Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Биотехнологические приемы оценки устойчивости сталей к коррозии, вызываемой бактериальной сульфатредукцией, и пути повышения коррозионной устойчивости нефтегазового оборудования Зайцева Ольга Владимировна

Биотехнологические приемы оценки устойчивости сталей к коррозии, вызываемой бактериальной сульфатредукцией, и пути повышения коррозионной устойчивости нефтегазового оборудования
<
Биотехнологические приемы оценки устойчивости сталей к коррозии, вызываемой бактериальной сульфатредукцией, и пути повышения коррозионной устойчивости нефтегазового оборудования Биотехнологические приемы оценки устойчивости сталей к коррозии, вызываемой бактериальной сульфатредукцией, и пути повышения коррозионной устойчивости нефтегазового оборудования Биотехнологические приемы оценки устойчивости сталей к коррозии, вызываемой бактериальной сульфатредукцией, и пути повышения коррозионной устойчивости нефтегазового оборудования Биотехнологические приемы оценки устойчивости сталей к коррозии, вызываемой бактериальной сульфатредукцией, и пути повышения коррозионной устойчивости нефтегазового оборудования Биотехнологические приемы оценки устойчивости сталей к коррозии, вызываемой бактериальной сульфатредукцией, и пути повышения коррозионной устойчивости нефтегазового оборудования
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Зайцева Ольга Владимировна. Биотехнологические приемы оценки устойчивости сталей к коррозии, вызываемой бактериальной сульфатредукцией, и пути повышения коррозионной устойчивости нефтегазового оборудования : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.23 / Зайцева Ольга Владимировна; [Место защиты: Ин-т биологии Уфим. науч. центра РАН].- Самара, 2009.- 140 с.: ил. РГБ ОД, 61 09-3/1061

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Современные аспекты бактериальной коррозии стали. участие бактерий нефтяного сообщества в коррозионном разрушении сплавов 10

1.1. Участие микроорганизмов нефтяного сообщества в процессах био-коррозии 10

1.2. Распространенность СВБ в природе и особенности их жизнедеятельности 11

1.2.1. Систематика и особенности метаболизма СВБ, обусловливающие их коррозионную опасность 14

1.2.2. Особенности биохимических процессов у сульфатвосстанавливаю щих бактерий 22

1.3. Участие сульфатвосстанавливающих бактерий в коррозии

металла 27

1.3.1. Механизмы коррозии металла под действием сульфатвосстанавливающих бактерий 27

1.3.2. Роль бактериальной пленки в коррозии металла 39

1.4. Воздействие ингибиторов биологической коррозии стали 44

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 50

2.1. Объекты исследования 50

2.2. Методы исследования

2.2.1. Определение влияния различных соединений хрома на рост сульфатвосстанавливающих бактерий 52

2.2.2. Методика проведения испытаний стали в среде сульфатвосстанав-ливающих бактерий 53

2.2.3. Определение влияния химического состава стали на скорость ее коррозии в среде сульфатвосстанавливающих бактерий 54

2.2.4. Определение коррозионной активности микроорганизмов 57

2.2.5. Исследование антибактериальных свойств церия и лантана 58 2.2 6; Определение адсорбционных свойств клеточных стенок сульфат восстанавливающих бактерий к редкоземельным- металлам 58

2.2.7. Определение сил адгезии накопительной культуры, сульфатвосста навливающих бактерий к твердойшоверхности? 60

ГЛАВА 3. Мониторинг нефтяных месторождений и характеристика накопительной культуры сульфатвосстанавливающих бактерий, выделенной из продуктов коррозии приобского нефтяного месторождения

Мониторинг нефтяных месторождений 62

Характеристика накопительной культуры СВБ, выделенной: из продуктов коррозии Приобского нефтяного месторождения5 68і

ГЛАВА 4. Влияние разных концентраций хрома в; среде и в стали на рост накопительной культуры; сульфатвосстанавливающих бактерий, выделенной из і продуктов8 коррозионных отложений приобского нефтяного месторождения

4 4. Влияние содержания хрома в стали на рост биопленки накопительной культуры СВБ на поверхности стали .74V

4.2: Влияние разных концентраций1 хрома в=среде на рост накопительной культуры СВБ, выделенной из продуктов коррозионных отложений Приобского нефтяного месторождения . 77

ГЛАВА 5. Влияние разных концентраций редкоземельных металлов; в стали и в среде культивирования на рост сульфатвосстанавливающих бактерий : : .85

5.1 Влияние редкоземельных металлов в сталях на развитие биопленки СВБ на поверхности сталей 85

5.2 Влияние церия и лантана в среде на рост накопительной культуры СВБ, выделенной из Приобского нефтяного месторождения; 96

ГЛАВА 6. Адсорбция редкоземельных металлов? на клетках накопительной культуры сульфатвосстанавливающих бактерий, выделенной из приобского нефтяного месторождения и сила адгезии сульфатвосстанавливающих бактерий к твердой поверхности

