Введение к работе
Актуальность проблею. В последние десятилетия сфориироиалось и активно сей развивается научное направление, которое связано с исследованием и поиском путей создания соединений, специфически связывавшихся с определенным последовательностями нуклеотидов в геноме, с КОТОРЫМИ зкже взаимодействут-" днк- и РНК-полимеразы. рєпрєссорьі и т. д. (Заседателев А. с "др., 1976. Ж; Иванов с д и др. . 1989. 1991; Ziiraier С.. Wahnert U . 1986 и т. д.). это позволяет, с одной стороны, получить экспрессные и сравнительно простые способы диагностики наследственных, злокачественных, инфекционных заболеваний, радиационных воздействий, на основе анализа патологии с точки зрения изменения содержания и структуры нуклеиновых кислот при различных «топологических состояниях орг.. .изма. с другой стороны, такие соединения могут быть использованы непосредствен в качестве радиопротекторов (Deiuson L. et al.. 1992; Martin R. F.. Denijon L.. 1992). противоопухолевых, антибактериальных, антивирусных препаратов (PJura P. et al., 1967; unson w. n et al.. 1990). подобные соединения такте могут быть использованы в качестве ДНК-тропных зондов, применение которых основано на присоединении специальной метки или маркера, позволякпкго следить - состоя-НІРМ объекта в динамике, без разрушения, в обычных для него условиях, и т. а этим вопросам в отечественной и зарубежной литературе посвяшено достаточно большое количество работ (Ки.хкий Г. А. . Александров С а. 1971; Иванов СД. 1992; Morgan A. R. et-'.. 19Т9; TanaKaSh.. 1990 и т. д. ї.
При использовании в диагностических целях, такие соединения, помимо достаточно высокой специфичности, должны обладать удобными для регистрации свойствами например, способностью Флг. >ресаировать и резко изменять интенсивность своего свечения при взаимодействии с определенными субстратами Так, 1-ак,лино-8-наФталин-сульФонат является меткой на белок (ланович Дх. 1986), бромид этидия - на нуклеиновые кислоты (Le-Ресч J.c Paoiem с. 1966; Morgan A. R, et al.. 19791, ПАРІ -ватт АТ-паді яуклеотидов в ДЖ (Kapur'iinsKi J.. S2er w,. 1979), Hoecbst "гйЪв - на три AT- и одну го-пару нуклеотидов (PJura т.е. et al.. 198Т) ,1 т. д во всех этих случаях происходит многократное возрастание интенсивности Флуоресценции красителей при взаимодействии их с определенной нилгньо. Простота, высокая чувствительность и иэбиратильность
Орнопые сокиаиецм; А - оптическое поглощение; I - интенсивность «луореспенпии; ДВ - длинноволновый; KB - коротковолновый
«лторесцентаи способов индикаши стимулируот попытки поиска принципиально новых лсминесцентных красителей для анализа нуклеиновых кислот (Зеленин А " и др.. 1967; Иванов с А и др.. 198?, 1991; Gausalh В etal.. 1978; Нігопзат, etal., 1994 ит.д).
однако, несмотря на то, что взаимосвязь структуры субстрата и характера взаимодействия в системах подобного класса изучена уже достаточно хорошо. настоянеє время, практически отсутствуют основные положения, позволяй, г достаточш полно объяснить механизмы изменения Флуоресцентных СВОЙСТВ И. ИСХОДЯ ИЗ ЗІОГО. ПРИНЦИПЫ КОН'",РУИРОВаНИЯ
нс^ых флуоресцентных комплексонов ДК с заданными свойствами. 'Так. для большого числа неинтеркаляторов возрастание их ..іуореспентая с А.л связшааг с изменением гтенсивности процессов ротационной диффузии в молекуле днк-лиганда (Заседателев А. с и др.. 1970; KaPUsctosKl J,, SKoczrias в. 1978). Вместе с тек. известны и другие механизмы, иоэво-ляквие объяснить поаьшение свечения подобных соединений (КЗНТОР Ч . пм<ел а, 1984: /йкович дж.. 1906 Добреиов Г. Б. 1969; Сибирпев В С и др.. 1994). однако, взаимоотношения между вшеназванныки механизмами практически не изучены. Кроме того, отсутствует и достаточно теоретически обоснованный метод расчета химической структуры потенциально активных луореспентных меток на нуклеиновые кислот с требуемыми свойства»*, для решения поставлен--. вопросов, в настогтей работе исследо-шлось взаимодействие с нуклеинеччи кислотами ряда как коммерческое, так и вновь синтезированных ДНК-лигамоа
Цел меследованно: комплексная спектральн?" хлрактеристака влияния структуры молекул лигандов яа характер их специфического взажодеис та :: с як. с ведь» сФормули -вать требования для целенаправленного конструирования за новых эФФек. или Флуоресцентных меток на нуклеиновые кислоты.
