Содержание к диссертации
Введение
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Методы культуры ткани в селекции растений
1.2 Культивирование изолированных тканей и клеток растений д
1.3 Методы получения новых форм растений
1.3.1 Мутационная изменчивость 13
1.3.2 Сомаклональная изменчивость и клеточная селекция j4
1.3.3. Использование гаплоидов в селекции lg
1.3.4 Использование методов генетической инженерии 20
1.4 Практическое значение клонального микроразмножения. 22
2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 29
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 36
3.1 Культура верхушечных и пазушных почек
3.1.1 Пролиферация верхушечных и пазушных меристем
3.1.2 Оптимизация метода укоренения побегов
3.1.3 Адаптация к естественным почвенным условиям
3.2 Культура незрелых зародышей
3.3 Трансформация люпина с помощью агробактерий выводы 102
Практические рекомендации производству
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
ПРИЛОЖЕНИЯ 125
- Методы культуры ткани в селекции растений
- ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
- Культура верхушечных и пазушных почек
Введение к работе
Актуальность темы. Длительное время селекция была ориентирована на увеличение уборочного индекса — отношения полезной массы урожая к общей массе, при практически неизменной величине чистого фотосинтеза. Но при этом снижалась экологическая устойчивость сортов и агроценозов. Необходимость переориентации селекции вытекает из реалий современного сельского хозяйства: уменьшение генетического разнообразия и, как следствие, снижение приспособленности агроценозов, их уязвимости по отношению к абиотическим, биотическим и антропогенным стрессам; дефицит энергоресурсов и возрастание цены пищевой калории; загрязнение агроландшафта и сельскохозяйственной продукции (Жученко, 1994, 2001; Кильчевский, Хотылева, 1999; Лихачев, Артюхов, 2002).
Повышению результативности селекционного процесса должно способствовать совершенствование его технологии. В этом плане большое значение имеет качественно новое изучение генофонда культурных растений, направленное на выявление генетических источников и доноров селектируемых признаков. Для этого необходимо расширение исследований по всем направлениям, имеющим отношение к селекции, и особенно по частной генетике и биотехнологии, как в целях создания нового исходного материала, так и для выявления морфологических, физиологических, биохимических и т.д. маркеров селектируемых признаков.
В этой связи нами проведены исследования возможностей использования биотехнологических приемов в расширении генофонда исходного материала люпина - культуры, обладающей огромным биологическим и экономическим потенциалом.
4Новые разработки, в которых используются культуры клеток и тканей, -% . а также методы генной инженерии значительно сокращают затраты времени и труда на создание новых исходных форм для селекции. Техника рекомби-нантных ДНК и ее последовательное применение в селекции растений способствует преодолению барьеров, препятствующих межвидовому скрещиванию, что особенно актуально для люпина. Она позволяет увеличить генетическое разнообразие, которое существенно пострадало из-за широкого распространения ограниченного числа высокопродуктивных сортов.
Быстрое внедрение нового сорта в практику сдерживается невозможностью получения большого количества семян или посадочного материала для вегетативного размножения в течение одного сезона. Это препятствие устраняется с помощью биотехнологии, которая предлагает селекционерам эффективный и быстрый метод микроразмножения растений.
Цель работы - изучить способность разных видов люпина к клональ-ному микроразмножению и генетической трансформации.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи: - оценить разные органы растений люпина по способности к каллусообразованию и регенерации; изучить морфо- и ризогенез в разных условиях культивирования; экспериментально подобрать наиболее эффективные питательные среды для клонального размножения разных видов люпина; установить возможность использования культуры незрелых зародышей в сохранении ценных генотипов люпина; получить растения-регенеранты из различных органов люпина; отработать методику генетической трансформации клеток люпина с помощью агробактерий.
Научная новизна. Выявлены особенности пролиферации верхушечных и пазушных почек при культивировании in vitro 16 перспективных сортов и сор- тообразцов желтого, 10 сортов узколистного, 4 сортов белого, а также многоли- 1*> стного люпина. Установлена зависимость умножения и развития побегов от ко-
5 личественного состава среды, содержания гормонов и режима пассирования. Определены наиболее эффективные среды для корнеобразования разных видов люпина. Предложены схемы для регенерации растений из незрелых зародышей желтого, узколистного и белого люпина. Впервые получена каллусная ткань узколистного люпина, трансформированная с помощью Agrobacterium tumcfaciens (рВЬНЬЗД) и приобретшая в результате трансформации устойчивость к кана-мицину.
