - 0,2; дрожжевой экстракт «Difco» - 1,0. Объем культуральной жидкости в начале каждого цикла отъемно-доливного режима составлял 2 л, а концентрация глюкозы - 50 г/л. Окончание каждого из циклов отъемно-доливного культивирования определяли измерением содержания глюкозы; долив необходимого объема питательной среды осуществлялся при содержании глюкозы меньше 0,5 г/л.
Также проводили непрерывное культивирование мутантного штамма Y. lipolytica №15 в ферментере Biostat В Braun (Германия) («Sartorius», Germany) объемом 3 л (исходный объем среды 1,2 л), оснащенном выносным спиральным мембранным модулем (Bioengineering AG) и перистальтическим насосом (Ismatec). В модуль помещались мембраны из полиэфирсульфона («Sartorius»), диаметр которых составлял 47 мм, размер пор - 0,45 мкм. Температуру поддерживали автоматически (29,0+0,1 С), концентрацию растворенного в среде кислорода (25+5% от насыщения), рН среды 5,5 (подтитровкой 40%-ным раствором NaOH).
Питательная среда при культивировании с использованием мембранного модуля имела следующий состав (г/л): глюкоза - 20; NH4C1 - 4,0; MgS047Н2О– 1,0; К2НР04 - 0,2; дрожжевой экстракт «Difco» - 1,0. Среда для непрерывного культивирования содержала (г/л): глюкоза 50 и бакто-пептон - 0,75.
Посевная среда для этих режимов культивирования имела следующий состав (г/л): глюкоза - 20; дрожжевой экстракт «Difco» - 2,0; бакто-пептон - 3,0. При периодическом, отъемно-доливном и непрерывном способах культивирования Y. lipolytica № 15 в качестве источника микроэлементов использовали водопроводную воду.
Получение мутантных штаммов Y. lipolytica с применением УФ- 60 облучения и N-метил-N -нитро-N-нитрозогуанидина
Трехсуточная культура мутанта Y. lipolytica № 15 в жидкой глюкозо-пептонной среде представлена овальными, удлиненно-овальными и округлыми клетками размером 4,0-6,0 x 4,5 - 13 мкм, также встречаются небольшие округлые клетки 2,0 x 3,0 мкм (Рисунок 13). Почкование полярное или латеральное. Клетки единичные или в цепочках, включающих 3 - 4 клетки. Штрих на глюкозо-пептонном агаре непрерывный, плоский, блестящий, белого цвета, пастообразный, края ровные. Колонии на сусло-агаре (возраст 4 недели) белого цвета, пастообразные, слегка приподнятые в центре, слегка шероховатые, с фестончатым краем. На 2-е сутки роста на жидкой глюкозо-пептонной среде образуются тонкая пленка, кольцо на стенках, тяжелый осадок на дне пробирки.
Строгий аэроб. Ассимилирует: н-алканы, глюкозу, этанол, ацетат, глицерин (Morgunov et al., 2013), глицерин-содержащие отходы производства биодизельного топлива (Kamzolova et al. 2015), рапсовое и подсолнечное масла, результаты представлены в статье Камзоловой с соавторами (2007, 2011), олеиновую кислоту, янтарную, яблочную, лимонную кислоты, не ассимилирует сахарозу. Усваивают азот только в аммонийной форме, способны гидролизовать мочевину. Не растет в безвитаминной среде, требует тиамин. Оптимальное pH для роста 5,0. Не растет при 37oC. Максимальная температура роста при 290C. Характеризуется высокой активностью экзолипазы. Эти свойства идентичны тем, что описаны в определителе Kreger van Riy "The Yeast. A taxonomic study" (1984), для дрожжей вида Y. lipolytica.
В ходе последующей работы было выявлено, что мутант Y. lipolytica №15 может ассимилировать в качестве источника углерода ряд новых возобновляемых субстратов (ферментолизат, рапсовое масло).
Дальнейшие эксперименты были связаны с изучением кислотообразующей активности мутанта Y.lipolytica №15 в 10-ти л ферментёре с рабочим объемом 5 л в условиях лимитирования роста клеток азотом. Концентрация сульфата аммония (NH4)2S04, лимитирующая рост клеток Y.lipolytica, подбиралась сотрудниками лаборатории экспериментальным путём в колбочных экспериментах на полноценной среде с глюкозой, которая присутствовала в избытке. Было показано, что концентрация (NH4)2S04 в диапазоне от 0,01 до 0,3 г/л лимитирует рост дрожжей, о чём свидетельствовала пропорциональная зависимость между предельной величиной нарастающей биомассы и концентрацией (NH4)2S04 (Мандева, 1981). При культивировании в ферментере штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373 концентрация (NH4)2S04 была увеличена до 3 г/л с необходимостью получения рабочей биомассы на уровне не менее 10 г/л. Все остальные компоненты среды Ридер брались в количестве в два раза большем, чем обычно для избежания лимитирования культуры дрожжей каким-либо иным фактором (Глазунова, Финогенова, 1976). При культивировании lipolytica №15 также использовали эту концентрацию (NH4)2S04.