6.1 Адсорбция редкоземельных металлов на клетках накопительной культуры СВБ, выделенной из Приобского нефтяного месторождения 99

6.2 Сила адгезии клеток накопительной культуры СВБ, выделенной из Приобского нефтяного месторождения, к твердой поверхности 101

Заключение 105

Выводы 111

Список использованных источников 113

Введение к работе

Актуальность проблемы. В настоящее время в связи с использованием вторичных методов добычи нефти, которые заключаются в заводнении нефтяных пластов поверхностными водами для поддержания пластового давления, наблюдается активизация жизнедеятельности сульфатвосстанавливающих бактерий (СВБ). СВБ являются уникальной физиологической группой, получающей энергию в процессе сульфатного дыхания. В результате этого процесса выделяется сероводород, который вызывает интенсивную коррозию нефтегазового оборудования [NACE, 2004, Lee, 1993,Чугунов, 2002].

По оценкам специалистов нефтегазовой промышленности, биокоррозия является причиной от 20 до 80% аварийных случаев в нефтегазовом комплексе, которые приводят к экономическим потерям и ухудшению экологической обстановки [Асфандияров, 1983].

Распространенный способ борьбы с биокоррозией с помощью бактерицидов оказывается малоэффективным, поскольку СВБ прочно адгезируются на поверхности металла и формируют биопленки, покрытые шламом и продуктами коррозии [Сабирова, 1986].

Немногочисленные литературные данные [Geesey, 1996, Walsh, 1993] свидетельствуют о зависимости устойчивости стали к биокоррозии от ее химического состава. Химический состав стали двояко влияет на стойкость стали по отношению к коррозии. Некоторые легирующие элементы существенно повышают стойкость стали к бактериальной коррозии, в то время как другие элементы, являясь потенциальными компонентами питания бактерий, могут увеличивать бактериальную коррозию.

На наш взгляд, одним из возможных путей снижения степени биокоррозии или ее предотвращения, может быть изменение химического состава трубных и конструкционных сплавов. В этой связи, представляется перспективным для легирования трубных сплавов поиск химических элементов, ингибирую-ших рост коррозионноопасных бактерий и одновременно предотвращающих их адсорбцию на поверхности металлов.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования было изучение коррозионной активности микрофлоры нефтяных месторождений с целью выбора тест-культуры для оценки устойчивости стали к биокоррозии и разработки биотехнологической концепции повышения устойчивости конструкционных сплавов.

В рамках поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

  1. изучить коррозионноопасную микрофлору некоторых нефтяных месторождений, выделить, охарактеризовать и отобрать накопительные культуры сульфатвосстанавливающих бактерий в качестве тест-объекта оценки коррозионной устойчивости стали;

  2. исследовать адгезивные свойства клеток накопительной культуры СВБ, выделенной из Приобского нефтяного месторождения;

  3. изучить влияние ионов хрома и редкоземельных элементов в составе сред культивирования на рост, активность процесса сульфатредукции и дегид-рогеназную активность накопительной культуры СВБ, выделенной из Приоб-

ского нефтяного месторождения;

  1. изучить адсорбцию редкоземельных элементов церия и лантана на клетках накопительной культуры СВБ, выделенной из Приобского нефтяного месторождения;

  2. оценить влияние содержания хрома и некоторых редкоземельных металлов в стали на рост на поверхности стали биопленки накопительной культуры СВБ, выделенной из Приобского нефтяного месторождения.

Научная новизна. Впервые выделена и охарактеризована коррозионно-опасная микрофлора Приобского нефтяного месторождения.

Впервые изучено влияние разных концентраций ионов хрома в среде культивирования на рост накопительной культуры СВБ, выделенной из Приобского нефтяного месторождения.

Впервые исследовано влияние содержания хрома и редкоземельных элементов в стали на рост на поверхности стали и показатели метаболизма биопленки накопительной культуры СВБ, выделенной из Приобского нефтяного месторождения.

Впервые оценено влияние разных концентраций редкоземельных элементов в среде культивирования на рост и показатели метаболизма накопительной культуры СВБ, выделенной из Приобского нефтяного месторождения.

Впервые изучена адсорбция редкоземельных элементов на клетках накопительной культуры СВБ, выделенной из Приобского нефтяного месторождения и исследована сила адгезии клеток данной культуры к поверхности стекла.

Теоретическая и практическая значимость работы. Проведен мониторинг нескольких нефтяных месторождений, в ходе которого получены данные по численности коррозионноопасной микрофлоры в исследованных месторождениях.

Обоснован выбор накопительной культуры Приобского нефтяного месторождения в качестве биотеста для оценки коррозионной устойчивости сталей. Выявлено, что по силе адгезии предложенная накопительная культура СВБ на несколько порядков превосходит музейные культуры.

Установлено, что введение редкоземельных элементов и хрома в трубный сплав повышает стойкость стали к биокоррозии наряду с улучшением механических характеристик.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Хлорид хрома (III) оказывает небольшое стимулирующее действие, тогда как хромат (VI) и бихромат (VI) калия оказывают дозозависимое бактерио-статическое действие на рост и показатели метаболизма накопительной культуры СВБ, выделенной из Приобского нефтяного месторождения.

