Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Регенерация кожи и заживление ран 10
1.1.1. Воспаление 12
1.1.2. Восстановление эпидермиса 15
1.1.3. Формирование грануляционной ткани 16
1.1.4. Восстановление сосудистой сети 17
1.1.5. Контракция раны 18
1.1.6. Ремоделирование ткани 19
1.2. Методы лечения повреждений кожи 20
1.2.1. Кожные трансплантаты 21
1.2.2. Тканеинженерные конструкции для восстановления кожи 22
1.2.3. Раневые покрытия 25
1.3. Биосовместимые материалы как основа конструкций для восстановления кожи 29
1.3.1. Материалы для тканевой инженерии и регенеративной медицины 30
1.3.2. Влияние ВКМ и биосовместимых материалов на функции клеток 32
1.3.3. Фиброин 36
1.3.4. Метакрилированный желатин 41
1.4. Мышиная модель полнослойной раны кожи 44
2. Материалы и методы 46
2.1. Материалы 46
2.1.1. Клеточные линии 46
2.1.2. Лабораторные животные 47
2.2. Методы 47
2.2.1. Синтез метакрилированного желатина 47
2.2.2. Получение водного раствора фиброина шёлка 48
2.2.3. Получение раствора ЖМА и фиброина в смеси вода/ДМСО 48
2.2.4. Получение раствора ЖМА и фиброина в смеси вода/пропиленгликоль 48
2.2.5. Получение водного раствора ЖМА и фиброина 48
2.2.6. Формирование фотополимеризуемых пленок 49
2.2.7. Получение микроструктурированных поверхностей 49
2.2.8. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) 50
2.2.9. Изучение механических свойств фотополимеризуемых пленок на основе ЖМА и фиброина 50
2.2.10. Исследование биодеградации фотополимеризуемых пленок на основе ЖМА и фиброина в модельной системе in vitro 50
2.2.11. Культивирование клеток на поверхности фотополимеризуемых пленок на основе ЖМА и фиброина 51
2.2.12. Изучение адгезии и пролиферации фибробластов на поверхности фотополимеризуемых пленок на основе ЖМА и фиброина 52
2.2.13. МТТ-тест 52
2.2.14. Определение количества живых и мертвых фибробластов при культивировании на поверхности фотополимеризуемых пленок на основе ЖМА и фиброина 53
2.2.15. Исследование организации цитоскелета фибробластов на поверхности фотополимеризуемых пленок на основе ЖМА и фиброина 53
2.2.16. Изучение подвижности клеток на поверхности фотополимеризуемых пленок на основе ЖМА и фиброина в модели «рана» 54
2.2.17. Модель полнослойной раны кожи мыши 54
2.2.18. Морфометрический анализ скорости затягивания раны и площади сформированного рубца 55
2.2.19. Проведение гистологических исследований 55
2.2.20. Статистическая обработка экспериментальный данных 56
3. Результаты 57
3.1. Получение и характеристика фотоотверждаемых пленок на основе фиброина шелка и метакрилированного желатина 57
3.2. Культивирование клеток, участвующих в регенерации кожи, на фотополимеризуемых пленках на основе фиброина и метакрилированного желатина 63
3.3. Исследование влияния фотополимеризуемых пленок на основе ЖМА и фиброина на регенерацию в мышиной модели полнослойной раны кожи 72
4. Обсуждение 77
4.1. Получение и характеристика фотополимеризуемых пленок на основе метакрилированного желатина и фиброина шелка 77
4.2. Культивирование клеток, участвующих в регенерации кожи, на фотополимеризуемых пленках на основе фиброина и метакрилированного желатина 87
4.3. Исследование влияния фотоотверждаемых пленок из метакрилированного желатина и фиброина на регенерацию кожи в мышиной модели полнослойной раны кожи 91
5. Заключение 93
Список использованной литературы 95
Список сокращений и обозначений 114
Список иллюстративного материала 116
Благодарности 118
Список работ, опубликованных по теме диссертации 119
- Воспаление
- Метакрилированный желатин
- Культивирование клеток, участвующих в регенерации кожи, на фотополимеризуемых пленках на основе фиброина и метакрилированного желатина
- Исследование влияния фотоотверждаемых пленок из метакрилированного желатина и фиброина на регенерацию кожи в мышиной модели полнослойной раны кожи
Воспаление
Повреждение кожи вызывает нарушение целостности кровеносных сосудов, что приводит к кровоизлиянию. Восстановление гемостаза происходит за счет образования тромба, который также обеспечивает временный матрикс для миграции клеток. Тромбоциты, участвующие в этом процессе, выделяют некоторые важные для регенерации медиаторы, такие как тромбоцитарный фактор роста (PDGF), привлекающий и активирующий макрофаги и фибробласты. Тем не менее, при отсутствии кровотечения заживление раны происходит без участия тромбоцитов [15].
