Введение к работе
Достижения молекулярной генетики, позволяющей целенаправленно нарабатывать ДНК, как носителя генетической информации, открывает новые перспективы в животноводстве и в биомеднцине. Применение метода генной инженерии связаны с надеждами ученых по улучшению качества животноводческой продукции, повышению резистентности к болезням и созданию так называемых "генных форм" или трансгенных животных - биореакторов ценных биологически активных веществ, главным образом для медицины. Основа стратегии использования трансгенных животных как биореакторов состоит во введении в клетки организма генов, которые вызывают у них синтез новых белков, как правило, медицинского назначения.
С молоком трансгенных животных уже получены целый ряд ценных лекарственных веществ: агантитрипсин [Archibald et al., 1990], антитромбин - III [Meade at al. 1997], ИГФ - 1 [Brem et al., 1994], протеин С [Velander et al„ 1992] и биологически активных веществ технологического назначения - химозин (Эрнст и др.1997, Прокофьев М.И. 1999), лактоферин [Kimpenfort et al. 1991].
В задачу наших исследований входило получение двух рекомбинантных белков с молоком трансгенных кроликов грануяоцитарного колониестимулнрующего фактора (ГКСФ) и тканевого плазмин ore иного активатора (ТПА). ГКСФ регулирует продукцию нейтрофилов и их выход в кровь из костного мозга. Препарат широко используется в онкологии для борьбы с нейтропенией у больных, получавших цитостатики по поводу злокачественных опухолевых заболеваний, а также при трансплантации костного мозга. Применение этого препарата позволяет резко уменьшить число опасных для жизни инфекционных осложнений, которые развиваются у больных с нейтропенией. ТПА преобразует неактивный плазминоген в активный плазмин. Этот процесс обычно наблюдается при рассасывании сгустков крови или струпа, образовавшегося в связи с различными формами процесса заживления раны. ТПА используется для рассасывания тромбов у больных в остром периоде инфаркта миокарда после травм с тромбоэмболией легочной артерии, при различных заболеваниях сосудов. Получение этих белков с помощью технологии ре комби нантной ДНК может быть более эффективной формой, а также более дешевой по сравнению с существующими технологиями.
Выбор трансгенного животного определяется, прежде всего,
потребностью планируемого продукта на мировом рынке и сроками,
требуемыми для производства трансгенных животных, чтобы
удовлетворить потребность рынка.
I МОТ .. , .-.jf.'.HO!. я <;.л*. >»; I
В наших экспериментах для получения рекомбннантных белков, ГКСФ и ТПА были выбраны кролики, так как потребность в этих препаратах не высокая, около 500-700 граммов для всей страны, а кратчайшие сроки получения л актирующих кроликов для удовлетворения потребность в этом продукте составляют 15 месяцев, тогда как на крупном рогатом скоте 33-54 месяца.
Целью исследований было создание трансгенных кроликов -продуцентов лекарственных белков и изучение интеграции, наследования и экспрессии гена.
-
Получить трансгенных кроликов путем микроинъекции гена тканевого плазмнногенного активатора (ТПА).
-
Изучить эффективность трансплаотации микроинъецированных зигот геном ТПА, интеграции и наследования гена в первом поколении кроликов.
-
Изучить наследование гена гранулоцитарного колон иестимулирующе го фактора (ГКСФ) в первом поколении кроликов.
-
Изучить экспрессию гена ГКСФ с молоком трансгенных кроликов,
-
Разработать оптимальный режим доения кроликов.
-
Изучить некоторые фенотипические показатели у трансгенных кроликов (рост и развитие, морфологические показатели кровн).
Научная новизна работы состоит в том, что впервые получены трансгенные кролики с геном тканевого плаз миноге иного активатора (ТПА) н транс генные кролики первого поколения с геном гранулоцитарного колон нести мул иру ющего фактора (ГКСФ). Впервые установлен уровень секреции рекомбинантного белка ГКСФ с молоком трансгекных кроликов и выявлены некоторые особенности в динамике его секреции у отдельных трансгенных кроликов.
Практическая значимость работы состоит в создании двух групп трансгенных кроликов, продуцирующих с молоком два ценных лекарственных белка: ТПА, применяемого для рассасывания коронарных тромбов у человека, и ГКСФ, используемого в онкологии после химно и радиотерапии. Разработаны более эффективные режимы сбора молока у трансгенных кроликов, что повысило надой за лактацию примерно в два раза.
Материалы диссертации были представлены на международной научной конференции "ДНК-техно лотом в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных4 (ВИЖ, Дубровицы 2001) и международной научно-практической конференции "Проблемы восстановления и дальнейшего развития клеточного пушного звероводства и кролиководства России" (ГНУ НИИПЗК, пос. Родники 2002). По материалам диссертации опубликовано 5 работ.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ
