Содержание к диссертации
Введение
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Регенерация растений из соматических тканей Prunus 9
1.1.1 .Клональное микроразмножение косточковых культур in vitro 9
1.1.1.1. Введение в культуру 9
1.1.1.2. Субкультивирование побегов 11
1.1.1.3. Укоренение побегов 14
1.1.1.4. Перевод растений в нестерильные условия 17
1.1.2. Индукция морфогенеза из изолированных тканей 19
1.1.3. Подбор оптимальных условий регенерации 23
1.1.4. Генетическая стабильность растений, полученных методами
культуры тканей 30
1.2. Агробактериальная трансформация Prunus 34
1.2.1. Agrobacterium - естественные векторы переноса генетической
информации в растения 34
1.2.2. Механизм вирулентности агробактерий 36
1.2.3. Конструирование обезоруженных векторов, промоторы, селективные и репортерные гены 39
1.2.4. Генетическая трансформация Prunus с использованием векторной системы Agrobacterium 42
1.2.5. Регенерация трансгенных растений 48
1.2.5.1. Выбор экспланта 48
1.2.5.2. Действие трансформационного/селекционного стресса наэксплант
1.2.6. Перспективы генетической инженерии в селекции сливы 53
ГЛАВА 2. Цели и задачи исследований 59
ГЛАВА 3. Объекты и методы исследований 60
3.1. Объекты исследований 60
3.2. Культивирование сливы in vitro 65
3.3. Регенерация сливы из листовых и стеблевых эксплантов 68
3.4. Определение чувствительности к антибиотикам листовых тканей 70
3.5. Бактериальные штаммы и плазмиды 71
3.6. Трансформация листовых эксплантов и селекция каллусных клонов 72
3.7. Определение ОШ-активности в трансгенных клетках 74
3.8. Статистическая обработка результатов исследований. 75
ГЛАВА 4. Результаты исследований 76
4.1. Культивирование сливы Т УИГО 76
4.1.1. Введение в культуру 76
4.1.2. Субкультивирование побегов 78
4.1.3. Укоренение микрочеренков и перевод растений в нестерильные условия 83
4.2. Регенерация сливы домашней из стеблевых и листовых эксплантов.. 94
4.2.1. Некоторые особенности морфогенеза в культуре листовых
дисков косточковых 94
4.2.2. Влияние минерального состава'среды на эффективность
регенерации из листовых эксплантов сливы домашей 99
4.2.3. Влияние регуляторов роста растений на индукцию
морфогенеза в культуре листовых тканей сливы домашней .... 102
4.2.4. Влияние вида и концентрации углевода в среде на частоту
регенерации побегов из листовых эксплантов сливы домашней.. 109
4.2.5. Оценка регенерационного потенциала сортов сливы домашней. 112
4.2.6. Изменение морфогенетического потенциала в зависимости от
типа и происхождения экспланта 116
4.2.7. Влияние ориентации эксплантов на среде на каллусообразование
и органогенез в культуре высечек листьев сливы домашней... 121
4.2.8. Сравнение морфогенетического потенциала высечек листьев,
полученных in vivo и in vitro 123
4.3. Чувствительность к антибиотикам листовых тканей сливы 127
4.4.
- Регенерация растений из соматических тканей Prunus
- Цели и задачи исследований
- Бактериальные штаммы и плазмиды
Введение к работе
Плоды косточковых культур, имея высокие пищевые и диетические свойства, занимают важное место в нашем рационе. Однако потребительский спрос на них в последнее время часто оказывается неудовлетворенным по ряду причин, в том числе из-за сильного подмерзания в неблагоприятные зимы, снижения урожайности в связи с распространением ряда опасных грибных и вирусных болезней.
Двадцатый век ознаменовался процессом быстрой смены сортимента косточковых культур. Значительно обогатился и сортимент сливы. Выведенные отечественными селекционерами новые сорта сочетают достаточно высокую зимостойкость с хорошими вкусовыми качествами плодов. Это Ренклод Харитоновой, Этюд, Заречная ранняя (ВНИИГиСПР), Смолинка, Яичная синяя (ВСТИСП), Теньковская синяя, Ренклод Теньковский (Татарский НИИСХ) и другие. Однако они не полностью адаптированы к климатическим условиям средней зоны плодоводства России и для создания на их основе промышленных садов необходима разработка специальных технологий.