Полученные результаты приведены на рисунке 14. В экспоненциальной фазе (до 24 ч) рост Y. lipolytica №15 поддерживался на максимальном уровне, питательные вещества имелись в избытке, а ингибиторы роста отсутствовали; значение максимальной удельной скорости роста (шах) у Y. lipolytica №15 составляло 0,205 ч"1, а выход клеток по массе (YX/s) - 61,4% от потребленной глюкозы. С 24 ч культивирования культура переходила в фазу замедления роста, вызванную исчерпанием азота из среды, и удельная скорость роста постепенно (a)
Динамика роста, потребления азота и синтеза ЛК и ИЛК в среде с глюкозой у Y. lipolytica №15 снижалась до 0,016 ч ; на 44 ч рост культуры полностью прекращался. В экспоненциальной фазе выделения ЛК в среду не происходило; интенсивная экскреция ЛК отмечалась в фазе замедления роста и в стационарной фазе после прекращения роста культуры. Удельная скорость синтеза ЛК, высокая (0,043 - 0,072 г ЛК/г биомассы/ ч) в начале процесса биосинтеза, снижалась до 0,028 г ЛК/г биомассы/ ч при накоплении свыше 50 г/л ЛК. В конце культивирования на 192 ч накопление ЛК составляло 100 г/л, содержание ИЛК было незначительно (4,0 г/л), выход ЛК по массе (УЛК) составил 63% от потребленной глюкозы.
Сравнительные данные, характеризующие эффективность процессов синтеза ЛК у природного штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373 и мутанта Y. lipolytica №15 представлены в таблице 16.
У мутанта №15 накопление ЛК, выход ЛК по массе (УЛК) и удельная скорость синтеза ЛК (qp) - на 25, 37 и 12,5%, соответственно выше, чем у исходного штамма. Для того, чтобы создать представление о причине повышенного синтеза ЛК у мутанта Y. lipolytica №15 в сравнении с исходным штаммом Y.lipolytica ВКМ Y-2373 проведено определение активности ЦТК. В таблице 17 представлены данные, характеризующие активности ключевых ферментов ЦТК: цитрат-синтаза (ЦС), аконитат-гидратаза (АГ), НАД- и НАДФ-зависимые изоцитрат-дегидрогеназы (НАД- и НАДФ-ИЦДГ), осуществляющие три последовательные реакции цикла в период экспоненциального роста и активного синтеза ЛК. Сравнительно низкие активности АГ и НАД-ИЦДГ в сравнении с ЦС обусловливают способность как природного штамма, так и мутанта в условиях лимитирования роста клеток азотом экскретировать ЛК и ИЛК, а не другие интермедиаты цикла Кребса. (Моргунов, 2009)
Получение мутантов с применением комбинированного мутагенеза 70 и оценка их кислотообразующей активности
В настоящей работе природный штамм дрожжей Y. lipolytica ВКМ Y-2373 обрабатывали УФ-облучением и N-метил-N -нитро-N-нитрозогуанидином. После обработки мутагенами анализировали те чашки, где процент выживаемости подвергнутых мутагенному воздействию клеток составлял менее 1% в случае УФ и менее 25% в случае НГ. Под влиянием УФ и НГ были получены морфологически различные варианты. Для быстрого отбора желаемых вариантов была разработана рациональная схема отбора полученных мутантов. На первом этапе проводилась селекция на среде с ацетатом. Предполагалось, что сниженная способность к росту на ацетате обусловлена различными нарушениями в цикле трикарбоновых кислот, и блокировка цикла на уровне одного или нескольких ферментов могла бы приводить к сверхсинтезу цитрата клетками. В результате скрининга на средах с ацетатом среди 1500 мутантов было отобрано 16 вариантов. На втором этапе активные продуценты выявлялись на твердых средах с мелом или бромкрезолом в условиях лимитирования азотом при избытке глюкозы. В результате двухступенчатого отбора из 16 ацетат-негативных вариантов были отобраны 8 мутантов. С целью идентификации кислот, а также для проверки результатов, полученных методами селекции на твердых средах, проводили культивирование 8 мутантов в жидкой среде Ридер с глюкозой в условиях дефицита азота.
Все мутанты синтезировали преимущественно лимонную кислоту. У трех мутантов продуктивность синтеза была в среднем на 23,0 % выше, чем у исходного штамма. Полученные данные показали эффективность применения ультрафиолетового облучения и нитрозогуанидина.
В последующей работе для усиления действия мутагенов применили комбинированное воздействие УФ-облучением и N-метил-N -нитро-N-нитрозогуанидином, в результате которого было отобрано 1000 колоний, характеризующиеся сниженной скоростью роста на среде с глюкозой. Из них на среде с ацетатом селекционированы 27 мутантов, у которых кислотообразующая активность была выше, чем у природного штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373. Штаммы были проверены в жидкой среде и среди них обнаружены три мутанта, у которых продуктивность была выше на 43,9%, по сравнению с исходным штаммом Y. lipolytica ВКМ Y-2373. Последующая работа проводилась в ферментере с одним из наиболее активных вариантов - мутантом Y. lipolytica N 15.
