Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1.1 . Иммунность к собственному колицину 10
1 1 2 Защита от колицинов 11
1 1 3 Эволюция колицинов 11
1.1 4 КолицинЕІ 13
1.2. Микроцины 15
1 2 1 МикроцинВ17 18
1.2 2. Механизм действия микроцина В17 21
1 2.3. Иммунитет к микроцину В17 22
1 2 4. Регуляция экспрессии микроциновых генов 22
1.2.5. Устойчивость к микроцину типа В 25
1 2 6. Другие микроцины типа В 26
1 3. Экологическая роль колицинов и микроцинов 27
13.1. Теоретические модели изучения экологии бактериоцинов 30
1 3 2. Экспериментальные модели изучения экологии бактериоцинов 34
1 4 Применение колицинов и микроцинов 35
1 4 1 Пробиотики 36
1 4.2. Пробиотики на основе Е coh 39
Глава 2 Материалы и методы 43
21 Бактериальные штаммы, плазмиды, бактериофаги 43
2 2 Среды и условия культивирования 45
2 3 Установление продукции бактериоцина 46
2 4. Определение типа бактериоцина 47
2 5 Селекция на бактериоцинах 47
2 6 Трансформация клеток Е coh 48
2 7 Трансдукция бактерий 49
2 7 1 Приготовление лизатов 49
2 7 2 Трансдукция с использованием Р1 фаголизатов 49
2 8 Электротрансформация бактерий 50
2 9. Манипуляции с ДНК 50
2 9 1. Выделение плазмидной ДНК 50
2.9 2 Очистка плазмидной ДНК 51
2.9.3. Концентрирование ДНК 52
2.9.4. Электрофорез в агарозном геле 52 2.9 5. Выделение фрагментов ДНК из агарозы 52
2.10. Картирование ДНК 53
2.11. Клонирование 54
2.11.1. Дефосфорилирование ДНК 54
2.11.2. Лигирование 54 2.11 3. Превращение выступающих 5/-концов в тупые 55
2.11.4. Превращение выступающих 3 -концов в тупые 55
2.11 5. Встраивание линкеров 56
2.11.6. Клонирование генов, связанных с продукцией и иммунностью к микроцину 56
2.1161. Приготовление фаголизатов Ми 56
2.11 6 2. Трансдукция с использованием фаголизатов Ми 57
2.11.6 3. Конструирование двойного лизогена 57
2.11.64 Получение банка генов 58
2 12 Полимеразная цепная реакция и подбор праймеров 59
2 13. Секвенирование ДНК 60
2.1.4 Объекты исследования 61
Глава 3 Результаты и обсуждение 63
3.1 Антагонистические свойства штамма Е coh S5/98 63
3.1.1. Генетическое маркирование штамма Е coh S5/98 63
3 1 2. Перекрестная устойчивость штамма Е coh S5 Sm и индикаторных
культур 64
3.1 3 Кривые роста штамма Е coh S5 Sm и индикаторных культур 64
3 1.4 Конкурентная динамика штаммов-продуцентов разных
бактериоцинов 66
3 1 5 Получение штамма-продуцента микроцина и колицина 70
3 2 Исследование генов штамма Е coh S5/98, связанных с продукцией микроцина и иммунностью к нему 72
3 2 1 Клонирование микроциновых генов 73
3 2 2 Структура клонированного фрагмента 76
3 2 3 Субклонирование генов иммунности к микроцину В5 77
З 3 Устойчивость к микроцину типа В 79
3.4 Получение изогенных рекомбинантных штаммов кишечной палочки -продуцентов комплекса антибиотических факторов 82
3.4.1. Конструирование векторов 83
3.4 2. Конструирование илазмид с генами бактериоцинов двух типов 83
3 5 Исследование поведения рекомбинантных штаммов кишечной палочки - продуцентов комплекса антибиотических факторов т vitro 85
3.5.1. Стабильность рекомбинантных плазмид в штамме Е coll М17 85
3 5 2. Перекрестная устойчивость штаммов производных Е coll Ml7 86
3 5.3. Динамика популяций штаммов производных Е coll М17 в смешанных культурах 88
3 6. Моделирование динамики микроциногенной популяции в гомогенной среде 93
3 7 Эксперименты на животных 94
Заключение 98
Выводы 103
Список литературы 104
Приложения 119
- . Иммунность к собственному колицину
- Бактериальные штаммы, плазмиды, бактериофаги
- Антагонистические свойства штамма Е coh S5/98
Введение к работе