  2. Введение хрома в сталь наряду с улучшением механических свойств повышает стойкость к бактериальной коррозии, вызываемой накопительной культурой СВБ.

  3. Установлена зависимость между составом стали и развитием на ее поверхности биопленки сульфатвосстанавливающих бактерий. Введение церия во включения наряду с микроструктурой стали изменяет адгезивные свойства

СВБ по отношению к поверхности стали.

  1. Количество клеток, содержание белка и дегидрогеназная активность СВБ в биопленке, а также скорость коррозии стали значительно ниже на сталях, модифицированных церием. Наибольшие показатели наблюдались на сталях с системой легирования Fe-Mn.

  2. Установлено, что лишь довольно высокие концентрации редкоземельных элементов церия и лантана (0,05% и выше) могут полностью ингиби-ровать рост накопительной культуры СВБ, выделенной из Приобского нефтяного месторождения.

  3. Установлено, что силы адгезии к поверхности субстратов музейной культуры СВБ и накопительной культуры СВБ, выделенной из Приобского нефтяного месторождения, на несколько порядков превышают силы адгезии многих других культур бактерий, что может служить основой для объяснения высокой коррозионной опасности адгезированных форм сульфатвосстанавли-вающих бактерий.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции «Проблемы и методы обеспечения надежности и безопасности систем транспорта нефти, нефтепродуктов и газа» (Уфа, 2006), молодежной научной конференции «Актуальные проблемы экологии Волжского бассейна» (Тольятти, 2007), на третьей международной научно-технической конференции «Экология и безопасность жизнедеятельности промышленно-транспортных комплексов ELPIT 2007» (Тольятти, 2007), XII международной конференции «Окружающая среда для нас и будущих поколений» (Самара, 2007), IV Всероссийской научно-практической конференции «Нефтегазовые и химические технологии» (Самара, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из которых 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, списка использованных источников и приложений. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц, 21 рисунок, 6 приложений. Библиографический список содержит 178 наименований, в том числе 97 иностранных изданий.

Объектом изучения послужили три физиологические группы коррозион-ноопасных бактерий: тионовые бактерии, сульфатвосстанавливающие и угле-водородокисляющие бактерии. Накопительные культуры данных трех групп бактерий были выделены на специфических элективных средах как из продуктов коррозионных отложений, так и из пластовых вод. На основе микробиологических посевов и значений индексов активности культура СВБ из Приобского нефтяного месторождения была определена как наиболее активная и все дальнейшие исследования проводили в среде с данной культурой. Данная культура СВБ является накопительной, и в ходе биохимических и микробиологических тестов был определен ее приблизительный состав и соответственно ему

были подобраны следующие виды музейных культур бактерий: Desulfovibrio desulfuricans, Desulfotomaculum sp, Desulfobacter sp.

Также объектами исследования являлись стали с системой легирования Fe-Mn (09Г2С и 17Г1С), традиционно применяемые в нефтегазовой отрасли, и с системой легирования Fe-Cr (13ХФА), дополнительно модифицированные церием в трех различных концентрациях (0,0035, 0,0075 и 0,0199 %) и модифицированные кальцием, а также стали 08ХМЧА и 15Х5М с повышенным содержанием хрома. Размер образцов стали составлял 40x10x4 мм.

Состав микробного сообщества пластовых вод анализировали путем посева на жидкие питательные среды для выявления отдельных физиологических групп микроорганизмов. СВБ определяли на жидкой среде Постгейта С с лактатом кальция (3,5 г/л) в качестве донора электронов. Количество хлористого натрия варьировали в зависимости от состава пластовых вод от 10 до 60 г/л. Зараженные 1 мл пластовых вод среды инкубировали в анаэростате АЭ-01. Ана-эростат помещали в термостат при 30 С.

Тионовых бактерий (ТБ) определяли на жидкой минеральной среде с тиосульфатом. Флаконы инкубировали в термостате при 30С.

Углеводородокисляющих бактерий (УОБ) определяли на среде Раймонда с нефтью. Флаконы инкубировали в термостате при 30СС.

Учет бактерий вели как по продуктам жизнедеятельности, характерным для той или иной физиологической группы, так и по микроскопии бактерий в световом микроскопе Karl Zeiss (Германия) при увеличении 1600 раз с иммерсией.

Для ориентировочной оценки количества бактерий в среде использовали индекс активности, который рассчитывали по формуле:

100 а

где а - время (сутки) появления черного осадка, бактериальной мути или изменения цвета среды с момента посева пробы.

Для уточненной количественной оценки бактерий в среде использовали метод предельных разведений.

Для определения влияния различных соединений хрома на рост выделенной культуры сульфатвосстанавливающих бактерий, в колбы со средой Постгейта С, зараженной накопительной культурой СВБ, добавляли растворы хлорида хрома (ПІ), хромата (VI) калия и бихромата (VI) калия. Конечные концентрации хлорида хрома (III) в среде составляли 0,205 и 0,410 мг/мл, хромата (VI) калия - 0,261 и 0,522 мг/мл, бихромата (VI) калия - 0,415 и 0,830 мг/мл. Колбы инкубировали в анаэростате при 30 С в течение 7 суток. После инкубации определяли концентрации сероводорода в среде методом Пахмайера, белка в среде методом Лоури и дегидрогеназную активность спектрофотометрически по реакции образования формазана. Для удобства сравнения полученных результатов определяли минимальную ингибирующую концентрацию (МИК -минимальная концентрация, при которой рост популяции снижается на 50%).

Определение влияния химического состава стали на скорость ее коррозии в среде СВБ проводили путем инкубации образцов стали во флаконах, зараженных культурами сульфатвосстанавливающих бактерий. Через две недели инкубации образцы стали с биопленками подвергали изучению биохимическими методами. Для изучения плотности и характера заселения колониями биопленки использовали высокоразрешающую растровую электронную микроскопию. Производили подсчет среднего числа клеток на единицу площади образца, просматривая 25 случайных полей зрения.

Коррозионную активность СВБ определяли весовым методом (по потери массы стали).

Антибактериальные свойства соединений церия и лантана изучали путем инкубации накопительной культуры СВБ с данными соединениями в конечных концентрациях 0,0063 - 0,3%.

Измерение адсорбционных свойств клеточных стенок СВБ к редкоземельным элементам проводили на энергодисперсионном рентгенофлуорес-центном анализаторе БРА-18.

Определение сил адгезии накопительной и музейных культур СВБ к твердым поверхностям проводили по методу центрифугального отрыва [Звягинцев, 1973].

При математической обработке результатов использовали критерий Стьюдента. Достоверными считали различия с уровнем значимости 95%.

Распространенность СВБ в природе и особенности их жизнедеятельности

В настоящее время сульфатвосстанавливающие эубактерии образуют физиологическую группу, включающую представителей, по меньшей мере, 13 родов: Desulfobacter, Desulfobacterium, Desulfobulbus, Desulfococcus, Desulfoha-lobium, Desulfomicrobium, Desulfomonas, Desulfomonile, Desulfosarcina, De-sulfotomaculum, Desulfovibrio, Thermodesulfobacterium, Thermodesulfovibrio. Некоторые из этих родов представлены единственным видом и единичными штаммами, тогда как другие не только различными видами, но и подвидами. Кроме того, к этой физиологической группе относится уникальный сульфат-редуцирующий штамм VC-16, отнесенный к новой ветви архебактерий, [63, 175].

Трудности систематики СВБ связаны с тем, что до 1980-х гг. основой для их классификации служили морфология клеток (размеры, формы клеток, наличие и расположение жгутиков и проч.), способность окислять опре деленные субстраты, наличие десульфовиридина, содержание G+C в ДНК [63].

Значения содержания G+C в ДНК колеблется от 37 до 67% [174], что указывает на гетерогенность группы.

Изучение нуклеотидной последовательности 16S рРНК показало, что серо- и сульфатвосстанавливающие бактерии близки к фототрофным бактериям и составляют особую группу. Неспороносные CSE\Desulfosarcina,variabilis, Desulfococcas niacini, Desulfobulbus propionicus и два представителя рода Desulfovibrio) входят в состав одного кластера, причем Desulfovibrio desulfu-ricans и Desulfovibrio gigas составляют самостоятельную ветвь последнего: Спороносные бактерии рода Desulfotomaculum наряду с бактериями рода Clostridium относятся к другому кластеру [63].

Таксономическое группирование и идентификация штаммов по их 16S рРНК последовательности является слишком затруднительными и дорогостоящими. В бактериологии широко используются таксономические анализы по составу клеточных жирных кислот (Ж), входящих в состав гликолипидов: Так, например, по составу ЖК Thermodesulfobacterium mobile четко отграничивается от рода Desulfovibrio и других родов-СВБ [63].

Также для классификации СВБ используются характеристики электрон-транспортной цепи, в частности, дифференциальные спектры цитохрома с. Полученные данные хорошо согласуются с результатами более детальных и сложных методов секвенирования 16S рРНК и жир но кислотным анализом [10].

До 1982 - 1984 гг. понятие метаболических типов-СВБ было еще не сформировано, имелись лишь отдельные сведения о физиологии тех или иных представителей [63]. Согласно традиционной терминологии типов питания и получения энергии микроорганизмами всех СВБ причисляли к хемо-литогетеротрофам, поскольку было известно, что они используют сульфат в качестве конечного акцептора электронов в анаэробных условиях для окисления органических соединений или водорода [2]. Позднее была открыта и дока зана способность СВБ к хемолитоавтотрофии, а также хемоорганогетеротро-фии [63].

В связи с открытием новых родов и. видов СВБ обнаружено большое число новых субстратов, которые могут использоваться этими микроорганизмами как источники углерода, а также служить донорами электронов в процессе редукции сульфатов [63].

