Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 8
1.1 Значение вакцинации для профилактики вирусных инфекций 8
1.2 Типы противовирусных вакцин 10
1.3 Механизмы презентации антигенов Т-клеткам 12
1.4 Вакцины на основе частиц
1.4.1 Материалы для создания партикулярных вакцин 15
1.4.2 Влияние размера и заряда частиц на захват антиген-презентирующими клетками 17
1.5 Хитозан и его применение в биомедицинских исследованиях 22
1.5.1 Хитин и хитозан 22
1.5.2 Характеристики хитозана, их влияние на биологическую активность и изменение свойств путем химической модификации 23
1.6 Применение частиц на основе хитозана и других полимеров для разработки вакцин 28
1.6.1 Влияние упаковки антигена в нано- и микроструктуры на длительность защитного эффекта и иммунного ответа 29
1.6.2 Влияние метода иммунизации 31
1.6.3 Введение агонистов паттерн-распознающих рецепторов 33
1.6.4 Влияние размера и заряда частиц на эффективность ответа 35
Глава II. Экспериментальная часть 38
2.1 Реагенты и растворители 38
2.2 Лабораторное оборудование 39
2.3 Выделение белков и исследование биологической активности лактоферрина
2.3.1 Выделение -лактоглобулина (ЛГ) из сыворотки коровьего молока 40
2.3.2 Выделение лактоферрина 40
2.3.3 Денатурирующий электрофорез белков в полиакриламидном геле 41
2.3.4 ВЭЖХ анализ белков молочной сыворотки и оценка чистоты выделенного лактоферрина 41
2.3.5 Исследование аутентичности белка методом двойной радиальной иммунодиффузии 42
2.3.6 Получение апо-лактоферрина 42
2.3.7 Метод атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-АЭС) 42
2.3.8 Метод количественного колориметрического определения содержания железа в белке по реакции с динатриевой солью 3-(2-пиридил)-5,6-бис(4-сульфофенил)-1,2,4-триазина (феррозином) без депротеинизации 43
2.3.9 Определение рибонуклеазной активности лактоферрина 43
2.3.10 Метод ингибирования перекисного окисления липидов 44
2.3.11 Определение антимикробной и антимикотической активности
лактоферрина 44
2.4 Подготовка образцов хитозана и синтез его производных 45
2.4.1 Переосаждение хитозана 45
2.4.2 Кислотный гидролиз хитозана 45
2.4.3 Определение средневязкостной молекулярной массы хитозана 45
2.4.4 Высокоэффективная гель-проникающая хроматография 46
2.4.5 Определение степени дезацетилирования хитозана (СД) методом кондуктометрического титрования 47
2.4.6 Определение степени дезацетилирования хитозана и степени замещения его производных методом протонного ядерного магнитного резонанса (1Н-NMR) 47
2.4.7 Синтез N-гексаноилхитозана 48
2.4.8 Синтез N-сукцинилхитозана 48
2.4.9 Синтез N-[2-(3)-(додец-2 -ен-1 -ил)сукцинил]хитозана. 48
2.5 Формирование и характеристика частиц 49 2.5.1 Формирование частиц на основе лактоферрина и сукцинилхитозана методом термической обработки 49
2.5.2 Получение производных хитозана и белков, а также частиц меченых флуоресцеином изотиоцианатом 50
2.5.3 Определение белка по методу Бредфорд 50
2.5.4 Определение содержания белка в частицах методом флуоресцентной спектрофотометрии 50
2.5.5 Высвобождение белка из частиц 50
2.5.6 Метод динамического светорассеяния (ДСР) 51
2.5.7 Атомно-силовая микроскопия (АСМ) 51
2.6 Исследования in vitro 51
2.6.1 Исследование цитотоксичности частиц и производных хитозана 51
2.6.2 Исследование захвата производных хитозана и частиц клетками методом проточной цитометрии 52
2.6.3 Анализ захвата частиц клетками методом конфокальной микроскопии 52
2.7 Исследования in vivo 53
2.7.1 Иммунизация мышей 53
2.7.2 Иммуноферментный анализ 53
2.7.3 Исследование клеточного состава лимфатических узлов и селезенки 54
2.7.4 Анализ пролиферации клеток 54
Глава III. Результаты и их обсуждение
3.1 Выделение белков из молочной сыворотки 56
3.2 Исследование биологических свойств полученного препарата лактоферрина
3.2.1 Рибонуклеазная активность ЛФ 62
3.2.2 Определение антимикробной активности лактоферрина 63
