Введение к работе
Актуальность темы В настоящее время Россия значительно отстает от мировых темпов развития биотехнологии. Производство антибиотиков в нашей стране на основе микробного синтеза стало нерентабельным. Однако фармсубстанции таких антибиотиков, как бензилпенициллин, окситетрациклин, канамицин и эритромицин, имеют высокий спрос на внутреннем рынке, поскольку они с успехом используются для изготовления на их основе лекарственных средств и для трансформации в еще более эффективные полу синтетические антибиотики.
Практическая ценность производных эритромицина стимулировала интерес к новым модификациям молекулы антибиотика. Исходным сырьем служит субстанция эритромицина, получаемая в результате глубинного культивирования штаммов Saccharopolyspora erythraea, с последующим выделением и очисткой. Перспективный рынок сбыта имеют преимущественно быстрорастворимые препараты, содержащие свыше 90% эритромицина А. Поэтому актуальным является повышение эффективности промышленного производства эритромицина А, которое связано с созданием новых высокопродуктивных штаммов-продуцентов и усовершенствованием технологии биосинтеза.
Цель работы - повышение продукции эритромицина А штаммом S. erythraea С-77 за счет снижения интенсивности процессов лизиса мицелия при глубинном культивировании.
Основные задачи
разработать метод оценки состояния культуры при глубинном культивировании на комплексной среде;
на основе высокопродуктивного штамма S. erythraea С-77 получить мутантный штамм с повышенной устойчивостью мицелия к лизису;
исследовать влияние антиоксидантов на лизис мицелия в глубинной культуре;
оценить влияние компонентов питательной среды на литические процессы в культуре S. erythraea С-77;
наметить пути предотвращения лизиса культуры и воздействия на нее неблагоприятных факторов, снижающих биосинтез эритромицинов;
- оптимизировать составы посевной и ферментационной сред с целью
повышения выхода эритромицина А.
Научная новизна
- Разработана оригинальная методика оценки степени лизиса мицелия при
глубинном культивировании S. erythraea С-77 на комплексной
ферментационной среде по концентрации ДНК в нативной жидкости
(супернатанте).
Получен мутант, устойчивый к туникамицину (Tun -2), характеризующийся повышенной устойчивостью мицелия к лизису.
- Показано, что одной из причин лизиса мицелия продуцента эритромицина
в глубинной культуре является негативное воздействие окислительного стресса.
Впервые показано положительное влияние антиоксидантов (цитохром С,
бутилоксианизол, а-токоферол) на рост мицелия S. erythraea и биосинтез
эритромицинов.
- Физиологически обосновано повышение продукции эритромицинов на
средах с преимущественным содержанием липидов в качестве основного
источника углерода.
- Предложен подход к оптимизации ферментационной среды, основанный на
сбалансированности основных источников углерода (углеводов и липидов).
Разработана и экспериментально проверена среда, обеспечивающая повышение
продукции эритромицина А на 40-50 %.
Практическая значимость
- Предложено использовать концентрацию ДНК в нативной жидкости для
оценки лизиса мицелия актиномицетов при глубинном культивировании на
комплексных средах. Этот параметр позволил достоверно оценивать состояние
глубинной культуры S. erythraea при ферментации.
- Получен мутантный штамм S. erythraea Tun -2, характеризующийся повышенной устойчивостью клеточной стенки к механическому воздействию мешалок при культивировании в биореакторах.
- Разработаны новые посевная и ферментационная среды, позволяющие
снизить затраты на компоненты сырья в два раза и увеличить продукцию
эритромицина А на 40-50%.
- Разработан лабораторный регламент оптимизированной технологии
биосинтеза эритромицина, использованный ООО ПКФ «БИГОР» при
подготовке исходных данных для проектирования производства эритромицина-
основания.
- Разработанные методики, штаммы, питательные среды и технология
ферментации могут быть использованы при организации
конкурентноспособного производства эритромицина А в России.
Апробация работы Результаты диссертационной работы докладывались: на 8 и 9-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых: Биотехнология -наука XXI века, Пущино, 2004, 2005 гг.; на Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ, Москва, 2005 г.; на 19-ой Международной конференции молодых ученых по химии и химической технологии, РХТУ им. Д.И. Менделеева, Москва, 2005 г.
Публикации По теме диссертации опубликован 1 патент и 9 печатных работ, из них 2 - статьи в реферируемом журнале, 2 - статьи в сборниках научных трудов РХТУ им. Д.И. Менделеева и МГУИЭ, 5 - тезисы научных конференций.
Структура и объем работы Диссертационная работа включает: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты экспериментов и их обсуждение, выводы, список литературы, приложения. Диссертация изложена на 159 страницах текста, содержит 28 таблиц и 34 рисунка; список литературы включает 240 наименований.