К настоящему времени обнаружено большое число субстратов: 3-х и 4-х углеродные органические кислоты, спирты, простые сахара, аминокислоты, ароматические соединения, жирные кислоты (ЖК), а также водород (Н2) и окись углерода (СО), которые служат донорами электронов в процессе суль-фатредукции. Набор окисляемых соединений не связан с принадлежностью организма к физиологической группе А или Б. Это касается как неорганических соединений - Нг, СО, так и органических, в частности, жирных кислот [63].

Большинство СВБ окисляют лактат и пируват, а также компоненты цикла трикарбоновых кислот (ЦТК). Исключение составляют некоторые виды рода Desulfobacter, Desulfonema magnum, Desulfotomaculum acetoxidans, неспособные к росту в процессе сульфатредукции за счет окисления лактата и пирувата [63].

Бактерии рода Desulfobacter и Desulfotomaculum acetoxidans в качестве основного субстрата используют ацетат, хотя выход энергии в этой реакции невысок: СНзСОО + SO _ - НСО" + HS" А(?0 = -71кДж/моль. Многие СВБ других родов слабо развиваются на средах с ацетатом [63]. Виды рода Desulfovibrio способны, окислять спирты (метанол, этанол, пропанол, бутанол, изобутанол, глицерин, диоксиацетон). Кроме того, Desulfovibrio carbinolicus специализирован на окислении спиртов и диолов, а штаммы Desulfovibrio sp. расщепляют в процессе восстановления сульфатов этиленгликоль и тетраэтиленгликоль [63]. Было установлено [63],. что некоторые ЄВБ способны, использовать. жирные- кислоты с длиной углеродной цепи от двух до восемнадцати атомов дикарбоновые кислоты, соединения, ароматического строения; — бёнзоат,. фе-нилацетат, фенол, «-крезол; гетероциклические- соединения — индол, а также циклогексанкарбоксилат.

Представители группы A Desidfoyibrio sapovorans окисляет ЖК. с четным числом атомов углерода:до ацетата, с нечетным — до ацетата и.про-пионата. Как правило,.СВБ группы Б окисляют ЖК полностью до ЄОг[63].

В связи с широким распространением:ЄВБ в .нефтяных пластах вопрос о возможности их развития за счет использованиям углеводородов нефти; является одной из.основных проблем нефтяной микробиологии.[65 . Кузнецов. . и Еорленко (цит. по [65]), специально исследовавшие этот;вопрос,.пришли к-заключению; что чистые культуры: бактерий не способны использовать, нефть и развиваться на: углеводородах. Предположение; высказанное в: par боте[65];, о том, что алканы нефти могут служить источниками электронов? в энергетических процессахGBB; нашло подтверждениемболее поздних исследованиях [22, 97].

Определение влияния различных соединений хрома на рост сульфатвосстанавливающих бактерий

Все процедуры осуществляли согласно: [55,,56; 60, 65; 150]. Состав микробного сообщества пластовой воды анализировали путем посева на жидкие питательные среды для выявления отдельных физиологических групп микроорганизмов. GBE определяли.на жидкой среде Постгейта С (приложение; 1) с лактатом кальция.(3,5 г/л); в; качестве донора электронов. Количество, хлористого натрия варьировали в зависимости от состава,пластовых вод от 10 до 60т/л. Зараженные 1 мл пластовых вод среды инкубировали в анаэростате АЭ-0 Г (производства «Ники МЛТ», Санкт-Петербург), из которого откачивали воздух;ва-куумным насосом до отметки на вакуумметре 1 кгс/см , а далее переключали трехходовой кран, присоединенный к баллону с азотом, и заполняли анаэростат азотом (до тех пор пока-стрелка вакуумметра;не вернется на нулевую отметку); Анаэростат помещали в термостат при 30.С.

Тионовых бактерий (ТБ); определяли на жидкой среде (приложение I),, приготовленной на основе водопроводной воды. Полученную питательную среду разливали по25 мл в 50 мл-е флаконы, заражали 1 мл пластовой воды и закрывали резиновыми пробками. Флаконы инкубировали в термостате при 30 С.

Углеводородокисляющих бактерий (УОБ) определяли на среде Раймонда; с нефтью (приложение 1). Среды заражали 1 мл пластовой воды. Флаконы, инкубировали: в термостате при 30 С.

Учет бактерий вели как. по продуктам жизнедеятельности, характерным для той или иной; физиологической; группы; так;и по микроскопии; бактерий в; световом микроскопе Karl Zeiss (Германия) при увеличении 1600 раз с иммерсией.

Для ориентировочной оценки количества бактерий в среде использовали индекс активности, который рассчитывали по формуле: где а — время (сутки) появления черного осадка, бактериальной мути или изменения цвета среды с момента посева пробы.