3.2.3 Исследование антиоксидантной активности лактоферрина методом ингибирования перекисного окисления липидов 64
3.3 Получение низкомолекулярного хитозана и синтез производных хитозана 66
3.4 Получение и физико-химические свойства частиц содержащих белок, инкапсулированный в полисахаридную матрицу на основе хитозана и его производных
3.4.1 Формирование частиц методом контролируемой термической обработки 68
3.4.2 Введение полисахаридов в состав частиц 74
3.4.3 Влияние ПЭГ на частицы 77
3.4.4 Введение незаряженных полисахаридов в частицы
3.4.4 Характеристика частиц методами атомно-силовой микроскопии и динамического светорассеяния 82
3.4.5 Высвобождение антигена из частиц in vitro
3.5 Исследование взаимодействия частиц с клетками макрофагов 87
3.6 Внутриклеточный транспорт производных хитозана 92
3.7 Внутриклеточный транспорт частиц 96
3.8 Токсичность частиц 98
3.9 Исследование иммунного ответа
3.9.1 Гуморальный иммунный ответ 100
3.9.2 Характеристика типа клеточного иммунного ответа 102
3.7.1 Механизмы кросс-презентации СХ-ГМ-ЛФ и СХ-ЛФ-Х 107
Выводы 110
Заключение 112
Список сокращений 112
Список работ, опубликованных по теме диссертации 115
Благодарности 118
Список литературы
- Механизмы презентации антигенов Т-клеткам
- Выделение -лактоглобулина (ЛГ) из сыворотки коровьего молока
- Подготовка образцов хитозана и синтез его производных
- Исследование биологических свойств полученного препарата лактоферрина
Введение к работе
Актуальность проблемы
Вакцинация – это основной способ профилактики инфекционных
заболеваний. Защита от внеклеточных патогенов обеспечивается за счет
выработки иммунной системой антител, распознающих поверхностные белки
патогенов. Для защиты от внутриклеточных инфекций обязательным является
формирование Т-клеточного цитотоксического ответа. Для активации
гуморального иммунитета требуется процессинг антигена антиген-
представляющими клетками (АПК) через эндосомально-лизосомальный путь,
что легко достигается при использовании белковых антигенов в сочетании с
адъювантами. Для активации цитотоксических Т-клеток требуется
внутриклеточный процессинг антигена через протеасомный путь, для чего
необходимо попадание белков антигена в цитозоль АПК. Задача доставки
антигенов в протеасомный путь АПК сейчас решается с помощью
использования ослабленных патогенов (живые аттенуированные вакцины), что
у людей с ослабленным иммунитетом может вызвать заболевание. В настоящее
время используются аттенуированные вирусные вакцины против
полиомиелита, кори, паротита, краснухи и ветряной оспы. Субъединичные вакцины характеризуются отсутствием патогенности, низкой реактогенностью и возможностью легкой стандартизации, но не обладают достаточной иммуногенностью.
Поиск безопасных вакцин, обеспечивающих эффективное формирование цитотоксического ответа и не представляющих опасности перенесения заболевания, является актуальной медико-биологической задачей.
Одним из возможных шагов в направлении повышения эффективности вакцинации является разработка вакцин на основе нано- и микрочастиц (так называемые «партикулярные вакцины»), о чем свидетельствуют результаты многочисленных исследований (Zhao et al., 2014).
Партикулярные вакцины могут сочетать в себе иммуномодулирующие свойства, свойства целевой доставки антигена и работать как адъювант (De Temmerman et al., 2011; Ferreira, Gama, & Vilanova, 2013). Крупный размер таких систем способствует их проникновению в клетку путем фагоцитоза, что является преимуществом, так как фагосомам отводится ведущая роль в процессе кросс-презентации.
В качестве таких композиций широко применяются липосомы (Badiee et al., 2012; Wang, Wang, Zhang, Chen, & Deng, 2014); наночастицы на основе PGA, PLGA, PLA (Moon et al., 2012; Waeckerle-Men et al., 2006); а также частицы на основе хитозана и его производных (Amidi et al., 2007; Sltter et al.,
2010).