В результате травмы резидентные клетки кожи, такие как кератиноциты, макрофаги, дендритные и тучные клетки, подвергаются воздействию сигналов опасности, которые можно разделить на две основные категории: к первой относятся молекулярные структуры, ассоциированные с повреждением (DAMP), т.е. молекулы, высвобождаемые клетками, подвергающимися некрозу, например, внутриклеточные белки ДНК и РНК; а вторая включает связанные с патогенами молекулярные структуры (PAMP), патоген-специфические молекулы, отсутствующие в организме хозяина, в том числе, бактериальные полисахариды и полинуклеотиды [19]. Эти сигналы распознаются рецепторами иммунокомпетентных клеток, например toll-подобными рецепторами (TLR), что приводит к активации внутриклеточных каскадов, ведущих к экспрессии цитокинов и антимикробных полипептидов и, как следствие, инициирует воспалительный ответ [16].
На ранней стадии воспаления в ответ на выделяемые хемокины, факторы комплемента и продукты деградации бактерий в область раны рекрутируются нейтрофилы [20]. Хемокины индуцируют экспрессию молекул адгезии, например, молекулы межклеточной адгезии 1 (ICAM1), молекулы адгезии сосудистых клеток 1 (VCAM1) и Е-селектинов, на эндотелиальных клетках, которые опосредуют присоединение нейтрофилов к стенке кровеносных сосудов. Адгезия к эндотелиальным клеткам и воздействие хемокинов приводят к изменению цитоскелета нейтрофилов, вследствие чего происходит просачивание нейтрофилов через стенку сосуда. Далее клетки мигрируют по градиенту хемокинов, то есть в область раны [21].
Нейтрофилы поглощают бактерии и разрушенные клетки, а также продуцируют провоспалительные цитокины, например, фактор некроза опухоли (TNF -), интерлейкины (IL), в частности, IL-1 и IL-6. Кроме того, они очищают рану путем высвобождения различных противомикробных веществ [22]. При отсутствии инфекции нейтрофилы остаются в ране в течение 2 – 5 дней.
Как инфильтрирующие, так и резидентные макрофаги активируются локальными сигналами микросреды и далее дифференцируются в различные субпопуляции, отличающиеся функциональными фенотипами [23]. PAMP, выделяемые микроорганизмами, и DAMP, продуцируемыми при клеточном стрессе, в синергии с IFN, секретируемым натуральными киллерами, определяют формирование классически активированных макрофагов (популяция M1), которые способствуют активации иммунитета, защите организма и противоопухолевой активности [24]. Напротив, такие цитокины, как IL-4 и IL-13, приводят к образованию альтернативно активированных макрофагов (популяция M2), которые подавляют воспаление и противоопухолевый иммунитет, регулируют метаболизм глюкозы, а также стимулируют заживление [25]. TLR-лиганды вместе с комплексами иммуноглобулинов G вызывают развитие регуляторных макрофагов, которые продуцируют IL-10 и TGF-1 и играют иммуносупрессивную роль [16]. Важно отметить, что макрофаги обладают значительной пластичностью в своих фенотипах и функциях, то есть они могут легко переключиться с одного функционального фенотипа на другой в ответ на различные стимулы микроокружения [26].