Для уточненной количественной оценки бактерий в среде использовали метод предельных разведений [150]. Считали, что в выросшем посеве, где использовано максимальное разведение, присутствует одна клетка. Для СВБ признаками роста были: прирост сероводорода, наличие живых форм СВБ. Для тионовых бактерий признаками роста были: помутнение питательной среды в посевных флаконах, изменение цвета питательной среды от желтой к красной (изменение окраски метилового оранжевого), наличие живых форм ТБ. Для У ОБ признаками роста служили: помутнение питательной среды в посевных флаконах, изменение цвета питательной среды от красной к желтой (изменение окраски кислотно-основного индикатора бромкрезолового пурпурного), наличие живых форм У ОБ [60].

Определение влияния различных соединений хрома на рост сулъ-фатвосстанавливающих бактерий

Эксперимент проводили в колбах объемом 100 мл. Колбы наполняли средой Постгейта С с лактатом. Культуру СВБ, выделенную из Приобского нефтяного месторождения, вводили в каждую колбу по 1 мл. Далее в колбы добавляли растворы хлорида хрома (III), хромата (VI) калия и бихромата (VI)1 калия. Конечные концентрации хлорида хрома (III) в среде составляли 0,205 и 0,410 мг/мл, хромата калия - 0,261 и 0,522 мг/мл, бихромата калия - 0,415 и 0,830 мг/мл. Колбы инкубировали в анаэростате при 30С в течение 7 суток. После инкубации определяли концентрации сероводорода в среде, белка в среде и де-гидрогеназную активность. Для удобства сравнения полученных результатов определяли минимальную ингибирующую концентрацию (МИК - минимальная концентрация, при которой рост популяции снижается на 50% [24]). 2.2.3. Определение влияния химического состава стали на скорость ее коррозии в среде сулъфатвосстанавливающих бактерий

На первом этапе наших исследований проводились испытания стали раз-личных марок во флаконах с питательной средой Постгейта С, зараженной накопительными культурами СВБ и ассоциацией музейных культур СВБ. Для понижения окислительно-восстановительного потенциала в среду после стерилизации вносили несколько капель 1 мМ раствора Na2S. Поскольку заражение производили накопительной культурой СВБ, выделенной из Приобского нефтяного месторождения, где-общая минерализация вод достигает 24,3 г/л (при-ложение 1), в среду, дополнительно вносили 10 г/л NaCl.

Шлифованные и отполированные1 алмазной пастой образцы стали обезжиривали в ацетоне, натирая с обеих сторон х/б тканью, взвешивали на аналитических весах с точностью до 0,01 мг, стерилизовали в сухожаровом шкафу в течение 2-х часов и помещали во флаконы со стерильной питательной средой Постгейта С, предварительно зараженной культурами СВБ. Флаконы закрывали ватно-марлевыми пробками и устанавливали в ана-эростаты. Анаэростаты» помещали в термостат и инкубировалишри 30 С в течение 2-х недель.

После инкубации образцы с биопленками извлекали и подвергали изучению биохимическими методами-(рис. 2.2).

Исследование полученной биопленки проводили по комплексной мето дике, разработанной нами на кафедре биохимии СамГУ, с использованием биохимических и микробиологических методов анализа и высокоразрешающей растровой электронной микроскопии.

Полученную биопленку соскабливали стерильным скальпелем со всех сторон образца стали, приливая 1 мл 0,3%-ного додецилсульфата натрия [78]. Полученную биомассу гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера с теф-лоновым пестиком в течение 2 минут, а затем центрифугировали при 5000 g 10 минут. Из супернатанта отбирали по 0,2 мл пробы для определения количе ! ства белка методом Лоури [142].

Характеристика накопительной культуры СВБ, выделенной: из продуктов коррозии

По мнению автора статьи [84], легирующие добавки в сталь могут оказывать токсическое действие на бактерий, в частности, добавки хрома. Об угнетении жизнедеятельности СВБ в биопленке с образцами стали с системой легирования Fe-Cr свидетельствуют полученные нами в эксперименте данные по дегидрогеназной активности бактерий.

Исследованные показатели были различными для образцов Fe-Cr стали, содержащих разное количество церия.

Введение в Fe-Cr стали церия в количестве 0,0035% привело к снижению количества клеток СВБ, адгезированных на поверхности, в 1,6 раза по сравнению со сталями 17Г1С, что также подтверждается данными, полученными по оценке количества белка. Дальнейшее увеличение массовой доли церия до 0,0199% привело к значительному снижению числа клеток СВБ, а также количества белка в биопленке.

Весьма важным является тот факт, что количество бактерий в средах с разными марками стали оставалось высоким и не зависело от присутствия стали той или иной марки. Это также подтверждается данными по дегидрогеназной активности и количеству сероводорода в среде (табл. 5.4). Зависимость количества СВБ в среде, содержания сероводорода в среде, дегидрогеназной активности бактерий от присутствия в среде различных марок стали Результаты, полученные при испытании стали в среде с музейными культурами СВБ, были сравнены с результатами, полученными при испытаниях образцов стали в среде с накопительной культурой СВБ, выделенной из Приобского нефтяного месторождения.