Пластическая значимость результатов исследования. Предложены схемы регенерации растений из незрелых зародышей узколистного, желтого и белого люпина. Разработаны условия для этапа адаптации растений-регенерантов к культивированию in vivo. Доказана возможность использования методов генетической трансформации тканей люпина с помощью агробактерий при создании принципиально нового исходного материала. Часть полученных регенерантов узколистного (АТ-Д-2-Г71) и желтого люпина (Искорость) используется в селекционных программах.
Обоснованность выводов и достоверность результатов исследований подтверждается достаточным объемом экспериментального материала, собранного и обработанного с использованием современных методов исследований и ЭВМ, получением из каллусов растений-регенерантов и генетически измененных форм, использованием их в селекционных программах.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Видовая и сортовая специфичность реакции люпина на разные питательные среды и другие условия культивирования in vitro.
Схемы и условия клопального микроразмножения разных видов люпина.
Эффективность корнеобразования и адаптации к естественным условиям культивируемых видов люпина.
Способность люпина к генетической трансформации с помощью Agro-bacterium tumefaciens (pBLHL3A).
Личный вклад автора. Разработка программы и методики исследований, получение, обработка, анализ и обобщение экспериментального материала, формулирование общих выводов по результатам выполненной работы, подготовка докладов и статей, оформление диссертации выполнены самостоятельно.
Апробация результатов НИР. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались ежегодно на Ученом совете Всероссийского научно-исследовательского института люпина (1989-1995 гг.), научно-практической конференции "Ускорение научно-технического процесса в агропромышленном комплексе Брянской области" (Брянск, 1992), межрегиональной научно-практической конференции «Биологический и экономический потенциал люпина и пути его реализации» (Брянск, 1997), Саввичев-ских научных чтениях (Брянск: БГСХА, 2003, 2004), на научной конференции «Вклад ученых и специалистов в национальную экономику» (Брянск: БГИТА, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, выводов, практических рекомендаций, списка использованных источников и приложений. Она иллюстрирована 29 таблицами, 22 рисунками, список использованных источников включает 216 наименований, в том числе 133 на иностранных языках.
Методы культуры ткани в селекции растений
Селекция основывается на двух принципиальных подходах: создание генетического разнообразия исходного материала и отбор желательных генотипов.
Достижения науки позволили создать к настоящему времени сорта важнейших сельскохозяйственных культур, обладающих высокой потенциальной продуктивностью. Но существует и обратная сторона успехов селекции —это допуск сортов сельскохозяйственных культур к производственному использованию и распространение небольшого их числа на больших площадях, что приводит в конечном счете к сужению генетического разнообразия сортов важнейших продовольственных культур.
Селекция в настоящее время, наряду с традиционными методами, взяла на вооружение новейшие достижения биотехнологии.
Для создания новых форм и сортов сельскохозяйственных растений применяются методы мутагенеза и клеточной селекции, получения сомакло-нальных вариантов и экспериментальных гаплоидов, перенос чужеродной генетической информации с помощью бактериальных клеток и вирусов (Бу-тенко, 1979). Но для селекции важно не только получить новый генотип, надо как можно быстрее его размножить, и на этом этапе также решающую роль могут сыграть новейшие методы клепального микроразмножения.
Идея о возможности культивирования растительных клеток вне организма была высказана еще в конце XIX - начале XX века в работах немецких ученых X. Фёхтинга и К. Рехингера (Vochting, 1892; Rechinger, 1893: цих по Диксон, 1989). Корневые сегменты тополя и одуванчика в условиях in vitro оказались способными к каллусообразованию. Результаты экспериментов по-зволили Г. Хаберланду в 1902 г. (Haberlandt, 1902: цит. по Диксон, 1989) выдвинуть гипотезу о тотипотентности любой живой растительной клетки.