Задачи исследования
і Провести опенку спектральных и комплексообразущих свойств исследуемых соединений в зависимости от и., химической СТРУКТУРЫ и условий взаимодействия с ДЙ.
е. оценить влияние на свечение потеклиально активных ленинофоров характера их микроокружения и других условий среды
3L Сформулировать адекрятаую модель, объясняишю изне..^ния Флуорес-оентных свойств внедаесвязывакпихся АіК-спе"и4«чньк красителей и. на основании ее. принципы кон труировзкия новых потепсиально активных ФлуороФоров на нуклеинов..' кислоты с заданными свойствами.
Надав новизна полученных результатов. При исследовании взаимо-д«твия с ДНК '.ь.пнесвязывассихся флуоресцентных краотелей в водных средах различного состава впервые ск-лвествлена количественная опенка относил»!' чого вкг'. в него водорооных и иомьл связей Показано, что
наличие электростатаческсй составляадей играет значите...лею роль не только л'.' слабого, но и для сильного, специфичного тала взаимодействия выпеу. данных соединений с ШК.
Впервые предложена модель, г'ьединягаая дзе основные ранее известные п от !Ы, объяснят*5 возможный механизм повышения Флуоресценции плі специфическом чэаимодеистн' с ДНК внеанесвязываювмся красителей по отношенио к. их свечению в родных средах в несвязанном состоянии. Сформулированы условия применимости вьшендзвакных гипотез для прогнозирования повеления азличных типов соединений. В ракках одной из них. донорноакцепторной тотезы. предложен ряд терминальных зяекгроно-до-норкых электрода-акцепторных заместителей, полезньй при объяснении изменения люкпесиентных свойств лигандов ДНК. ИСХОДЯ ИЗ ИХ іиіМИЧеСКОЯ структури Для соединений бисбензк.. ддзольного ряда (гае вероятность протекания процессов внутрь ^пекулярной ротационной диффузии значительно более велика, чем в случае аналогичных им моно-производных) проведена количественная оценка относительных вкладов процессов внутримолекулярного донорно-акцепторного взаимодействия и ротационной диффузии в измене. ,іе их флуоресцентных свойств при связывании < ПОЛИНУК-леотиасм.
Научю-практичесная значимость иссл. .звания и формы внедрения работы. Раэра«5отан и апробирован на исслед* анных в настояпей работе соединениях метод, позволяюшй количественно оценить относительный вклад и^.яых и водородных связей в специфическое взаимодействие в системе лиганд-днк.
Разработан и апробирован на исследованных в настоящей работе соединениях бисбензимидазольного ряда способ опенки относительных вкладов процессов внутримолекулярного донорно-акноиторного взаимодействия и ротационной диффузии р изменение свечения флуоресцентных даешесвязы-вакдахся днк-спешФичныл красителей.
Разработаны и представлены <в виде конкретных текстов модулей, написанных на языке Turbo-bjcal 5.0) программные комплексы для расчета параметров комплексообразования ^следуемых систем лиганд-днк. а также для вывода графических зависимостей (в том числе, с использованием глобг. и»ной кубической сплайн-интерполяши) на экран и печать.