Нами была изучена скорость коррозии разных марок стали. Мы оценивали влияние ассоциации музейных культур, состоящей из трех видов Desulfo-vibrio desulfuricans, Desulfotomaculum nigrificans, Desulfobacter sp. и накопительной культуры СВБ, выделенной из Приобского нефтяного месторождения, на скорость коррозии стали. Наибольшая скорость коррозии после двух недель экспозиции наблюдалась на сталях 09Г2С и 17Г1С. На стали 17Г1С коррозия достигала 0,98 г/м хсутки при воздействии на нее ассоциации му-зейных культур и 1,51 г/м хсутки при действии накопительной культуры СВБ, выделенной из Приобского нефтяного месторождения (рис. 5 6). Таким обра зом, скорость коррозии стали 17Г1С под действием накопительной культуры СВБ, выделенной из Приобского нефтяного месторождения в 1,5 раза выше по сравнению с действием ассоциации музейных культур СВБ.

Аналогичные данные были получены при испытаниях стали 09Г2С. Коррозионная активность накопительной культуры СВБ была выше в 1,6 раза по сравнению с активностью ассоциации музейных культур (рис.5.6).

Наименьшая скорость коррозии (0,48 г/м хсутки) наблюдалась на сталях, модифицированных церием в концентрации 0,0199%.

Скорость коррозии стали, модифицированной кальцием, была приблизительно такой же, как сталей 17Г1С и 09Г2С и равнялась 0,79 г/м2хсутки для ассоциации и 1,35 г/м хсутки для накопительной культуры СВБ, выделенной из приобского нефтяного месторождения.

Isabel Neria-Gonzalez, En Tao Wang [153] обнаружили, что на образцах стали Х52 (17Г1С), испытанных в естественных условиях нефтяного трубо провода в Южной Мексике, откладывается биопленка, состоящая из различных бактериальных культур. Среди СВБ преобладает род Desulfovibrio sp. Также из биопленки были выделены Desulfovibrio capillatus, Desulfovibrio alaskensis, Citrobacter.

Christine С Gaylarde [109] показал, что Desulfovibrio vulgaris вызывает увеличение скорости коррозии мягкой стали на 78,2% увеличивая потери веса по сравнению с неинокулированной средой. Desulfobacter postgatei и Desulfo-bulbus propionicus не оказывали значительного влияния на скорость коррозии стали.

По немногочисленным имеющимся в литературе данным [171, 172], прикрепление бактериальных клеток к поверхности стали зависит от формы включений стали.

По мнению Walsh W. Daniel и др. [171], стали, содержащие церий, как при высоком, так и при низком содержании серы, содержат сульфидные включения с высокой степенью округлости и обычно1 меньшего размера. Стали с низким содержанием церия содержат сульфидные включения продолговатой формы. Плотность этих включений и степень их вытянутости зависят от концентрации серы, присутствующей в каждом образце стали. Увеличение содержания серы вызывает изменения в объеме включения (они становятся более длинными) и увеличивает пластичность. По данным авторов статьи [171] именно микроструктура стали является в большинстве случаев1 определяющим фактором в инициации биокоррозии: стали, легированные церием, становятся менее доступными для прикрепления к ним бактериальных клеток из-за малой площади включений. Однако мы вынуждены не согласиться с данным объяснением механизма воздействия церия, на развитие процесса биологической коррозии. Большинство труб в начале эксплуатации в нефтяной промышленности сразу же покрывается слоем сульфидов железа. Следовательно, бактерии образуют биопленку поверх этого сульфидного слоя и непосредственно первое время- не контактируют с поверхностью стали. Поэтому только изменением формы сульфидных включений в металле невозможно объяснить механизмы адгезии СВБ на сталях и снижение адгезивных свойств СВБ при введении церия во включения в металле.

По данным, полученным нами в результате экспериментов, введение церия во включения наряду с микроструктурой стали изменяет адгезивные свойства СВБ по отношению к поверхности металла. С одной стороны, включения становятся достаточно мелкими для прикрепления к ним бактериальных клеток, но, с другой стороны, церий, действуя на бактериальные клетки, изменяет их способность прикрепляться к поверхности металла. Однако механизм прикрепления бактерий к поверхности металла практически не изучен и требует дальнейших исследований.

Влияние разных концентраций1 хрома в=среде на рост накопительной культуры СВБ, выделенной из продуктов коррозионных отложений Приобского нефтяного месторождения

Исследованная нами накопительная культура СВБ, выделенная из Приобского нефтяного месторождения, является коррозионноопасной бактерией. На наш взгляд наиболее эффективным способом борьбы-с коррозией стали, вызываемой СВБ, является модификация химического состава трубных и конструкционных сплавов.

Некоторые легирующие элементы существенно повышают стойкость стали к бактериальной коррозии, в то время как другие элементы, являясь потенциальными компонентами питания бактерий, могут увеличивать бактериальную коррозию [2; 159, 170].

Одним из. наиболее распространенных способов модификации химического состава низкоуглеродистых сплавов является легирование хромом. Даже незначительные добавки хрома в углеродистую сталь.делают ее коррози-онностойкой, кислотостойкой; улучшают ее механические свойства [19, 160]-.