На ранней стадии заживления инфильтрирующие моноциты и резидентные макрофаги в основном приобретают фенотип M1, обусловленный воздействием провоспалительных цитокинов, IFN, микробных продуктов или DAMP [27]. Они фагоцитируют микроорганизмы, очищают раневое ложе от мертвых клеток и продуктов их распада и продуцируют медиаторы воспаления, такие как IL-1, IL-6, IL-12, TNF-, индуцибельную NO-синтетазу (iNOS), а также хемокины для привлечения дополнительных лейкоцитов [28].
Переход макрофагов из воспалительного фенотипа (M1) в репаративный (M2) ассоциирован с завершением воспаления и началом восстановления ткани [24]. М2-макрофаги начинают экспрессировать противовоспалительные медиаторы, например антагонист рецептора IL-1, рецептор-ловушку – IL-1 и IL-10 и факторы роста, например, TGF-, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и IGF-1, способствующие пролиферации фибробластов, синтезу ВКМ и ангиогенезу [29].
Макрофаги индуцируют апоптоз нейтрофилов, затем поглощают мертвые клетки в ходе процесса, называемого эффероцитозом [30]. Нарушение эффероцитоза наблюдается при хронических ранах [16]. Также при исследовании на мышах было выявлено снижение фагоцитарной функции макрофагов, наблюдаемое при старении, ассоциированное с уменьшением заживления [31].
Метакрилированный желатин
Желатин является продуктом частичной денатурации коллагена. Он содержит некоторые биологически активные участки в своей структуре, например, последовательность RGD, которая является сайтом связывания интегринов, что обуславливает адгезию клеток к желатину. Данные рецепторы могут также участвовать в регуляции пролиферации и продукции ВКМ [115]. Известно, что функционализация трипептидом RGD повышает биосовместимость синтетических биоматериалов [116]. Иммобилизация желатина на поверхности материала, полученного из PLGA и хитозана, приводила к ускорению распластывания фибробластов 3Т3 вследствие наличия в его структуре распознающихся интегринами участков и высокой гидрофильности [117].
Желатин широко используется в фармацевтических и медицинских приложениях вследствие его биосовместимости и способности к биодеградации в физиологических условиях. Он имеет относительно низкую иммуногенность, так как является денатурированным белком в отличие от коллагена, который демонстрирует антигенные свойства при имплантации [118]. Желатин способен формировать физические гели при охлаждении [119]. Однако такие гели подвергаются быстрой деградации в водных растворах, а их характеристики трудно поддаются контролю, в связи с чем их применение ограничено.
В результате химической реакции с метакриловым ангидридом может быть получен желатин-метакрилоил или метакрилированный желатин (ЖМА), гидрогели из которого широко используются в различных биомедицинских приложениях вследствие их биосовместимости и возможности регулировать их физические характеристики [120]. Схема реакции представлена на рисунке 1. Так как желатин представляет собой набор полипептидов, полученных при гидролизе коллагена, его первичная структура может варьировать. В типичном случае желатин содержит 5% аминокислотных остатков, содержащих свободные аминогруппы (лизин и гидроксилизин), и около 19% – гидроксильные (серин, треонин, гидроксипролин и гидроксилизин) [121].
Получение метакрилированного желатина обеспечивает возможность использовать техники, основанные на фотополимеризации, для изготовления на его основе конструкций с хорошо контролируемыми физико-химическими свойствами. Например, для получения скаффолдов для тканевой инженерии может быть использована стереолитография. Для осуществления полимеризации фоточувствительных мономерных или полимерных смол в выбранных областях используется УФ-лазер. Таким образом, возможно получение 2D-структур, а также 3D-объектов, при этом их формирование происходит слой-за-слоем [123]. Усовершенствованная технология – метод двухфотонной абсорбционной литографии позволяет получать объемные структуры за один этап [124]. Также преимуществом фотополимеризуемых материалов является возможность их формирования непосредственно в области повреждения. Некоторые типы таких гидрогелей могут также содержать в себе инкапсулированные клетки [125]. Химическая модификация желатина метакриловым ангидридом обычно затрагивает менее 5% аминокислотных остатков в молярном соотношении [126], что подразумевает отсутствие влияния на большинство функциональных аминокислотных мотивов (таких как RGD и последовательности, распознающиеся MMP). В частности, мотивы RGD не содержат групп, вступающих в эту реакцию, что обеспечивает сохранение адгезионных свойств ЖМА [127].