На базе двух основных ранее известных ротацилнно-диффузионноя и до-норно-акцепторнои гипотез. разрае лан алгоритм оценки относительного изменения флуоресцентных свойств внешнесвязывангихся субстрат-спепи-Фичньи красителей, исходя из их химической СТРУКТУРЫ. ПРИ этом, для соединений, в изменении свечения которых домикирушм является механизм внутримолекулярного донорно-акцепторного взаимодействия активных групп, входящих в состав их молекулы, предложен ряд терминальных злектроно-донорньк к электроко-акиепторных заместителей для пелеїлп-
- б -
ременного конструирования новых флуороФоров :'.№ и сформулированы требования по его применение к различный классам соединений. Положешм, внносюсю на запиту.
-
предлагается негод для количественной опенки относительного вклада ионных и водородных связей в образование активно Флуоресцирующего комплекса в системе лигакд-днк.
-
В ранка!' теории внутримолекулярного д..лорно-акцепторного взаимодействия активных групп, входящих в состав исследуемых соединен;::'!. предлагается ряд терминальных электрон, донорных и электроно-акиептор-кых заместителей для оценки спектральных свойств таковых соединении и конструирования новых ФлуороФоров на ДНК с задаг гии свойствами.
-
преллагается способ количественной оценки относительных вкладов процессов внутримолекулярного докорно-акиепторного взаимодействия и роташюнной диффузии в не: яизм изменения Флуоресцентных свойс :j красителей при специфическом связывании их с полинуклеотидок и. на основании полученных данных, модель, обьединяювая две основные ранее известные гипотезы, объясняйте влияние вышеупомянутых процессов на таковой механизм. Формулируются услоі .и применимости для каждой из названных гипотез, их соотношение в рамках единого предлагаемого механизма, г такие подход для оценки относительного изменения флуорєспєнтй».. свойств внедаесвязываишхся "НК-спепиФичных красителей, исходя из их ,-лдаческой структуш
Апробация диссертационного материала, материалы диссертации сыли представлены на Ш всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков. 199!). российской научной конференции 'Создание лекаре-тг иных средств" сносква. 1992) и научно-практической конференции молодых специалистов "Новые мея-инские ісішологш в области лучевой диагностики терапии и интервенционной радиологии" (Санкт-Летербург. 1994).
"^бликации: по теме диссертации опубликовано 4 работ (втом числе, статьи - І, телков в материалах и сбор.сках - 3).
Объем н структура хнесертадеи. Диссертационная работа состоит из введения и з глав; из которых первая пхвятена Обзору литературы: вторая - описание методов, в том числе и вновь разработанных, а также материалов, использованных в проводимых исследования» третья - результатам собственных спектро-лньк исслед. заний Рассматриваемых красителя ь несвязанном состоянии и при взаимодействии сШКв средах различного состава: чевертая - опи шио результатов, полученных при расчете параметров комплексообразовакия ис мелованных красителей, а также сопос-пвления их с гс тветствуиаии спектральными характеристика»''!; пятая -обсуждению полученных данных о меха, домах изменения флуоресцентных свойств исслеаоватіід красителей и применен} - их для формулировки по-
ложения, связывающих химическую структуру внепиесвязывасшился Флуоресцентных дх-спеиифичных красителей с их потенциальными спектральными свойствами, диссертация завершается заключением и выводами. Диссертация, кроме того, имеет приложе^е. где приведены конкретные тексты . прогрс ьв. комплексов, ис"-\пьзованньи для расчета параметров комплек-сообразования и п<~-троения гра хов зависимостей для спектральных и иэмппексообразукших свойств исследованных в настоящей работе соединений; а также обшая совокупность экспериментальных данных по спектральным характеристикам, определенным для исследованных соединении в присутствии ДНК в водные средах различного состава.
Работг изложена на 211 страницах машинописного текста, солекоп1 56 рисунков и 8 тлілий. Библиографический указатель включает 257 работ, в том числе 92 на русском языке.