Актуальность проблемы. Явление антагонизма между бактериями, в большинстве случаев, обусловлено синтезом бактериоцинов (Cursino et al., 2002). В отличие от обычных антибиотиков бактериоцины имеют сравнительно узкий спектр действия, так как активны против бактерий того же вида или родственных видов. Среди бактериоционов кишечных палочек различают колицины и микроцины: они отличаются по химическим свойствам (размеру молекул) и условиям синтеза, которые отражаются на поведении штаммов-продуцентов в микробном сообществе. Интерес к бактериоцинам Escherichia coli связан с важной ролью этой бактерии в качестве компонента микрофлоры кишечника человека и животных. Роль продукции колицинов в обеспечении конкурентоспособности E. coli в условиях кишечника остается спорной, поскольку они, подавляя рост конкурентов, отрицательно сказываются на жизнеспособности самого продуцента. Экология микробных популяций, в которых присутствуют микроциногенные штаммы, практически не изучена. Весьма актуальным является изучение динамики смешанной микробной популяции, в которой присутствуют продуценты нескольких бактериоцинов и штаммы, различающиеся чувствительностью к ним, так как совмещение в клетке продукции нескольких бактериоцинов с различной регуляцией синтеза, возможно, позволит создать высокоэффективные пробиотические препараты с широким спектром антагонистической активности и увеличить диапазон условий, адекватных их применению.
Препараты на основе кишечной палочки используются в основном для лечения и профилактики дисбактериоза кишечника. В настоящее время в России известные препараты пробиотиков разработаны на основе штамма E. coli М17, который является производным штамма E. coli, используемого для получения препарата «Mutaflor» (Altenhoefer et al., 2004; Grozdanov et al., 2004). Однако, в отличие от исходного штамма, коммерческий штамм E. coli М17 утратил способность к синтезу антибиотических веществ и, следовательно, снизил свою антагонистическую активность в отношении бактерий кишечной группы (Шемчук, 1983). Поэтому оправданы мероприятия по разработке новых пробиотических штаммов или восстановлению антагонистической активности уже существующих штаммов, таких как E. coli M17.
Цель работы. Целью данной работы являлось:
изучить влияние продукции антибиотического вещества природного штамма-антагониста E. coli S5/98 на конкурентоспособность бактерий в смешанных культурах in vitro и пищеварительном тракте опытных животных;
проверить возможность совмещения детерминант продукции разных бактериоцинов и устойчивости к ним в одном штамме с сохранением продукции этих бактериоцинов;
оценить антагонистическую активность изогенных штаммов - производных пробиотического штамма E. coli M17, обусловленную сконструированными рекомбинантными плазмидами ;
исследовать динамику производных штамма E. coli M17 в смешанных популяциях in vitro и в природных популяциях;
разработать стратегию применения пробиотических штаммов на основе E. coli.
Экспериментальные задачи:
клонировать гены, ответственные за продукцию микроцина в перспективном пробиотическом штамме E. coli S5/98 и иммунитет к нему;
создать рекомбинантные штаммы, одновременно продуцирующие микроцин штамма E. coli S5/98 и колицин ColE1, или несущие детерминанты устойчивости к нему;
провести физиологическую характеристику созданных штаммов в чистых культурах, изучить спектр их бактерицидной активности и устойчивости к собственным и чужеродным бактериоцинам;
провести эксперименты по введению созданных штаммов в кишечник телят, изучить их конкурентоспособность и влияние на состав эндогенной микрофлоры;
разработать методику количественного определения рекомбинантных штаммов продуцентов бактериоцинов в кишечном содержимом с помощью полимеразной цепной реакции.
Научная новизна и практическая ценность работы.
В настоящей работе клонирован новый микроцин типа В.
Обнаружено, что сверхэкспрессия некоторых генов хромосомы E. coli обеспечивает устойчивость штаммов E. coli к микроцину типа В.