Наличие в структуре ЖМА лигандов клеточных рецепторов, а также сайтов, распознаваемых MMP, определяет сходство полученных на его основе гидрогелей с естественным ВКМ и делает их подходящим субстратом для культивирования клеток. Было показано, что различные типы клеток прикрепляются и пролиферируют на поверхности субстратов из ЖМА, а также могут быть инкапсулированы в гидрогели на его основе с сохранением высокой жизнеспособности [122]. Использование ЖМА для модификации субстратов на основе полиэтилентерефталат гликоля способствовало значительному повышению к ним адгезии фибробластов 3Т3 увеличению степени распластывания клеток [128].
Гидрогели на основе ЖМА используются как модели для исследования ангиогенеза в трехмерных системах, а также для получения васкуляризованных тканеинженерных конструкций. Инкапсуляция в гидрогели из ЖМА и последующее совместное культивирование эндотелиальных колониеобразующих клеток и МСК, полученных из крови и костного мозга человека соответственно, приводило к образованию in vitro сходных с капиллярами структур, формирующих трехмерную сосудистую сеть [129].
Совмещение с другими полимерами позволяет варьировать механические характеристики гидрогелей на основе ЖМА, что даёт возможность рассматривать их как основу для формирования различных тканей. Например, при добавлении бактериального полисахарида, геллановой камеди, к этому фотополимеризуемому материалу был получен тканеинженерный аналог хряща. Для формирования конструкции совмещали техники фотополимеризации и экструзии. Были подобраны оптимальные значения соотношения компонентов для инкапсуляции хондроцитов и обеспечения требуемых механических характеристик [130].
Внесение фиброина в состав гидрогелей на основе ЖМА приводило к увеличению их стабильности и значительному уменьшению скорости протеолитической деградации под воздействием коллагеназы [131]. Добавление фиброиновых микрочастиц к раствору ЖМА, содержащему фибробласты 3Т3, при 3D-печати способствовало более равномерному распределению клеток вследствие увеличения вязкости раствора. При этом биосовместимость получаемого гидрогеля оставалась высокой [132].
Использование ЖМА для восстановления кожи является перспективным направлением. Было показано, что кератиноциты линии НаСаТ сохраняли высокую жизнеспособность, а также были способны формировать многослойный эпителий на поверхности гидрогелей на основе ЖМА [133].
Культивирование клеток, участвующих в регенерации кожи, на фотополимеризуемых пленках на основе фиброина и метакрилированного желатина
Фибробласты и кератиноциты являются клеточными компонентами кожи. Взаимодействие этих клеток с биосовместимыми материалами в условиях in vivo может инициировать процессы регенерации. Исследования in vitro позволяют оценить эту возможность.
Для изучения адгезии клеток к поверхности пленок на основе ЖМА и фиброина, а также их пролиферации, использовали фибробласты линии 3Т3. Динамику роста клеток оценивали двумя методами: с использованием МТТ-теста (рисунок 7) и путем подсчета ядер фибробластов по изображениям, полученным с применением КЛСМ (рисунки 8 и 9). В качестве контролей служили материалы, рутинно применяемые для выращивания клеток, – культуральный пластик и стекло.
Величина определяемой в ходе МТТ-теста оптической плотности формазана линейно зависит от числа живых клеток в исследуемых образцах [139]. Значения этого сигнала не отличались для исследуемых образцов на первый день культивирования, а на 3 и 7 дни эксперимента было выявлено, что использование всех типов фотополимеризуемых пленок в качестве субстрата приводит к снижению значений оптической плотности по сравнению с контролем (рисунок 7). На всех исследованных временных точках статистически значимых отличий между пленками разных типов не было выявлено. Исследование с использованием конфокальной микроскопии (рисунок 8) показало, что фибробласты равномерно распределялись по поверхности пленок на 1 день культивирования, затем их число увеличивалось, что приводило к формированию монослоя клеток на 7 день эксперимента. Аналогичные результаты наблюдались и в контроле.
Проведение количественной оценки плотности клеток (рисунок 9) выявило, что ее значение при культивировании клеток на фотополимеризуемых пленках всех типов было сопоставимым или даже несколько выше по сравнению с величинами, полученными при использовании стекла в качестве субстрата, через сутки после нанесения суспензии (рисунок 9). В то же время на 7 день значения данного показателя были ниже, чем на контрольных образцах, что указывает на то, что скорость пролиферации фибробластов на фотополимеризуемых пленках была ниже, чем на стекле. Рисунок 9. Увеличение плотности фибробластов линии 3Т3 при культивировании на поверхности фотополимеризуемых пленок на основе фиброина и ЖМА
Результаты подсчета клеток по изображениям, полученным методом КЛСМ. ( дисперсионный анализ с последующим тестом Тьюки, p 0.05)
Было показано, что в ходе культивирования на всех типах фотополимеризуемых пленок доля живых клеток составляла более 95%, что также было характерно и для фибробластов, культивируемых на стекле (Рисунок 10).
Для оценки адгезии и пролиферации кератиноцитов линии HaCaT, культивируемых на поверхности фотополимеризуемых пленок, использовали МТТ-тест (рисунок 11).
На 1 день культивирования оптическая плотность формазана не имела статистически значимых отличий от контроля. Ее значения возрастали с течением времени, что свидетельствовало о пролиферации клеток. На 7 день эксперимента значения этой величины для образцов ЖМА-фиб-ПГ и ЖМА-фиб-ДМСО были выше, чем для других образцов.
Важной характеристикой, отражающей взаимодействие клетки с материалом, является ее морфология. Методом конфокальной микроскопии оценивали площадь фибробластов мыши 3Т3, организацию их актинового цитоскелета, а также выявляли винкулин через 10, 30, 60, 180 и 240 минут после инокуляции. Результаты исследования представлены на рисунках 12 и 13.
Клетки прикреплялись к поверхности исследуемых субстратов уже через 10 минут после нанесения суспензии (рисунок 12). Оценка площади фибробластов показала, что на пленках ЖМА-фиб-ПГ и ЖМА-фиб-ДМСО клетки распластывались приблизительно с той же скоростью, что и на стекле (Рисунок 12). В то же время на образцах ЖМА-фиб-В наблюдалась тенденция к снижению значений средней площади клеток по сравнению с другими группами.
Также был произведён анализ морфологии клеток при распластывании на поверхности субстратов (рисунок 13). В течение первых 30 минут после нанесения суспензии значительная часть клеток формировала филоподии на поверхности ЖМА-фиб-ПГ и ЖМА-фиб-ДМСО, чего практически не наблюдалось при исследовании образцов на стекле и ЖМА-фиб-В. При этом через 30 минут большая часть клеток на стекле характеризовалась наличием данных структур, в то время как для фибробластов, культивируемых на ЖМА-фиб-В пленках, такого эффекта не наблюдалось.
Влияние фотополимеризуемых пленок на основе ЖМА и фиброина на подвижность клеток изучали in vitro в модели экспериментальной «раны» (Рисунок 14). Фибробласты линии 3Т3 культивировали на поверхности ЖМА-фиб-ДМСО, ЖМА-фиб-ПГ и на стекле до формирования ими монослоя. После этого удаляли часть клеток. Уровень миграции клеток в образовавшуюся «рану» оценивали по изменению ее площади через 4, 12 и 16 часов после формирования.
