Введение к работе
- З -1.
Актуальность проблемы. Ыикобактерии широко распространены вс внешней среде, но особое положение среди них занимают микобакте-рии туберкулёза, вызывающие заболевание людей и животных.
Из сельскохозяйственных животных наиболее часто поражается туберкулёзом крупный рогатый скот. Размеры экономического ущерба от этого заболевания в различных хозяйствах неодинаковы и зависят от эпизоотической ситуации и формы течения болезни, степени выявления больных животных, величины затрат на противотуберкулёзные мероприятия. По оценке А.Г.Жилинского с соавт. (1986) и П.С.Кау-рова (1988), экономический ущерб в результате заболевания одного животного в мелочно-товарном хозяйстве составлял 403,4 руб., а в племенном - 1819 руб. (по.ценам 1988 года).
Эта проблема до настоящего времени актуальна для многих регионов России, в которой ежегодная заболеваемость крупного рогатого скота туберкулёзом составляет около 2% от имеющегося поголовья -(В.М.Авилов, В.Ф.Еьшинин, 1992).
Одной из особенностей туберкулёза как типичной хронической инфекции является преобладание латент/ых форм и случаев бактерионосительства.. Клинические признаки болезни у крупного рогатого скота возникают лишь.при длительном течении инфекции и особо неблагоприятных условиях его содержания и кормления.
Основной для прижизненной диагностики туберкулёза крупного рогатого скота является туберкулиновая проба. Однако нередкими являются случаи возникновения парааллергической реакции на туберкулин, вызываемой некоторыми атипичными микобактериями. Это делает необходимым проведение специальных патологоанатомичес-ких, бактериологических и аллергологических исследований с учётом эпизоотологических данных и клинических признаков болезни. При послеубойном осмотре реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота не всегда удаётся установить туберкулёзные изменения во внутренних органах и тканях животных (А.И.Кузин, 1987). Лабораторные исследования на туберкулёз проводятся в срок до 3 месяцев, а в Некоторых случаях могут занимать до полугода. Кроме того выявление инфекционного агента при туберкулёзе может Сыть осложнено из-за наличия у микобактерий ультрамелклх и L-форм. Родовую и видовую идентификацию з этом случае осуществляют на основании
- 4 -сохранения у них признака кислотоустойчивое либо путём получения ревэрсии в исходную Оактериальную форму при пассировании на серии специальных сред с осмотическим протектором, либо при заражении чувствительных лабораторных животных. На проведение таких исследований затрачивается до двух лет (И.В.Коваленко, 1989). В связи с этим создание высокочувствительных экспресс-методов индикации и идентификации микобактерий, независимых от формы микобак-терий и позволяющих в ряде случаев разрешать спорные вопросы, которые не могут быть решены традиционным методам исследований, до сих пор продолжает оставаться актуальной проблемой и является одним из важнейших направлений научных исследований по туберкулезу. Цель и задачи исследований. Целью данной работы является разработка комплексного метода дифференциации М. tuberculosis и М. bovls от атипичных видов микобактерий на основе современных направлений молекулярной генетики - с помощью реакции ДНК-ДНК гибридизации и полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
-
усовершенствовать метод приготовления лизатов из культур Микобактерий для использования их в реакции ДНК-ДНК-гибридизации;
-
разработать метод приготовления лизатов из культур микобактерий для постановки реакции цепной полимеризации;
-
усовершенствовать метод дифференциации культур М. tuberculosis и М. bovls от атипичных видов микобактерий в реакции ДНК-ДНК гибридизации с помощью ДНК-зонда МБ-01, меченного нерадиоактивной меткой;
-
создать диагностическую систему для дифференциации микобактерий человеческого и бычьего видов от атипичных видов микобактерий на основе использования полимеразной цепной реакции.
Научная новизна работы. Впервые в отечественной науке проведены исследования по созданию диагностической системы для дифференциации культур М. tuberculosis и М.bovls от атипичных видов микобактерий методом полимеразной цепной реакции, позволяющим проводить исследования в течение 5-6 часов и получать высокодостоверные результаты. Доказана высокая чувствительность разработанного метода, с помощью которого можно улавливать до 100 клеток в образце методом rejib-злектрофорева.
Впервые разработан метод нерадиоактивного (с помощью дигок-сигениновой ферментной метки) выявления микобактерий бычьего и
- Б -человеческого ьидов на основе ДНК-зонда МБ-01, чувствительность которого позволяет улавливать до 104 клеток в образце.
Созданы методы быстрого и эффективного разрушения клеток и получения лизатов микобактерий, пригодных для использования при постановке реакции Д1ІК-ДНК гибридизации и ІЩР. Практическое значение работы. Показана возможность использования ДНК-зондз МБ-01, меченного ферментной (дигоксигениновой) меткой, для дифференциации культур млкобактерий туберкулеза челоьгческого и бычьего видов от атипичных видов микобактерий.
Подобрана пара олигонуклеотидов, на основе которой предложен экспресс-метод дифференциации микобактерий М. tuberculosis и M.bovls от атипичных видов с помощью ІЩР. Отработаны условия и режимы постановки реакции амплификации.
Разработанные методы.подготовки клеток микобактерий для исследований с помощью ДНК-зондов' и ЩР являются основой для выявления И. tuberculosis и M.bovis в патматериале.
По результатам проведённых исследований разработаны методические рекомендации по дифференциация культур И. tuberculosis и Af.bovis от атипичных микобактерий методом лолиыеразной цепной реакции (ЩР)".
Апробация результатов исследований. Материалы диссертационной работы доложены на научной конференции,, посвященной 70-летию лаборатории эпизоотологии, диагностики и прсфилакти'Ш туберкулёза и паратуберкулёза ШЭВ, на межлабораторном научно-производственном совещании сотрудников л^ораторий санитарной микробиологии, технологии ветсанмеропрйятий, ветеринарно-санитарной экспертизы мяса, санитарии молока и профилактики маститов, сектора санитарии очистных сооружений Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии гигиены и экологии и лаборатории молекулярной биологии и биохимии Всесоюзного института экспериментальной ветеринарии РАСХН от 5 февраля 1993 года. Публикации. По материалам диссертации опубликована 1 работа и 3 работы сданы в печать.
OfrijMjgri^oTH. Материалы диссертации изложены на 121 странице машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, оо-зер литературы, материалы и метод.., результаты собственных исследовании, обсуждение результатов, выводы и список литературы, содержащий 133 отечественных и иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 15 рисунками.
- б -