Хитозан и его производные являются перспективным материалом для разработки нано- и микроразмерных систем для доставки антигенов и лекарств. Часто такие частицы используются для мукозальной иммунизации пероральным или интраназальным путем, что связано с мукоадгезивными свойствами хитозана. Благодаря этому, частицы на основе хитозана и его производных увеличивают продолжительность пребывания антигена на слизистых оболочках и их поглощение (Amidi et al., 2007; Moon et al., 2012).
Цель работы: разработать системы доставки белковых антигенов на основе природных полисахаридов и охарактеризовать тип иммунного ответа на капсулированный антиген.
Задачи исследования:
-
Оптимизация методики получения наночастиц термической обработкой белка и их характеристика;
-
Модификация белковых наночастиц природными полисахаридами: хитозаном, N-сукцинилхитозаном и галактоманнаном и их характеристика;
-
Анализ взаимодействия полученных наночастиц с эпителиальными и макрофагальными клетками in vitro;
-
Индукция гуморального иммунного ответа полученными наночастицами in vivo в мышиной модели;
-
Анализ клеточного иммунного ответа на наночастицы методом ex vivo.
Научная новизна
В данной работе впервые проведен сравнительный анализ эффективности индукции гуморального и цитотоксического Т-клеточного ответа с помощью панели наночастиц (НЧ), полученных на основе лактоферрина, покрытого полисахаридными оболочками (хитозан, N-сукцинилхитозан, галактоманнан). Впервые проведено исследование роли заряда, наличия гидрофобных заместителей, наличие агониста маннозного рецептора галактоманнана в составе наночастиц на их способность активировать иммунную систему. В экспериментах in vitro на линии макрофагальных клеток впервые было показано различие во внутриклеточном транспорте частиц, вызывающих и не вызывающих клеточный цитотоксический ответ. Впервые показано, что введение гидрофобных заместителей значительно снижает иммуногенность конструкции.
Практическая значимость
Результаты, полученные в рамках диссертационной работы, показывают перспективность использования полисахаридной оболочки определенного
состава для индукции различного типа иммунного ответа. Разработанные конструкции имеют низкую токсичность, при их формировании не используются токсичные сшивающие агенты; они также характеризуются высоким выходом и эффективностью упаковки антигена, что обеспечивает экономическую эффективность данного процесса и возможность применения таких конструкций в медицинских целях.
В процессе работы был получен патент Российской Федерации №2510849 от 30 октября 2012 года «Способ обработки молочной сыворотки» авторов Бакулина А.В., Лопатина С.А., Щербининой Т.С., Варламова В.П., Курченко В.П., Агарковой Е.Ю., Харитонова В.Д., Ботиной С.Г. (Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 05 февраля 2014 года).
Связь работы с научными программами
Работа выполнена при финансовой поддержке государственного контракта № 12.527.11.008, грантов РФФИ (проекты №№ 14-04-00687 а, 12-04-97039-р_поволжье_а, 12-08-01044-а)
Апробация работы и публикации
Результаты работы были представлены автором в виде устных докладов
на конференциях: международный научно-практический симпозиум
«Перспективные ферментные препараты и биотехнологические процессы в
технологиях продуктов питания и кормов» (Москва, 2012), 12-я
Международная конференция “Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана” РосХит 2014 (Пермь, 2014), 22nd Annual International Conference on Composites or Nano Engineering (ICCE-22) (Saint Julien, Malta, 2014). Материалы диссертации были представлены и обсуждены на конференциях: 11-я Международная конференция “Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана” РосХит-2012 (Мурманск, 2012), VI Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Уфа, 2013), XXVI зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2014), Международная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 55-летию Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук и 80-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2014 года), 13th EAACI Immunology Winter School “Basic Immunology Research In Allergy and Clinical Immunology” (Les Arcs 1800, France, 2015), XXVII Зимняя Молодежная Научная Школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии»
(Москва, 2015 г). XXVIII Зимняя Молодежная Научная Школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2016 г).
По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, среди них 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК, 2 в иностранных рецензируемых журналах, 9 тезисов докладов. Получен 1 патент РФ.