Чтобы слива стала промышленной культурой в средней полосе России и в Поволжье, необходимо создание высокоадаптивных сортов, пригодных для интенсивных технологий возделывания, устойчивых к комплексу экстремальных факторов среды, прежде всего, зимостойких и устойчивых к основным болезням (шарка, бактериоз и др.), кроме того, обладающих высокими товарными и вкусовыми качествами. Для решения этих задач возникает настоятельная потребность в использовании новых технологий, позволяющих существенно сократить сроки получения новых форм и преодолеть трудности, связанные с половой несовместимостью при отдаленной гибридизации растений. В основе современных биотехнологических подходов лежат методы культивирования растительных тканей и органов в стерильных условиях.
По мнению Г.В. Еремина (1999), успешное выполнение программы производства плодов косточковых культур возможно, прежде всего, при условии создания системы производства высококачественного посадочного материала, включающего обеззараживание, сертификацию сортов, клональное микроразмножение сортов и клоновых подвоев.
За последние 10-15 лет появилось ряд работ, в которых разрабатываются методы клонального микроразмножения растений рода Prunus. В то же время требуют детального выяснения сортовые особенности сливы домашней на разных этапах культивирования и связанные с ними вопросы повышения коэффициента размножения, укореняемости побегов и эффективности перевода полученных растений в нестерильные условия. Отработка метода клонального микроразмножения ряда районированных и перспективных сортов сливы {Prunus domestica) имеет большое практическое значение. Огромный потенциальный коэффициент размножения растений, культивируемых in vitro, и возможность перехода к производству безвирусного посадочного материала делают данный метод размножения сливы весьма актуальным. Кроме того, стерильные растения, полученные in vitro, являются удобным объектом для дальнейших работ по разработке методов регенерации и генетической трансформации сливы домашней.
Одним из важнейших направлений селекции в настоящее время является генетическая инженерия растений. Методы генетической инженерии позволяют переносить в геном растений, в частности, в плодовые и ягодные культуры, единичные гены, контролирующие ряд хозяйственно-ценных признаков. При этом исключается перенос сопутствующего генетического окружения, что имеет место, например, при отдаленной гибридизации растений и, следовательно, отпадает потребность в длительных возвратных скрещиваниях. Новая технология уже сейчас позволяет решить ряд классических для традиционной селекции проблем. Получены формы плодовых и ягодных растений устойчивые ко многим вирусам (трансформация генами синтеза белков оболочки вирусов, антисмысловых конструкций вирусных РНК, вирусных РНК-зависимых полимераз), грибным и бактериальным патогенам (трансформация генами дефензинов, хи- тиназ, пептидных белков), некоторым вредным насекомым (перенос в растения генов 5-эндотоксинов B.thuringiensis, генов-ингибиторов протеиназ), гербицидам неселективного действия (глифосату, фосфинотрицину, хлорсульфуроно- вым и другим гербицидам). Возможно получить растения с измененным вкусом (ген тауматина II) и с увеличенной продолжительностью хранения плодов (антисмысловые РНК гена полигалактуроназы и ферментов биосинтеза этилена), с повышенной способностью к вегетативному размножению и измененной архитектоникой (ген rolC A.rhizogenes, биосинтеза ауксинов A.tumefaciens под контролем соответствующих промоторов) и многими другими хозяйственно- ценными признаками.
Прошедшие полевые испытания трансгенные сельскохозяйственные растения, устойчивые к экологически безопасным гербицидам, насекомым, вирусам вытесняют исходные аналоги сортов и в некоторых странах (США, Канада) начинают доминировать среди культур, для которых такие трансгенные формы получены. По данным международной службы по применению агробиотехно- логических разработок динамика распространения трансгенных растений следующая: 1996 -2,2; 1997 - 12,1; 1998 - 30-32; 1999 - 40 и 2000 - 44 млн.га. В настоящее время основными трансгенными культурами являются соя, кукуруза, хлопчатник, рапс, картофель. Большая часть трансгенных сельскохозяйственных растений представлена формами, устойчивыми к гербицидам (глифосату, фосфинотрицину, иммидазолинонам) и насекомым (колорадскому жуку, кукурузному пилильщику и др.).