Впервые на основе родительской плазмиды ColE1 получены новые плазмиды pColdelAp, pPAL2, pPAL3, pPAL4, pPAL5, в том числе плазмиды pPAL4 и pPAL5 с совмещенными детерминантами микроцина В5 и колицина Е1, а также рекомбинантные штаммы – производные пробиотического штамма E. coli M17, содержащие сконструированные плазмиды. Показана возможность совмещения детерминант продукции колицина Е1 и микроцина В5 и устойчивости к ним в одном штамме с сохранением продукции этих бактериоцинов.
Изучена конкурентная динамика природного микроциногенного штамма и полученных рекомбинантных штаммов в искусственных смешанных популяциях, а также в кишечнике опытных животных. Предложена теоретическая модель динамики микроциногенных популяций в гомогенной среде.
Впервые показано, что штамм E. coli, одновременно продуцирующий микроцин и колицин, жизнеспособен в условиях кишечника жвачных животных. Введение этого штамма не оказывает заметного влияния на молочнокислую и бифидофлору кишечника животных, но повышает общее содержание в кишечнике бактерий группы кишечной палочки, подавляя при этом развитие патогенных представителей этой группы.
Предложены стратегии применения пробиотических штаммов, суть которых состоит: 1) в направленном формировании кишечной микрофлоры с первых часов жизни животного; 2) применении искусственно сконструированных штаммов с множественной продукцией антагонистических веществ или комбинированного пробиотического препарата, сочетающего несколько штаммов с различными свойствами, в том числе антагонистическими.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях “4th Joint INRA-RRI Symposium on gut microbiology” (Клермон Феран, Франция) в июне 2004 года и “Plasmid biology 2004” (Корфу, Греция) в сентябре 2004 года, на III Съезде ВОГИС “Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития” в июне 2004 года, докладывались на семинарах НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ. Диссертационная работа была апробирована на открытом заседании отдела эволюционной биохимии НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского МГУ 1 ноября 2006 года.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Общий объем диссертации – 122 страницы, включая 16 рисунков и 9 таблиц. Список литературы содержит 180 ссылок, в том числе 23 на русском языке.
. Иммунность к собственному колицину
Колициногенные бактерии защищены от собственного колицина Эта защита обеспечивается белком иммунности, который специфически взаимодействует с С - концевым доменом колицинового белка и инактивирует его. Белки иммунности, которые связываются в цитоплазме с колицинами с эндонуклеаз-ной активностью, такими как Е2 и Е9, высвобождаются в среду в эквимолярных с колицином количествах. Белки иммунности, которые инактивируют колицины, образующие поры в мембране, находятся и функционируют в мембране, и колицины высвобождаются во внешнюю среду не связанными с белками иммунности (Lindeberg, Cramer, 2001, Cursino et al, 2002) Гены белков иммунности, которые транскрибируются в одном направлении с генами колицинов, контролируются SOS системой репарации ДНК, противоположно транскрибирующиеся - имеют свой собственный, как правило, слабый промотор (Braun et al, 1994)
Защита от колицинов
Помимо устойчивости к собственным колицинам за счег специфических белков иммунности, существует два основных механизма защиты потенциально чувствительных клеток от колицинов 1) отсутствие колициновых рецепторов или их модификация вследствие мутации ("resistance"), 2) отсутствие транслокационных систем для колицина или их неспособность транслоцировать коли-цин вследствие мутации ("tolerance") (Zinder, 1973; Davies, Reeves, 1975, Hardy, 1975; Feldgarden, Riley, 1998, Cursino et al, 2002).