Было установлено, что исследуемые пленки поддерживают миграцию клеток, при этом экспериментальная рана зарастала быстрее, чем на стекле (Рисунок 14). Отличия были выявлены через 4 часа после нанесения «раны» и сохранялись на протяжении всего эксперимента. Через 16 часов после формирования «раны» на образцах фотополимеризуемых пленок фибробласты полностью заполнили ее пространство, чего не наблюдалось при исследовании контрольных образцов. Таким образом, по результатам проведенных исследований можно сделать вывод, что полученные фотополимеризуемые пленки являются подходящим субстратом для культивирования клеток, участвующих в регенерации кожи. При этом, если в случае фибробластов для всех типов фотополимеризуемых пленок наблюдалась тенденция к снижению скорости пролиферации по сравнению с контрольными субстратами, то кератиноциты по результатам МТТ-теста демонстрировали больший прирост при культивировании на поверхности ЖМА-фиб-ДМСО и ЖМА-фиб-ПГ. Объединяя этот результат с данными по исследованию стабильности и механических характеристик (Рисунки 4 и 5, таблица 2) можно сделать вывод, что ЖМА-фиб -ДМСО в наибольшей степени подходят на роль раневых покрытий. В связи с этим ЖМА-фиб-ДМСО были выбраны для дальнейших исследований in vivo.
Исследование влияния фотоотверждаемых пленок из метакрилированного желатина и фиброина на регенерацию кожи в мышиной модели полнослойной раны кожи
Заживление ран кожи зависит от ряда сложных взаимодействий между клетками и их микроокружением, а также системных воздействий и внешних факторов, что может приводить к различным функциональным результатам. При глубоких повреждениях у взрослых млекопитающих процесс заживления, как правило, завершается образованием рубца. Использование раневых покрытий на основе природных биоматериалов может повлиять на заживление ран и способствовать восстановлению нормальной кожи.
В ходе проведенного исследования in vivo было выявлено, что использование фотополимеризуемых пленок на основе ЖМА и фиброина для закрытия полнослойных ран способствовало снижению их контракции в первые дни после операции, и ускорению эпителизации, что в результате приводило к более быстрому затягиванию раны по сравнению с контролем (Рисунок 15). Данные гистологического анализа также указывают на то, что процесс контракции вносил меньший вклад в затягивание ран при их закрытии фотополимеризуемыми пленками (Рисунок 17). Сходный эффект уменьшения контракции в течение первой недели и последующего увеличения вклада эпителизации при заживлении полнослойных ран кожи мышей наблюдался при исследовании коммерческих гидроколлоидных раневых покрытий [176].
В контрольной группе мышей через 28 дней после нанесения повреждений кожи наблюдался рубец с характерным плотным расположением волокон коллагена, в то время как у животных, раны которых покрывали изучаемым материалом, формировалась ткань, более сходная с нормальной дермой кожи (Рисунки 16, 17). Также было выявлено, что в экспериментальной группе плотность клеток, определенная по количеству ядер на гистологических срезах, была также близка к нормальной ткани (Рисунок 18). Кроме того, в ней присутствовало значительное количество волосяных фолликулов (Рисунок 18). Их наличие в центре поврежденной области у животных, раны которых закрывали полученными фотополимеризуемыми пленками, может свидетельствовать об их образовании de novo. Ранее было показано, что этот процесс может происходить при заживлении ран генетически нормальных мышей и на молекулярном уровне имеет сходство с происходящим в ходе эмбриогенеза процессом, при этом придатки формируются из клеток межфолликулярного эпидермиса [177].
Раневые покрытия могут способствовать регенерации за счет поддержания оптимальной влажности, что способствует повышению миграции кератиноцитов [11]. Более быстрое восстановление эпидермиса, в свою очередь, является одним из факторов, вызывающих снижение образования рубцовой ткани [178]. В то же время фиброин [105] и продукты его биодеградации [5] способны оказывать влияние на функции клеток и, таким образом, способствовать регенерации. Данные in vitro указывают на то, что фотополимеризуемые пленки оказывают регуляторное воздействие на скорость роста фибробластов (Рисунок 7) и кератиноцитов (Рисунок 11). Ранее было показано, что инъекционное введение микроносителей на основе фиброина и желатина также способствует регенерации кожи [113, 114].
Таким образом, в представленной работе фотополимеризуемые пленки на основе фиброина и ЖМА проявляют антифибротическую активность, способствуя более полному восстановлению кожи.