Генетическая трансформация древесных плодовых растений оказалась сложной задачей из-за трудностей регенерации древесных растений in vitro. Тем не менее уже имеются сообщения об успешной трансформации ряда древесных плодовых растений, включая яблоню, грецкий орех, персик, абрикос, сливу, вишню, виноград, цитрусовые, киви, пекан, папайю, кофе и некоторые другие, маркерными и несколькими потенциально полезными генами (см. обзоры Shuerman, Dandekar, 1993; Strittmatter, Wegener, 1993; Oliveira et al., 1996; Кучук, 1997; Левенко, 1998; 2000). Наиболее широко и успешно применяется Agrobacterium - опосредованный метод переноса чужеродных генов в растения. Однако большинство работ по трансформации древесных косточковых плодовых культур выполнено с использованием ювенильного материала зиготиче- ского происхождения или с использованием соматических тканей подвойных форм и межвидовых гибридов, имеющих более высокий по сравнению с сортами морфогенетический потенциал. Применительно к сливе, имеются сообщения об успешной регенерации трансгенных растений после агробактериальной трансформации сегментов гипокотиля сливы маркерными генами nptll и gus (Mante et al., 1991; Scorza et al., 1994; 1995b), геном белка оболочки вируса оспы сливы (PPV) (Scorza et al., 1994) и геном белка оболочки вируса кольцевой пятнистости папайи (PRV) (Scorza et al., 1995b). Получение трансгенных сортов тормозится отсутствием надежных методик, способных обеспечить достаточно высокую частоту регенерации побегов из соматических тканей сливы домашней. В литературе имеются лишь отдельные сообщения об успешной регенерации из листовых тканей некоторых зарубежных сортов Prunus domestica (Cossio, Bassi, 1991; Yancheva, Gercheva, 1993). Решение проблемы получения трансгенных сортов сливы осложняется и тем, что антибиотики, используемые для очистки растительных тканей от Agrobacterium и как селективные маркеры, также существенным образом влияют на регенерационный процесс. Следовательно, необходима детальная работа по разработке методики регенерации целых растений из соматических тканей перспективных сортов сливы домашней.
Протокол воспроизводимой системы регенерации сливы из изолированных соматических тканей требуется для проведения исследований по различным направлениям биотехнологии, включая соматическую гибридизацию, клеточную селекцию, мутагенез гп vitro, генную инженерию. Прогресс, достигнутый в этом направлении, будет способствовать применению методов биотехнологии в селекции сливы, что, в конечном счете, приведет к созданию сортов с качественно новыми признаками, которые трудно или невозможно получить методами классической селекции.
Регенерация растений из соматических тканей Prunus
Необходимым условием нормального развития эксплантов в культуре in vitro является полная стерильность исходного материала. Для освобождения от микроорганизмов (грибов, бактерий, микоплазм) растительный материал подвергают поверхностной стерилизации в растворах галогенсодержащих или ртутьсодержащих препаратов (сулема, диацид, гипохлориты кальция, натрия, калия и т.д.), которые губительно воздействуют на патогенную микрофлору (Street, 1973; 1977; Dixon, 1985; Бутенко, 1999) и промывают стерилизованной дистиллированной водой. При проведении стерилизации происходит сильное повреждение растительных тканей, поэтому рекомендуют применять наименее токсичные вещества, правильно выбирать их концентрацию и в качестве исходного растительного материала брать объекты несколько крупнее, чем экс- планты, которые будут впоследствии из них вычленены (Broome, Zimmerman, 1984). Перед помещением в стерилизующий раствор рекомендуют тщательно промыть эксплант с мылом или обработать этанолом.
Экспозиция в процессе стерилизации также играет существенную роль, и ее влияние может сказаться на последующем развитии экспланта. P.G. Alderson et al. (1987) установили, что при стерилизации в хлорной извести в интервалах времени от 5 до 15 мин. процент зараженных эксплантов снижался с 45 до 5 соответственно. Однако, в то же время, процент витрифицированных эксплантов из числа стерильных возрос от 0 до 75. При дальнейшем субкультивировании наблюдали, что на 33% были подвержены витрификации экспланты P.tenella, выдержанные в стерилизующем растворе 5 мин. и на 81% с экспозицией стерилизации 15 мин.
Несмотря на тщательность стерилизующей обработки, заражение, особенно бактериальное, может выявляться даже после нескольких пассажей, по- видимому, вследствие проникновения микроорганизмов в ткани растений (Franclet, 1979; Jones et al., 1979). Для борьбы с латентной инфекцией некоторые авторы рекомендуют использовать антибиотики и системные фунгициды (Phillips et al., 1981; Young et al., 1984; Cornu, Michel, 1987).