В результате проведенных испытаний сталей, легированных хромом», было-выявлено, что при увеличении концентрации хрома в стали-количество! клеток СВБ на поверхности данных сталей уменьшается И количество белкаї. (по Лоури) в биопленке, расположенной на. поверхности стали, также снижается. С одной стороны, хром, является ингибитором. роста бактерий, с другой; стороны, хром образует защитную оксидную пленку на поверхности стали, затрудняющую прикрепление к стали бактериальных клеток. Так, на поверхности стали 15Х5М с высоким содержанием хрома (4,6%), биопленка СВБ располагалась отдельными небольшими кучками, клетки СВБ были тонкими и полупрозрачными, что свидетельствует об ингибировании их роста. Однако легирование стали хромом приводит к увеличению размеров зерен, что в свою очередь, ведет к увеличению скорости межкристаллитной. коррозии. Поэтому данный способ модификации химического состава стали не всегда эффективен.

Наиболее эффективным способом модификации стали, при котором сульфидные включения стали становятся более мелкими (3-5 мкм), что у учшае как ехашіческую, так и коррозионную стойкость_стали, является модификация сплавов редкоземельными металлами. Данное заключение было сделано нами в результате проведенных исследований с различными образцами стали.

Были исследованы традиционные трубные стали (09Г2С и 17Г1С) и стали, выплавленные на Таганрогском металлургическом заводе, модифицированные церием или кальцием (13ХФА). В ходе проведенных испытаний в жидких питательных средах, зараженных СВБ, было выявлено, что биопленка СВБ на сталях 13ХФА, модифицированных церием в концентрации 199 ррт, располагается лишь небольшими участками и состоит из небольшого числа одиночных клеток, дегидрогеназная активность биопленок СВБ на данных сталях в 7,5 раз ниже по сравнению с аналогичными показателями для традиционно применяемых сталей 09Г2С и 17Г1С. Содержание белка в биопленках на сталях, модифицированных церием в концентрации 0,0199%, было в 3,3 раза меньше по сравнению» со сталями, модифицированными кальцием. Таким . образом, несмотря на то, что модификация включений кальцием делает их тоже более мелкими и по размеру такими же как при модификации сталей редкоземельными металлами, природа кальция не дает ему такого преимущества, какое есть у редкоземельных металлов, и кальций используется бактериями в их процессах жизнедеятельности. Поэтому модификация сталей кальцием не дает желаемой стойкости данным сталям по отношению к коррозии, осуществляемой СВБ.

Также весьма важным является тот факт, что количество бактерий в средах с разными марками стали оставалось высоким и не зависело от присутствия стали той или иной марки. Это подтверждается данными по дегидроге-назной активности и количеству сероводорода в среде. Следовательно, химическая природа стали играет роль в процессах адгезии клеток СВБ на поверхность стали.

Также в проведенных нами экспериментах было установлено, что скорость коррозии традиционно применяемых сталей 17Г1С и 09Г2С под дейст-вием накопительной культуры СВБ, выделенной из Приобского нефтяного месторождения, в 1,5 раза выше по сравнению со скоростью коррозии данных сталей под влиянием ассоциации музейных культур СВБ. Такие же тенденции прослеживались при испытаниях всех остальных образцов стали. Это можно объяснить метаболическими взаимодействиями, которые сформированы у накопительной культуры СВБ и которых нет у ассоциации музейных культур.

Так как нами было установлено, что редкоземельные металлы в стали влияют на адгезию культур СВБ к поверхности таких сталей, то очень важным для нас был вопрос влияния редкоземельных металлов на жизнедеятельность СВБ. Поэтому был проведен эксперимент по выращиванию накопительной культуры СВБ в присутствии разных концентраций ионов лантана и церия в среде. В результате проведенного эксперимента было выявлено, что церий и лантан в концентрациях выше 0,05% полностью подавляет рост накопительной культуры СВБ. Можно предположить, что ионы редкоземельных металлов нейтрализуют заряды на поверхности бактериальных клеток, что ведет к их гибели.

Адсорбция редкоземельных металлов на поверхности клеток СВБ нами была подтверждена в последующем эксперименте, где было показано, что максимум адсорбции лантана клетками СВБ достигается уже в первые часы контакта и удерживается в первые сутки.

Для подтверждения силы адгезии СВБ к различным твердым поверхностям был проведен эксперимент, который выявил, что сила адгезии накопительной культуры СВБ, выделенной из продуктов коррозии Приобского нефтяного" месторождения, в несколько раз выше по сравнению с аналогичным показателем адгезии многих других бактерий. Для музейной культуры Desul-fotomaculum sp величина силы адгезии в 7,6 раза выше по сравнению с аналогичным показателем для Staphylococcus aureus и Bacterium prodigiosum.

Похожие диссертации на Биотехнологические приемы оценки устойчивости сталей к коррозии, вызываемой бактериальной сульфатредукцией, и пути повышения коррозионной устойчивости нефтегазового оборудования