Личный вклад автора заключается в планировании и проведении экспериментальных и теоретических исследований, а также в их анализе и подготовке к печати полученных результатов. Основные результаты работы получены автором лично при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», Материалы и методы исследования», «Результаты и их обсуждение», «Выводы», «Список цитируемой литературы». Работа изложена на 134 страницах, содержит 37 рисунков и 7 таблиц. Список литературы содержит 153 ссылки на источники.
Механизмы презентации антигенов Т-клеткам
Т-клетки узнают антигены, представленные на поверхности собственных клеток организма. Эти антигены происходят либо из патогенов реплицирующихся в клетке, таких как вирусы, либо от патогенов и их продуктов, которые были интернализованы клетками путем эндоцитоза из внеклеточной жидкости [17].
Существует два классических пути презентации антигена Т-клеткам. При попадании экзогенного антигена в везикулярный компартмент АПК, задействуется первый путь, в котором презентация антигена происходит с помощью молекул ГКГС класса II. В процессе презентации, макрофаги и незрелые дендритные клетки захватывают экзогенный антиген путем фагоцитоза, либо путем рецептор-опосредованного эндоцитоза в случае B-клеток. Образующаяся фагосома (эндосома) сливается с лизосомой с образованием фаголизосомы, при этом ферменты лизосом расщепляют захваченные белки на пептидные фрагменты. Эти пептиды молекулами ГКГС класса II выносятся на поверхность АПК, где распознаются Т-хелперами (CD4+ Т-клетки)
Второй путь презентации протекает в цитоплазме ядерных клеток и затрагивает эндогенные антигены (синтезированные внутри клетки вирусные белки, белки внутриклеточных бактерий и паразитов, собственные поврежденные белки). Такие белки подвергаются расщеплению на пептиды с помощью мультисубъединичного комплекса протеаз, называемого протеасомой. Специальный белковый комплекс – транспортер, ассоциированный с процессингом антигенов (TAP), переносит пептиды в эндоплазматический ретикулум, где они ассоциируются с ГКГС класса I и вместе с ним попадают на поверхность клетки. Молекулы ГКГС класса I представляют антиген CD8+ Т-лимфоцитам.
Антиген, содержащийся в инактивированной или субъединичной вакцине, не способен самостоятельно проникать и реплицироваться в цитоплазме, и является для клеток экзогенным. Поэтому преимущественным является путь процессинга антигена через ГКГС класса II. Однако существуют механизмы, в результате которых экзогенный антиген может быть представлен CD8+ Т-клеткам. В 1976 году Bevan описал взаимодействие экзогенных пептидов с молекулами ГКГС класса I, с последующей антигензависимой индукцией CD8+ Т-клеточного ответа [18]. Также показано, что захват макрофагами клеток, подвергшихся апоптозу, приводил к развитию цитотоксического иммунного ответа. Механизм кросс-презентации в настоящее время не изучен, однако существует несколько гипотез [19] (Рисунок 1): A. Прямой перенос пептидов из инфицированной клетки в цитоплазму дендритных клеток; Б. Механизм рециркуляции молекул ГКГС I; B. ЭПР-фагосомальная гипотеза; Г. Транспорт через эндосомальную мембрану; Д. Связывание экзосом, секретируемых инфицированной клеткой. Рисунок 1 – Различные модели кросс-презентации антигенов. Адаптировано из [19]. Описание приведено в тексте
Согласно этой ЭПР-фагосомальной гипотезе, презентация экзогенного антигена молекулами ГКГС класса I происходит при непосредственном участии ЭПР и фагосом [20,21]. Считается, что дендритные клетки, в отличие от макрофагов обладают более высокой способностью к кросс-презентации. В качестве возможной причины этого называется более высокое значение pH внутри фагосом дендритных клеток, которое поддерживается с использованием ряда механизмов [22,23]. При попадании антигена в фагосомы с высоким pH, в противоположность фаголизосомам, происходит лишь его частичная деградация, вследствие малого количества и ингибирования активности ферментов. Фрагменты белков транспортируются в цитоплазму и расщепляются убиквитин-протеасомной системой (ЭПР-ассоциированная деградация). Было показано присутствие в структуре фагосомальной мембраны белков ЭПР, отвечающих за транслокацию поврежденных белков из ЭПР в цитоплазму [24]. Предполагается, что это становится возможным благодаря слиянию ЭПР с фагосомой и образованию компартмента, способного самостоятельно осуществлять перенос антигенов с помощью TAP и последующую загрузку пептидных фрагментов на молекулы ГКГС класса I.