Дополнительной трудностью этого этапа является гибель эксплантов, вызванная интоксикацией продуктами окисления фенолов, которые выделяются на месте среза растительных тканей (Christiansen, Fannesbech, 1975). Для снижения отрицательного воздействия вредных соединений используют антиокси- данты (аскорбиновую или лимонную кислоту, дитиотриэтол, диэтилдитиокар- бамат, глютатион, поливинилпирролидон) или проводят ряд последовательных пересадок на новые среды (Высоцкий, 1989; Бутенко, 1999).
В качестве начальных эксплантов при клональном микроразмножении большинства древесных культур, в том числе сливы, обычно используют одно- глазковые черенки, меристематические участки апикальных и латеральных почек. Собственно апикальную меристему - конус активно делящихся клеток высотой около 0,1 мм трудно отделить без повреждения и индуцировать к росту. Поэтому, вместе с ней изолируют первые листовые примордии. Литературные данные свидетельствуют о том, что наиболее удобны для работы экспланты размером от 0,2 до 2 см (Jones, Hopgood, 1979; Rosati et al., 1980; Zimmerman, 1980; Broome, Zimmerman, 1984; Baleriolo-Lucas, Mullins, 1984). Использование очень маленьких участков верхушечных меристематических тканей в пределах 0,1-0,3 мм позволяет освободить культивируемое растение от ряда вирусов, в частности, от таких, как хлоротическая и некротическая пятнистости, карликовость сливы и других. При этом для большой эффективности оздоровления обычно используют дополнительные приемы, такие как термотерапия и хемотерапия. Исчерпывающие сведения по получению безвирусных плодовых и ягодных растений даны в обзорах (Quak, 1977; Walkry, 1978; 1980).
При эффективно проведенной стерилизации дальнейшее развитие экс- планта будет определяться, прежде всего, составом питательной среды, призванной обеспечить растительные ткани всеми необходимыми для жизни компонентами (минеральные соли, углеводы, гормоны и т.д.), и физическими условиями культивирования (pH среды, температура, фотопериод, качество и интенсивность освещения, аэрация).
Детальные сведения по подбору сред и основные принципы методик культуры тканей травянистых и древесных растений можно найти в специализированных руководствах и обзорах (Street, 1977; Калинин и др., 1980; Hussey, 1980; Thorpe, 1981; Conger, 1981; Dixon, 1985; Бутенко, 1999).
Цели и задачи исследований
Введение в культуру, стерилизация растительного материала. Заготовку растительного материала, в виде однолетних побегов, проводили в январе-феврале, после заморозков с понижением температуры до -22-27С. Использовали взрослые здоровые деревья, растущие в открытом грунте (коллекция ВНИИГиСПР им. И.В.Мичурина, г.Мичуринск).
Для введения в культуру in vitro отбирали побеги без видимых признаков повреждения биотическими или абиотическими факторами. В качестве начального экспланта были взяты:
1) Черенки длиной 0,7-1,3 см с латеральными или апикальными почками в состоянии покоя;
2) Меристематические верхушки размером 0,2-0,4 см изолированные из латеральных или апикальных почек, распустившихся в условиях культуральной.
Для поверхностной стерилизации использовали 0,15-0,3% раствор нитрата ртути. В первом варианте опыта перед стерилизацией черенки длиной 15-30 см отмывали водой со стиральным порошком (без биодобавок), после чего тщательно промывали проточной водой. Концы отрезков запаивали парафином, чтобы избежать попадания стерилизующего агента в проводящие ткани и интоксикации эксплантов. Подготовленные побеги помещали на 30 мин. в 0,3% раствор нитрата ртути, в который добавляли несколько капель тритона Х-100 ("Serva", Германия) в качестве детергента. Добавление детергента способствовало лучшему распределению стерилизующего агента по поверхности тканей и, следовательно, предотвращению выживания микроорганизмов. Затем побеги отмывали стерильной дистиллированной водой (3 раза по 5 минут). Стерильные побеги асептически нарезали на черенки длиной 0,7-1,3 см таким образом, чтобы каждый эксплант содержал почку. Экспланты по одному высаживали в пробирки с 10 мл среды введения.
Во втором варианте опыта проросшие почки очищали от жестких кроющих чешуек и распустившихся листьев, затем промывали 20-30 минут в растворе стирального порошка (без биодобавок) на качалке. Удаляли порошок, помещая экспланты в проточную воду, и стерилизовали 0,15-0,2% раствором нитрата ртути с добавлением тритона Х-100 в течение 1-1,5 мин. После чего промывали 3 раза стерильной водой. Подготовленные экспланты культивировали в пробирках с 10 мл среды.