Очевидно, факт существования колицинов должен приводить к селекции бактерий, утративших рецепторы (Reeves, 1965) Показано, что возникновение устойчивости к одному колицину может приводить к устойчивости бактерии сразу к нескольким колицинам (Davies, Reeves, 1975, Feldgarden, Riley, 1998)
Гордон показал, что более чем 70% природных изолятов устойчивы по меньшей мере, к одному колицину, и 30% изолятов были устойчивы к трем и более колицинам. Утрата рецептора может приводить к возникновению устойчивости ко всем колицинам, которые связываются этим рецептором Однако были описаны мутации рецепторов, которые обеспечивали устойчивость только к одному или немногим колицинам (Riley, Gordon, 1999; Cursino et al, 2002)
Эволюция колицинов
В настоящее время все работы по эволюции бактериоцшюв касаются в основном колицинов и некоторых других кишечных бакгериоцинов, таких как клебицины (Riley et al, 2001)
Сравнение нуклеотидных и полипептидных последовательностей колицинов (Riley, 1993, Braun et al, 1994, Riley, Wertz, 2002), исследование нуклео-тидного полиморфизма колициновых генов в природных изолятах (Riley et al, 1994, Tan, Riley, 1997, Pinou, Riley, 2001), а также экспериментальная эволюция (Gordon, Riley, 1999, Lenski, Riley, 2002) и математическое моделирование (Gordon, Riley, 1999), позволили Маргарет Рилей выделить два основных механизма для эволюции колицинов
В основе эволюции колицинов, образующих поры в мембранах чувствительных клеток - самого распространенного типа колицинов в природе, лежит рекомбинация Все охарактеризованные колицины этого типа имеют сходные участки в тех или иных доменах колициновых молекул Влияние рекомбинации не ограничено близким родством бактерий. Гак, бакгериоцины Pseudomonas aeruginosa, называемые пиоцинами, образовались в результате рекомбинации между несколькими колицинами, образующими поры, и нуклеазными колици-нами с еще не охарактеризованными бактериоцинами (Sano et al, 1993)
Другой способ эволюции отвечает за разнообразие нуклеазных колици-нов У этих колицшюв, среди которых выделяют РНК-азы и ДНК-азы, предполагается один общий предок. Совпадение нуклеотидных последовательностей нуклеазных колицинов колеблется от 50% до 90%. Однако в і єнах, ответственных за иммунитет к этим колицинам, наблюдается большая дивергенция Для объяснения этой модели дивергенции Рилей и коллеги предложили двухступенчатый процесс модифицирования колицинов, в основе которого лежит строгая позитивная селекция в отношении мутаций, которые расширяют иммунную функцию микробов и их антагонистическую активность (Riley, 1993, Tan, Riley, 1996).
Процесс модификации колицина начинается с мутации в гене иммунности, благодаря которой бактериальная клетка с мутантным геном, сохраняя устойчивость к собственному колицину, приобретает устойчивость и к некоторым другим похожим колицинам Иммунная функция дает возможность мутанту поддерживаться в микробной популяции в присутствие колицинов родиіель-ского штамма Вторая мутация происходит уже в структурном гене колицина и эксплуатирует расширенный спектр иммунности. Так последовательные мутации сначала в гене иммунности, а затем и колициновом гене дают начало новому колицину, который будет убивать клетки с исходным колицином, и тем самым вытеснять предшествующий колицин из популяции. Через некоторое время этого двойного мутанта постигнет такая же участь, вследствие антагонистической активности нового мутанта (Cursino et al, 2002; Riley, Wert/, 2002)
Таким образом, предложены два механизма эволюции колицинов - рекомбинация и положительная селекция, из которых первый играет роль в модифицировании колицинов, образующих поры в мембранах чувствительных клеток, а другой лежит в основе модификации нуклеазных колицинов
Бактериальные штаммы, плазмиды, бактериофаги
Для работы со штаммами Е coh использовали жидкие и твердые (1,5% агара) среды Лурия и Бертани (LB), триптозный агар (ТА), среда Эндо (Миллер, 1976, Маниатис и др, 1984) Среды готовили на дистиллированной воде. В качестве обедненной среды использовали V ТА с добавлением агара для обеспечения необходимой плотности. Также использовали среды следующего состава:
После автоклавирования добавляли 2 мл Ш MgS04 7H20, 0,1 мл 1М СаС12; 10 мл 20% глюкозы
После автоклавирования добавляли 2 мл 1М СаСЬ и 5 мл 20% глюкозы
Для приготовления плотной среды добавляли агара 12 г/л
При необходимости в среды добавляли хромогенний субстрат З-бром-4-хлоро-З-индолил-Р-О-галактозид (X-gal) и индуктор лактозного оперона изо-пропил-І-тио-Р-О-галактозид(ИПТГ)
В работе использовались также антибиотики- хлорамфеникол в концентрации 15 мкг/мл, ампициллин - 30-300 мкг/мл, канамицин - 20-40 мкг/мл, стрептомицин - 40-100 мкг/мл, тетрациклин - 20 мкг/мл, налидиксовая кислота - 20 мкг/мл.