В результате исследований были изучены физиологические и биохимические особенности синтеза ЛК мутантом дрожжей Y. lipolytica №15 из различных источников углерода.
На полноценной минеральной среде с глюкозой мутант Y.lipolytica №15 характеризуется более высокими значениями удельной скорости роста (max) (0,31 ч-1), скорости потребления глюкозы (1,45 г/г), скорости потребления азота (0,042 г/г) и выходом биомассы (Yx/s) (53% от потребленной глюкозы) по сравнению с исходным штаммом Y.lipolytica ВКМ Y-2373. Интенсивный синтез кислот начинался после полного потребления азота и перехода культуры в фазу замедленного роста и далее – в стационарную фазу роста. Синтез кислот продолжался до тех пор, пока в среде присутствовала глюкоза. На 192 ч мутант синтезировал 100 г/л ЛК и 4,3 г/л ИЛК (Таблица 24). Продуктивность процесса биосинтеза ЛК (0,67 г/л ч) и выход YЛК (63%) у мутанта Y.lipolytica №15 соответствуют лучшим мировым показателям: при культивировании дрожжей C.lipolytica Y1095 и Y. lipolytica ATCC 20346 в условиях периодического режима с подпиткой в ферментере авторам удалось достичь концентраций 78,5 г/л и 69,0 г/л с выходами по биомассе 0,79 г/г и 0,52 г/г, соответственно (Rane and Sims, 1993; Moresi, 1994).
Было показано, что продолжительность процессов кислотообразования в периодическом режиме ограничена. В связи с этим были изучены возможности применения различных способов культивирования дрожжей, ведущих к увеличению длительности биосинтеза и эфективности кислотообразования.
С целью увеличения продолжительности микробиологических процессов при получении метаболитов, экскретируемых в культуральную жидкость был использован биореактор с выносным спиральным мембранным модулем, что позволило увеличить время ферментации до 480 ч. Интенсивное кислотообразование (39-32,8 г/л) наблюдалось до 300 ч (Таблица 24). Концентрация ИЛК составляла менее 4 % от суммы кислот. После 300 ч наблюдалось снижение синтеза ЛК. Снижение образования ЛК не связано с повышением ее концентрации в культуральной жидкости, а скорее всего со снижением метаболической активности клеток.
Наиболее эффективным для продолжительного стабильного процесса биосинтеза ЛК является отъемно-доливной метод, при котором производился отъем культуральной жидкости через определенные промежутки времени, и в ферментер добавлялась свежая питательная среда с содержанием всех компонентов, в том числе и азота, в количестве, достаточном для возобновления клеточного роста. При проведении экспериментов варьировали количеством доливаемой среды и длительностью циклов, в каждом из которых культивирование осуществляли в периодическом режиме. У Y.lipolytica №15 в условиях продолжительного культивирования в отъемно-доливном режиме накопление ЛК составило 68,1-69,4 г/л в течение 53 суток (Таблица 24).
В последнее время, в связи с экономным отношением к растительным ресурсам в высокоразвитых странах возобновляемое (дешевое) растительное сырье становится главным объектом исследований и разработок комплексных и экологически чистых технологий в продукты, используемые в различных областях промышленности; разрабатываются процессы микробиологического получения белка и липидов, аминокислот и органических кислот.
В патентной и научной литературе мало сведений о биосинтезе ЛК из растительного сырья. В ряде стран (США, Польша, Греция) предпринимаются попытки разработать процесс получения ЛК из глюкозо-содержащих гидролизатов древесных отходов c помощью мутантных штаммов Y. lipolytica. Эти работы не привели к положительным результатам в связи с тем, что биохимический механизм синтеза кислоты до конца не изучен. Имеются единичные сведения о биосинтезе ЛК у Y. lipolytica из растительных масел.
В настоящей работе также была проведена проверка способности мутанта Y.lipolytica №15 расти на средах с рапсовым маслом и с ферментолизатом осины.
Дрожжи Y. lipolytica № 15 в конце культивирования с рапсовым маслом (192 ч) накапливали 175,0 г/л ЛК, в то время как содержание ИЛК было незначительно (5,6 г/л), соотношение ЛК к ИЛК составляло 32 : 1. Для сравнения, природный штамм Y. lipolytica ВКМ Y-2373 показывал подобную динамику накопления лимонных кислот. Однако, к концу культивирования в среде накапливалось 87 г/л ЛК и 72 г/л ИЛК, соотношение ЛК:ИЛК составило 1,21:1. Следует отметить, что нам впервые в мире удалось достичь таких высоких показателей преимущественного биосинтеза ЛК из растительных масел с использованием мутанта дрожжей Y. lipolytica.