Альтернативным путем кросс-презентации является процессинг антигена комплексом лизосомальных/эндосомальных протеаз до конечных пептидов и их загрузка на молекулы ГКГС I класса прямо в фагосоме [20].
Внимание исследователей в настоящее время сосредоточено на создании композиций, способных не только индуцировать сильный и длительный гуморальный ответ, но и клеточный ответ, основанный на активации CD4+ и CD8+ Т-клеток. Такие композиции, часто упоминаются в литературе под названием «партикулярные вакцины». Они могут сочетать в себе иммуномодулирующие свойства, свойства целевой доставки антигена и работать как адъювант [2,3]. Крупный размер таких систем способствует их проникновению в клетку путем фагоцитоза, что является преимуществом, так как фагосомам отводится ведущая роль в процессе кросс-презентации. В качестве таких композиций широко применяются липосомы [4,5]; наночастицы на основе PGA, PLGA, PLA [6,7]; а также частицы на основе хитозана и его производных [8,9].
Выделение -лактоглобулина (ЛГ) из сыворотки коровьего молока
Использовали коммерческий набор «Железо Агат» (ООО «Агат-мед», Россия). Анализ проводился в соответствии с инструкцией производителя. В результате реакции образуется устойчивый окрашенный железо-феррозиновый комплекс, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации железа в анализируемом образце и измеряется фотометрически при длине волны 562 (560-580) нм. Концентрацию железа рассчитывали по Формуле 1: С = Е 2-Егх 5 Ек (1) где С - концентрация железа в опытной пробе, мкмоль/л; Е2 и Eг -оптические плотности опытной пробы до и после добавления феррозина, соотоветственно, ед.опт.плотн.; Ек - оптическая плотность калибровочной пробы, ед.опт.плотности; 89,5 - концентрация железа в калибровочной пробе, мкмоль/л.
Рибонуклеазную активность лактоферрина определяли по продуктам гидролиза высокополимерной РНК, растворимым в 96% этаноле с добавлением 0,02М MgCl2. РНК растворяли в 0,09М ТРИС-НС1 буфере с 0,77 мМ MgCl2 при рН 7,4 в концентрации 1,22 мг/мл. Раствор лактоферрина готовили с использованием 0,09М ТРИС-HCl буфера с рН 7,4. К 0,9 мл раствора РНК добавляли 0,1 мл раствора лактоферрина и инкубировали в течение 20 минут при 37С. Реакцию останавливали добавлением 1 мл 0,02М MgCl2 в 96% этаноле, смесь выдерживали при -15С в течение 5 минут. Осадок отделяли центрифугированием в течение 5 мин при 14000 об./мин. Надосадочную жидкость разбавляли в 10 раз и измеряли оптическую плотность при =260 нм. Активность определяли по Формуле 2: А ед.акт./мг=МD 260 3 Ы0, (2) где А - удельная активность рибонуклеазы, выраженная в ед. акт. на 1 мг белка; D260 - оптическая плотность пробы по сравнению с контролем, измеренная при длине волны 260 нм; 3 - пересчет времени реакции на 1 час; 1 - разведение исходной пробы; 10 - пересчет на 1 мг фермента.
Смешали, 0,8 мл яичного гомогената (Vяичного желтка: VPBS = 1:25; 0,1М фосфатный буфер, рН 7,45) и 0,5 мл раствора образца в концентрации 1 мг/мл, затем добавили 0.4 мл 25 ммоль/л раствора FeS04 для инициирования реакции перекисного окисления липидов. Инкубировали при 37С 60 мин. После этого добавили 1мл 20% (м/об.) трихлоруксусной кислоты и 1мл 0,8% (м/об.) тиобарбитуровой кислоты для погашения реакции. Смесь интенсивно перемешивали и нагревали до 100С в течение 15 мин, и центрифугировали при 6000 об/мин 10 мин. Измеряли поглощение супернатанта при длине волны 532 нм. Ингибирование перекисного окисления липидов рассчитывали по Формуле 3: АО(%) = (1 - Добразец/Дконтроль) 100, (3) где Дконтроль поглощение конт роля, и Добразец – поглощение в присутствии измеряемого образца. Значение антиоксидантной активности сравнивали с активностью 1% растворов галловой и аскорбиновой кислот.