Независимо друг от друга американский исследователь Роббинс и немецкий ученый Котте обнаружили способность меристемы кончиков корня томатов и кукурузы к культивированию на синтетической питательной среде (цит. по Бутенко и др., 1987; Муромцев и др., 1990).
Возможность неограниченного роста изолированных корней в культуре при периодическом пересаживании их на свежую питательную среду впервые продемонстрирована Ф.Р. Уайтом (White, 1932) и Р. Готре (Gautheret, 1934). Немного позже отмечена способность к неограниченному росту при субкультивировании каллусных тканей камбиального и паренхим-ного происхождения, а также растительных опухолей (Yanthere, 1934; White, 1939).
С увеличением разнообразия культивируемых видов растений, выявлена потребность культур в витаминах и стимуляторах роста, а в процессе работы с культурой ткани открыт новый класс фитогормонов - цитокинины, показано значение кинетина и других N-6-замещенных аминопуринов для пролиферации клеток in vitro и индукции стеблевого морфогенеза (R. Heller, 1953; Z. Kulescha, 1954; I. Nitsch, 1955; С. Miller, F. Skoog, 1955; F. Steward, 1958, P. Г. Бутенко, 1958).
Метод получения и выращивания больших масс клеточных суспензий разработан Л.Никель и В.Тулейке ((Nickel, Tulecke, 1959), а метод культивирования отдельной клетки из суспензий - Л.Онсом с соавторами (Ones et al., 1960), М.К.Павловой и Р.Г.Бутенко (1965).
Этапным периодом для развития метода культуры клеток можно считать 70-е годы, когда были достигнуты успехи в разработке метода получения изолированных протопластов из тканей корня и плодов томатов (Cocking Е., 1960), метода культуры меристем, позволяющего получать безвирусный материал и размножать его с высоким коэффициентом. Впервые получены и изучены растения-регенеранты табака, представляющие сомаклональные ва 9 рианты исходной формы (Загорска и др., 1967). Найдены условия культивирования изолированных протопластов, при которых они дают начало клеточным линиям, способным в ряде случаев к морфогенезу (Takebe et al., 1971). Первые соматические гибриды послужили моделями для изучения поведения ядерного и цитоплазматических геномов партнеров в гибридных клеточных линиях и в потомстве соматических гибридов растений, регенерировавших из гибридных клеток (Бутенко, 1979; Глеба, 1980).
С разработкой в 80-е годы метода электрослияния изолированных протопластов и методов селекции гибридных клеток (Zimmerman, 1983) стало возможным использование изолированных протопластов и векторов, созданных на основе Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens, для эффективного переноса генов для двудольных растений (Xanthopoulos et al., 1987).
Объекты и методы исследования
Материалом исследований, в основном, служили культивируемые в сельскохозяйственном производстве Российской Федерации виды люпина: люпин желтый (Lupinus luteus), узколистный (L. angustifolius), белый (L. albus), а также дикорастущий многолистный люпин (L, polyphyllus).
В качестве эксплантов для получения каллусов использовали фрагменты различных органов растений на разных стадиях роста: незрелые и зрелые зародыши, семядоли, завязи. Для работ по клональному микроразмножениго люпина из выращенных в стерильных условиях 5-7 дневных проростков вычленяли верхушечные и пазушные почки в асептических условиях под бинокулярным микроскопом.
Для работы с культурой ткани в основном использовали методику Р.Г.Бутенко(1964).
Семена подвергались поверхностной стерилизации: 20 мин в 96% этаноле, 15 мин в 0,1% растворе диацида с последующей пятикратной отмывкой стерильной водой. Стерильные проростки получали, высевая стерильные семена на "голодный" агар 0,8%.
Для стерилизации тканей вегетирующих растений (проростков, зародышей, полученных из нестерильных семян, использовали метод, предложенный фирмой "Колбиохим-Беринг" (Fitter, Krikorian, 1982).
Схема стерилизации:
- инкубация в 1% растворе тритона Х-100 в течение 3 мин;
- промывка водопроводной водой;
- промывка дистиллированной водой;
- инкубация в 70% растворе этанола - 10 сек;
- инкубация в 3% растворе хлорамина Б в присутствии 0,03% тритона Х-100 в течение 6-10 мин;
- пятикратная промывка стерильной дистиллированной водой.