Культуры выращивали при температуре 37"С или, в случае МисА лизо-генов, при температуре 30С с аэрацией на ротационных качалках или без аэрации
2.3. Установление продукции бактериоцина
Антагонистическую активность штаммов, обусловленную продукцией колицинов или микроцинов, определяли с помощью техники «двойною слоя» по методу «отсроченного антагонизма» Исследуемые культуры Е coll засевали методом укола в агар LB в стеклянные чашки Петри (по 7-8 уколов на 1 чашку) Посевы инкубировали при 30С или 37С в течение суток Затем на крышку внутрь чашки для стерилизации помещали смоченную хлороформом фильтровальную бумагу и оставляли чашки перевернутыми при комнатной температуре Через 20 мин чашки подсушивали для удаления следов хлороформа и на нижний слой агара наносили 4 мл расплавленного и охлажденного до 45С 0,7% агара LB, смешанного с 0,1 мл 6-часовой бульонной индикаторной культуры, чувствительной к данному типу микроцина или колицина Результат оценивали через 18-24 часов инкубации при 30 или 37С Вокруг посевов культур, продуцирующих бактериоцины, проявлялись зоны подавления роста индикаторного штамма. Радиус зоны подавления роста (от места укола штамма-продуцента до начала роста чувствительной культуры) измеряли в миллиметрах.
Определение синтеза микроцина проводили также путем высева бактерий на целлофан, который помещали на поверхность агара в чашке Пегри После суточной инкубации целлофан вместе с выросшими колониями бактерий удаляли, чашки со средой стерилизовали хлороформом. Затем чашки заливали питательным 0,7% агаром, в который предварительно была добавлена индикаторная культура в экспоненциальной фазе роста Через сутки на месте колоний, продуцирующих микроцины, образовывались зоны задержки роста индикаторной культуры Иммунитет к микроцину определяли подобным образом. Отсутствие подавления роста индикаторной культуры свидетельствовало об устойчивости её к микроцину.
Антагонистические свойства штамма Е coh S5/98
Первой задачей нашего исследования было установить тип антибиотического вещества, продуцируемого природным штаммом-антагонистом Е coli S5/98, выделенного проф. Таракановым Б В из желудочно-кишечного тракта свиней. Штамм Е coli S5/98 был описан ранее в лаборатории биотехнологии микроорганизмов пищеварительною тракта ГНУ ВНИИФБиІІ сельскохозяйственных животных РАСХН Кроме того, было установлено, что антибиотическое вещество изолята Е coli S5/98 представляет собой пептид и предположительно является микроцином типа В (Тараканов и др, 2003).
Одной из важнейших характеристик штамма Е coli S5/98 является его высокая антагонистическая активность. Таракановым и сотрудниками было показано, что Е coli S5/98 подавляет до 90% штаммов Escherichia coli и до 80% штаммов Salmonella дикого типа, выделенных из крупного рогатого скота и свиней, а также широкий круг колициногенных эшерихий и музейных сальмонелл (Тараканов и др , 2003, Тараканов и др , 2004)
Генетическое маркирование штамма Е. coli S5/98
Было интересно изучить динамику штамма Е coli S5/98 в смешанных культурах. Для этого мы маркировали его детерминантами устойчивости к стрептомицину, который затем использовался в опыте для селекции штамма Е coli S5/98
Штамм Е coli S5 Sm был получен путем трансдукции в микроциноген-ный штамм Е coli S5/98 гена rpsL20 из лабораторного штамма Е coli с использованием Р1 фаголизатов как описано в главе 2 (Миллер, 1976) Ген rp L2Q штамма НВ101 сообщает бактериальной клетке устойчивость к высоким концентрациям (1мг/мл) стрептомицина
В качестве индикаторных культур использовали штаммы-продуценты микроцинов С и В и колицина Е1
Е coli М17(р74) - продуцент микроцина С51,
Е coli BZB 2283 - продуцент микроцина В17,
Е coli TGl(pColap) - продуцент колицина Е1
Экспериментально установлено, что все перечисленные индикаторные штаммы чувствительны к стрептомицину в концентрации 40 мкг/мл.