Определение минимальной ингибирующей концентрации проводились на жидкой питательной среде в 96-луночных круглодонных планшетах. Для выращивания бактерий использовался мясопептонный бульон. Для С. albicans -среда Сабуро. Диапазон концентраций лактоферрина от 0 до 1250 мкг/мл. 2.4 Подготовка образцов хитозана и синтез его производных
Готовили 1% раствор хитозана в 1% уксусной кислоте. Раствор фильтровали через мелкопористый фильтр для удаления нерастворенного материала и примесей, после чего добавляли 12% NH4OH до рН 8. Центрифугировали (Центрифуга Sigma 4-16K с охлаждением) при 6000 об./мин течение 15 мин, или декантировали. Осадок диализовали против дистиллированной воды, затем лиофильно высушивали (лиофильная (сублимационная) сушилка MARTIN CHRIST ALPHA 1-4LD plus). Сукцинилхитозан растворяли в 0,5М NaOH, фильтровали через крупный фильтр, титровали до pH 6-6,2 30% уксусной кислотой. Диализовали против дистиллированной воды, затем лиофильно высушивали. 2.4.2 Кислотный гидролиз хитозана К 10 г хитозана с ММ 1040 кДа и СД 89% при комнатной температуре добавляли 200 мл разбавленной азотной кислоты (190 мл H2O и 10 мл HNO3). Нагревали смесь до 70С при перемешивании и инкубировали в течение 8 часов. Затем выключали нагрев, перемешивание и оставляли на ночь. Полученный осадок фильтровали. Осадок растворяли в минимальном количестве воды на водяной бане, фильтровали полученный раствор. Раствор охлаждали, получившийся осадок отделяли на фильтре. Осадок промывали изопропанолом на водяной бане, фильтровали. Осадок с фильтра растворяли в воде, диализовали против дистиллированной воды, лиофильно высушивали. Для полученного препарата определяли молекулярную массу и степень дезацетилирования.
Для определения средневязкостной молекулярной массы использовали методику, приведенную в работе [107], для образцов с СД 85±5 %. Хитозан растворяли в буфере 0,2M ацетат натрия + 2% уксусная кислота (рН 4.45). Раствор центрифугировали для отделения нерастворившихся частиц. Пробу помещали в вискозиметр Уббелоде и термостатировали при 25С. Время истечения растворителя измеряли при разных концентрациях хитозана. Время истечения исследуемого раствора хитозана должно быть больше времени истечения растворителя в 1,4 раза. Средневязкостную молекулярную массу определяли по следующим соотношениям:
Подготовка образцов хитозана и синтез его производных
Следует отметить, что данный процесс был проведен в опытно промышленных масштабах на базе ООО «Молочный комбинат Воронежский» для получения кисломолочного продукта с пониженным содержанием ЛГ, предназначенного для детей с аллергией на этот белок.
Молочная сыворотка является источником еще одного биологически активного белка – лактоферрина (ЛФ). Наиболее распространенным методом его выделения в настоящее время является ионообменная хроматография на катионообменных сорбентах. Использование данного метода обусловлено значительным отличием изоточки ЛФ от других сывороточных белков и его положительным зарядом при pH 7-7,4[115]. Для выделения ЛФ из сыворотки коровьего молока в данной работе был использован катионный сорбент «Диасфер АК Сульфо». Данные анализа выделенного белка свидетельствуют о соответствии его молекулярной массы стандарту бычьего ЛФ (Sigma, США) (Рисунок 6), а также о высокой чистоте ЛФ (более 95%). Аутентичность ЛФ была подтверждена иммунохимически методом двойной радиальной иммунодиффузии по реакции преципитации между выделенным белком и антисывороткой к бычьему ЛФ (Рисунок 7).