Используемые питательные среды (табл. 2.1):
- Мурасиге-Скуга (Murashige, Skoog, 1962);
- ГамборгаВ5 (Gamborg, MiHer,Ojima, 1968);
- Линсмайера-Скуга (Sroga, 1983);
- Смирнова (Смирнов, 1970);
- Нича (Kyte, 1988);
- Хеллера (Kyte, 1988);
- Миллера (Kyte, 1988);
- Торри (Смирнов, 1970)
В автоклавированную и охлажденную до 50С среду добавляли витамины и гормоны, стерилизованные фильтрованием (МППроге GS 0.22 мкм). Стерильные работы проводили в ламинарном боксе типа УО-БВ.
Условия культивирования:
- в темноте, в термостате при 26С;
- на стеллаже при комнатной температуре, освещенние люминесцентными лампами (5000 люкс, фотопериод 16 час).
Пассирование культур тканей в условиях in vitro вели с пересевом на свежие питательные среды каждые 3-4 недели.
Учет результатов пролиферации проводили через 8 недель. Отмечали число побегов, достигших размеров 10 мм и более на одном экспланте, вит-рификацию побегов в ходе культивирования, развитие каллусной ткани у их основания, образование корней.
Культура верхушечных и пазушных почек
Для многих видов сельскохозяйственных и декоративных культур уже отработаны условия клонального микроразмножения ценных генотипов (Kyte, 1988; Джигадло и др., 2003), что позволило биотехнологии внести существенный вклад в повышение эффективности селекции.
Работы по получению и ведению культуры ткани люпина находятся в начальной стадии. Число научных публикаций в этой области очень ограниченно (Sroga,1983; 1986;1987; Ormerad, Kaligari, 1993; Sator, 1985; Schafer-Menuhr, 1986, 1990; Vuillaum, HofF, 1986; Schafer-Menuhr, Stunner, 1987; Крупнова и др., 1988; Ko-струбин и др., 1988). Основное внимание уделяется проблемам оптимизации каллу-согенеза и регенерации растений, а также - культивирования in vitro зародышей на ранних стадиях развития, поскольку это поможет решить проблему несовместимости при межвидовых скрещиваниях (Schafer-Menuhr et al.,1988).
В первых опытах нашей лаборатории по изучению поведения различных органов и тканей люпина, а именно: гипокотиля, семядолей, изолированных верхушечных и пазушных почек в культуре in vitro, проверены питательные среды, характеризующиеся широким размахом в качественном и количественном составе (Яговенко, 1998). На 6 разных питательных средах в двух модификациях: с добавлением активированного угля и без него, исследовано 13 видов люпина. Проведенные исследования показали, что с разной степенью интенсивности на богатых по минеральному составу средах (ЛС , В5, Смирнова) все экспланты образуют каллусы. Добавление в среду активированного угля приводит к совершенно иной направленности процессов, происходящих в изолированных тканях; из верхушечных и пазушных почек развиваются нормальные побега, у основания семядолей в большинстве случаев развиваются корни. Интересно отметить, что из пазушных меристем белого люпина в большинстве случаев развивались цветки, по 1-2 из почки. Более интенсивно эти процессы - образование побегов и корней, - происходят также на богатых средах - наибольший эффект получен на среде Смирнова, затем следуют В5 и LS. Необходимо однако, заметить, что на среде Смирнова развитие побегов происходит без умножения их числа на одном экспланте, поэтому в опытах по штопальному микроразмножению среда Смирнова использовалась только на этапе укоренения. Среди изученных видов и сортов люпина более сильная реакция на условия in vitro выявлена для дикорастущего многолистного люпина (L. polyphyllus) с белыми и синими цветками, далее по степени уменьшения - у люпина изменчивого (L. mutabilis), узколистного (L. angustifolius) и некоторых сортов и сор-тообразцов желтого люпина (L. luteus). Анализ литературы показывает, что для каждого вида и даже сорта растений необходимо подбирать концентрации гормонов и основных элементов питания.
Похожие диссертации на Биотехнологические приемы расширения исходного материала для селекции люпина