Питательные среды. Основой для приготовления питательных сред на всех этапах культивирования сливы служили макро- и микроэлементы среды Мурасиге-Скуга (Murashige, Skoog, 1962), и среды Кворина-Лепорье (Quoirin, Lepoivre, 1977). Минеральную основу питательных сред дополняли мезоинози- толом - 100 мг/л ("Serva", Германия), гидролизатом казеина - 100 мг/л ("Serva", Германия), сахарозой - 30 г/л, агаром - 6-7 г/л (Bacto agar). На этапах введения и микроразмножения сливы использовали регуляторы роста растений : 6- бензиламинопурин (6-БАП) - 1-3 мг/л, гибберелловую кислоту (ГК) - 0,5-2,0 мг/л, а-нафтилуксусную кислоту (НУК) - 0,1-0,3 мг/л или -индолилмасляную кислоту (ИМК) - 0,1-0,3 мг/л и сложный комплекс витаминов, включающий никотиновую кислоту - 2 мг/л, тиамин HCl, биотин, и р-аминобензойную кислоту - по 1 мг/л, пиридоксин HCl, Са-пантотенат - по 0,5 мг/л, рибофлавин, L- тирозин - по 0,1 мг/л, фолиевую кислоту - 0,01 мг/л. Регуляторы роста и витамины фирмы "Serva", Германия.
На этапе укоренения микрочеренков концентрацию макросолей и сахарозы снижали вдвое, питательную среду дополняли пиридоксином HCl - 0,5 мг/л, никотиновой кислотой - 0,5 мг/л, тиамином HCl - 0,4 мг/л и ИМК - 0,2-2,0 мг/л.
pH питательной среды в процессе приготовления устанавливали в пределах 5,6-5,8 с помощью децинормального раствора NaOH. Среды стерилизовали автоклавированием (1 атм., 20 мин.). Витамины и регуляторы роста растений стерилизовали фильтрованием и добавляли после автоклавирования ("Millipore" 0,22 pm, France).
Условия культивирования. Для культивирования сливы на этапах введения и укоренения побегов использовали пробирки диаметром 15 мм с 10 мл агаризованной питательной среды. Субкультивирование побегов осуществляли в широкогорлых круглых и конических колбах емкостью 100, 200, 250и 300 мл с 40, 60, 80 и 100 мл среды соответственно. Укорененные растения доращивали в конических колбах емкостью 200, 250 и 300 мл с 80-100 мл среды. Колбы закрывали тонкой алюминиевой фольгой и герметизировали лентой "Parafilm".
Культивирование растений осуществляли в специально оборудованной культуральной комнате при 16-часовом световом дне с освещенностью 20002500 люкс (люминисцентные лампы Cool white, Groluxe), температуре воздуха 26±2С и влажности воздуха 50-60%. Процесс инициации корней проводили в темноте, при t помещая пробирки с побегами на 7-10 дней в термостат.
Экспланты пассировали на свежую среду с интервалом в 3-4 недели. Побеги, достигшие на среде размножения длины 1,5-2,0 см использовали для укоренения. Укоренившиеся растения переносили на среду того же состава, но без ИМК. Через 2-3 недели молодые листья с этих растений срезали и использовали для опытов по регенерации и генетической трансформации сливы.
Учет результатов. В опытах по клональному микроразмножению сливы учитывали количество инфицированных, погибших и развивающихся эксплан- тов, число вновь образовавшихся почек и побегов, выход побегов длиной 1,5 см, число укоренившихся побегов, число и длину корней на укорененный побег, количество растений, прижившихся в нестерильных условиях.
Коэффициент размножения определяли как отношение общего числа вновь образовавшихся побегов за пассаж к числу эксплантов, образовавших, по крайней мере, один дополнительный побег. Среднее число корней определяли как отношение числа образовавшихся корней к числу побегов, образовавших, по крайней мере, один корень. Средние значения и ошибки выборочной средней определяли для каждой повторности эксперимента отдельно, затем определяли средние значения для всех повторностей эксперимента. На каждый вариант опыта брали по 25-30 эксплантов. Все эксперименты по размножению и укоренению побегов были повторены не менее трех раз.