О селективности процесса также свидетельствуют данные ВЭЖХ (Рисунок 8): выделенный ЛФ практически не содержит примеси других белков, для сравнения приведена хроматограмма бычьего ЛФ производства Sigma (США). Таким образом, методом ионообменной хроматографии из коровьего молока был выделен лактоферрин с высокой степенью чистоты, которая составляет 98–99% 1000 800-600-400-200
Наряду с чистотой выделенного белка, важно, также, и сохранение его биологической активности в процессе выделения. Известно, что биологическая активность ЛФ в значительной мере определяется его способностью обратимо связывать ионы Fe3+ [116]. В связи с этим, на основе выделенного ЛФ были получены образцы ЛФ с разной степенью насыщения железом. Содержание железа было определено двумя методами: методом атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-АЭС) и методом колориметрического определения по реакции с феррозином. Оба метода показали сходные результаты, которые представлены в Таблице 1. Таблица 1 – Степень насыщения лактоферрина железом
В 1989 году Philip Furmanski с соавторами[117] показали наличие изоформ лактоферрина, имеющих структурную идентичность, однако отличающихся функциональными свойствами. Одна из таких изоформ не обладала способностью связываться с железом, но при этом, обладала способностью расщеплять РНК в 10 раз более высокой по сравнению с обычным ЛФ. В работе [118] в молекуле ЛФ было показано наличие структурных мотивов рибонуклеаз. В данной работе исследовалось влияние степени насыщения железом на активность ЛФ в отношении суммарной дрожжевой РНК. Было показано, что невысокой рибонуклеазной активностью обладал образец со степенью насыщения 25-30% (Таблица 2), что может быть связано с изменением конформации молекул, при котором раскрывается область, ответственная за проявление рибонуклеазной активности.
Рибонуклеазная активность ЛФ, возможно, является одним из механизмов, определяющих его противомикробную активность. Наряду с этим фактором рассматриваются и другие: повреждение клеточной стенки, вследствие положительного заряда молекулы ЛФ, а также снижение жизнеспособности, вследствие дефицита железа, из-за сорбции лактоферрином железа из среды [120]. В ходе наших исследований выяснено, что небольшой антибактериальной и антимикотической активностью обладает только ненасыщенная железом форма лактоферрина, что согласуется с другими исследованиями [121] Большей чувствительностью к лактоферрину обладали грамположительные бактерии и грибы (Таблица 3). При кратковременной инкубации C. albicans с добавлением ЛФ (2 часа) не происходит разрушения клеточной стенки микроорганизмов (клетки не окрашивались пропидий йодидом), которая могла бы привести и их быстрой гибели, что показано методом проточной цитометрии. Более вероятно, что добавление лактоферрина влияет на процессы жизнедеятельности клетки, что приводит гибели (данные по МИК из таблицы 3). О том, что механизм действия ЛФ на C. аlbicans отличен от пермеабилизации мембраны, свидетельствуют и работы других исследователей [122].
Исследование антиоксидантной активности лактоферрина методом ингибирования перекисного окисления липидов
Кислород и его активные метаболиты играют важную роль в поддержании гомеостаза организма. Например, в ходе воспалительного процесса повышается захват кислорода нейтрофилами с образованием супероксид-аниона 02 . ы vitro супероксид-анион и пероксид водорода вступают в катализируемую ионами железа реакцию с образованием гидроксильного радикала:
В отсутствии катализатора данная реакция идет очень медленно Гидроксильный радикал OH является реакционноспособным агентом и может вызвать деградацию чужеродных микроорганизмов или поврежденных клеток собственного организма. In vivo железо находится в связанной с белками форме, поэтому, в зависимости от способности этих белков связывать железо, они могут выступать в качестве ингибиторов или катализаторов образования гидроксильного радикала [123,124]. В результате выполненных нами исследований было показано, что наибольшей способностью ингибировать перекисное окисление липидов обладает образец апо- ЛФ с низкой степенью насыщения железом (Рисунок 9), что согласуется с данными других авторов[125]. При этом активность апо- формы ЛФ сравнивали с активностью таких антиоксидантов как галловая и аскорбиновая кислоты (Рисунок 10).