Бактериальные штаммы и плазмиды
Для генетической трансформации сливы использовали:
Agrobacterium tumefaciens обезоруженный супервирулентный штамм СВЕ 21 (Revenkova et al., 1993) с бинарным вектором рВ1121, который содержит ген неомицинфосфотрансферазы (nptll), обуславливающий устойчивость к канами- цину и ген gus, контролирующий (3-глюкуронидазу (CUS) (Jefferson et al., 1987).
Agrobacterium tumefaciens штамм CBE21, с бинарным вектором pBIBar, содержащим ген nptll и ген фосфинотрицинацетилфосфотрансферазы (bar) из Streptomyces hygroscopious, придающий растениям устойчивость к гербициду фосфинотрицину (Падегимас и др., 1994).
Agrobacterium tumefaciens штамм ЕНА105 (Hood et al., 1993) с бинарным вектором p35SGUS intron, содержащим ген гигромицинфосфотрансферазы (hpt), обуславливающий устойчивость к гигромицину и ген gus, содержащий в кодирующей области растительный интрон (Vancanneyt et al., 1990).
Бактерии культивировали согласно общепринятой методике (Армитидж, 1991).
Культуры бактериальных штаммов хранили замороженными при -70С в витаминной среде Лурия-Бертани (LB) с глицерином, содержащей 50 мг/л ка- намицина, в холодостойких пробирках Nalgene. Отдельные бактериальные колонии наращивали на агаризованной среде LB с селективным антибиотиком (24-48 час.; 28С), используя свежую суспензию агробактерий.
Для получения быстро растущих клеток из находящихся на хранении культур захватывали небольшую порцию бактериальной смеси, ресуспендиро- вали в 5 мл жидкой среды LB с 50 мг /л канамицина, инкубировали при 28С и интенсивной аэрации до 4-5 суток.
Трансформация листовых эксплантов и селекция каллусных клонов
Для трансформации использовали ночную культуру агробактерий. Отбирали по 0,5-1 мл свежей суспензии агробактерий и переносили в колбу с 50 мл жидкой среды ЬВ, содержащей 50 мг/л канамицина. Культуру бактерий наращивали 12-16 часов на качалке при интенсивной аэрации и температуре 28С до плотности 108 клеток/мл. Затем бактериальную суспензию переносили в центрифужные стаканы по 35-40 мл в каждый и осаждали центрифугированием при 6500 об/мин в течение 10 минут. Сливали верхнюю надосадочную часть (среду ЬВ), добавляли жидкую среду Мурасиге-Скуга без фитогормонов, ре- суспендировали осадок агробактерий. Вновь осаждали бактерий центрифугированием и повторяли процедуру промывки агробактерий. Ресуспендированную в жидкой среде суспензию агробактерий, разбавленную до оптической плотности Абоо =0,6, использовали для трансформации.
В качестве эксплантов при трансформации сливы использовали кусочки молодых, полностью развернувшихся листьев, взятых со стерильных растений не позднее 3-4 недель после укоренения. В стерильных условиях листья срезали с растений и нарезали на кусочки размером 5x5-7 мм, делали насечки по жилкам листа. Подготавливали достаточное количество листового материала (до 100 листовых дисков на вариант опыта ). Экспланты до кокультивации с агро- бактериями держали в жидкой среде МБ. В ряде опытов использовали листья тепличных растений или растений открытого грунта, после соответствующей стерилизации.
Листовые диски инкубировали в бактериальной суспензии 30-40 минут, промокали стерильной фильтровальной бумагой и помещали в чашки Петри на среду кокультивации с агробактериями (среда М8 + 2 мг/л ИУК, 30-35 мл на чашку, 15-20 эксплантов) на стерильные фильтры, чтобы избежать чрезмерного зарастания эксплантов агробактериями. Часть листовых дисков использовали Селективные среды для культивирования листовых дисков сливы домашней для постановки неинокулированного контроля. Герметизировали края чашек липкой лентой "Parafilm". Инкубировали в темноте при температуре 2-4 суток в зависимости от скорости роста агробактерий. Регулярно проверяли чашки на бактериальную контаминацию. При появлении видимых бактериальных колоний переносили инокулированные кусочки листьев на селективные среды на основе солей среды MS, содержащие регуляторы роста растений, витамины, селективный антибиотик канамицин (Km) или гигромицин (Hyg) и антибиотик, подавляющий рост агробактерий - цефотаксим (Cef) . Состав используемых сред приведен в таблице 3.