Исследование биологических свойств полученного препарата лактоферрина
Кинетику высвобождения ЛФ из частиц СХ-ЛФ, модифицированных ПЭГ изучали при инкубации частиц в фосфатном буферном растворе c 0,15М NaCl при температуре 37С в течение 72 часов. Количество высвободившегося составило не более 10% от белка, содержавшегося в частице, и не зависело от времени инкубации (данные не показаны). Низкая степень десорбции говорит о стабильности частиц при нейтральных pH. Отсутствие значительного выхода антигена из частиц увеличивает вероятность проникновения антигена в АПК в виде частицы. При исследовании частиц методом АСМ не было замечено значительных изменений в структуре и размере частиц после инкубации (данные не показаны).
Для формирования иммунного ответа необходимо, чтобы антиген попал внутрь АПК, где происходит процессинг антигена по одному из двух путей. В связи с этим, требуется определить, какие факторы определяют внутриклеточный транспорт антигена. Так как в качестве матрицы для антигена в данной работе выступают производные хитозана, представляет интерес зависимости поглощения и локализации полисахарида внутри клетки от его свойств.
Для исследования процессов транспорта хитозана в клетки чаще всего используются такие методы как проточная цитометрия и конфокальная микроскопия. Данные методы не требуют сложной пробоподготовки и позволяют быстро и в динамике отслеживать процесс внутриклеточного транспорта. Проточная цитометрия также позволяет одновременно анализировать большое количество клеток. Хитозан обладает высокой способностью к адгезии на клеточных мембранах и к сорбции различных красителей, белков, а также липидов. Поэтому при анализе хитозана и наночастиц на его основе методом проточной цитометрии существует проблема разделения внутриклеточной и внеклеточной, адсорбированной на мембране фракций полисахарида/частиц. Нашими исследованиями было показано, что высокое сродство хитозана к клеточной мембране делает неэффективными многократные отмывки, а также обработку трипсином [53]. Наличие связанных с мембраной частиц и агрегатов также снижает и качество изображений, получаемых с использованием метода конфокальной микроскопии. Для решения данной проблемы используются различные методы гашения внеклеточной флуоресценции. Одним из гасителей флуоресценции в зеленой области спектра (Х=488) является трипановый синий (ТС), который не проникает в живые клетки и взаимодействует с флуорофором, локализующимся снаружи [151,152]. Поскольку для индукции иммунного ответа требуется захват антигена АПК, к которым относятся макрофаги и дендритные клетки, то анализ взаимодействия частиц с клетками in vitro проводили на клетках макрофагов мыши RAW264.7. В качестве контроля использовали эпителиальные клетки MiaPaCa-2, Colo-357 и другие. На рисунке 26 приведены гистограммы интенсивности флуоресценции клеток RAW264.7 и Colo-357 до и после гашения ТС.
Все частицы в течение 24 часов показали высокую степень ассоциации с клетками макрофагов. Высокий процент меченых клеток наблюдался в случае с частицами СХ-ГМ-ЛФ (Рисунок 27). Этот эффект может наблюдаться в связи с большей стабильностью частиц СХ-ГМ-ЛФ в культуральной среде, что препятствует формированию крупных агрегатов, а также из-за усиления взаимодействия с клеткой посредством маннозных рецепторов благодаря присутствию в структуре частиц молекул галактоманнана. Однако ассоциация с клетками не всегда приводила к проникновению частиц внутрь клеток.
На клетках макрофагов было показано, что наиболее эффективно внутрь клеток проникают отрицательно заряженные частицы СХ-ЛФ, СХ-ГМ-ЛФ и положительно заряженные частицы СХ-ЛФ-Х. Меньше всего в макрофаги попадало немодифицированных белковых частиц НЧ-ЛФ и гидрофобных частиц СДХ-ЛФ (Рисунок 28). При этом во всех случаях доля частиц оставалась на мембранах макрофагов. Эффективность проникновения внутрь клеток была вычислена по отношению процентов меченых клеток после гашения к проценту меченых клеток до гашения ТС. Наличие хитозана, сукцинилхитозана и галактоманнана в составе частиц способствовало контакту частиц с клетками, что приводило увеличению эффективности прохождения частиц в макрофаги. Наличие гидрофобных заместителей в полимере снижало эффективность захвата частиц. НЧ-ЛФ в отсутствие хитозана менее эффективно захватывались клетками (Рисунок 28).