Содержание к диссертации
Введение
Глава! Обзор литературы 10
1.1. Полезные бактерии микробиоты животного - продуценты биологически активных веществ 10
1.2. Участие бактерий в химической коммуникации животных 19
Глава 2. Материалы и методы 27
Глава 3. Морфо-функциональный анализ отдельных органови тканей животного как среды обитания симбионтныхмикроорганизмов: разработка подходов к направленному поиску бактерий - продуцентов биологически активныхвеществ 33
3.1. Кожный покров 33
3.1.1. Специфические кожные железы 50
3.2. Слизистые половой системы 88
3.3. Пищеварительный тракт 117
3.3.1. Слепая кишка нежвачных растительноядных животных как специализированный орган, приспособленный для симбионтного расщепления клетчатки 122
Глава4.Мутуалистические взаимодействия микроорганизмов и животного на примере связи между симбионтным пищеварением клетчатки и азотистым обменом веществ у хозяина 141
4.1. пробиотические свойства бактерий рода bacillus 142
4.2. биологическая активность штамма в. subtilis8 z0 150
4.3. реакция животного организма на введение с кормами б. subtilis 8130 177 4.4. селекция штамма б. subtilis 8130 в условиях симбиоза 188
Глава 5. Разработка технологии получения пробиотическои добавки к кормам животных с использованием в. subtilis 8130 196
5.1. Разработка технологической схемы получения препарата пробиоцел 197
5.2. Отработка дозы и способов введения препарата пробиоцел в рацион животных 218
5.3. Влияние пробиотика на продуктивное действие комбикормов с повышенным содержанием клетчатки 224
5.4. Оценка экономической эффективности препарата 237
5.5. Производственная проверка пробиоцела 238
Заключение 246
Выводы 248
Список литературы 250
- Полезные бактерии микробиоты животного - продуценты биологически активных веществ
- Материалы и методы
- Кожный покров
Введение к работе
Симбиоз (от греческого symbiosis - совместная жизнь) - форма совместного существования двух и более организмов разных видов. Часто симбиоз взаимовыгоден для обоих симбионтов (мутуалистический симбиоз), то есть сожительство обоих организмов (симбионтов) взаимовыгодно и возникает в процессе эволюции как одна из форм приспособления к условиям существования. К данному типу симбиоза относится симбиоз между животными (человеком) и непатогенными микроорганизмами, обитающими в отдельных участках тела хозяина (Мошковский, 1946; Догель, 1981).
Животные и населяющие их микробные сообщества представляют собой сложно организованную систему с устойчивой структурой, в которой взаимодействие элементов строго сбалансировано и связано с разграничением функций и их специализацией. В ходе индивидуального развития особи формируются органы и ткани, где имеются доступные для бактерий органические источники питания, поддерживается тепло, влажность. Новорожденные детеныши млекопитающих инфицируются бактериями матери при прохождении через родовые пути (Зинченко, Панин, 2000). У птиц внутри яиц содержится специфический микробиоценоз, включающий лактобактерии, коли-формы (Moats, 1980). А такие формы поведения животных, как облизывание малышей, потирание частями тела в области специфических кожных желез, копрофагия, вылизывание детенышами оральной области родителей и т.п. (Соколов, 2002), обеспечивают передачу потомству кожных бактерий, бактерий ротовой полости, ано-генитальной области и пищеварительного тракта. Таким образом, из поколения в поколение животными передаются друг другу определенные виды микроорганизмов, что служит показателем неразрывного единства организма хозяина и симбионтов.
Общие представления о структурной организации и функционировании позвоночного животного и совокупности микробиоценозов, рассмотренные в данной работе, сводятся к следующему. Современное животное является результатом длительной коэволюции хозяина и прокариот, в результате которой сложились отношения дополнительности компонентов единой системы, сопровождающиеся развитием специализированных органов хозяина, физиолого-биохимической адаптацией микроорганизмов к организму животного
(к конкретным местам обитания), и совершенствованием механизмов взаимодействия всех элементов системы.
Специализированные морфологические структуры хозяина, в которых развиваются приспособленные к таким местам микроорганизмы, представляют собой образования, по сути являющиеся естественными культиваторами -бродильными камерами (Современная микробиология. Прокариоты, 2005). К подобным структурам относятся различные отделы пищеварительной системы (рубец жвачных, преджелудки грызунов и зайцеобразных (Наумова, 1981), толстый отдел кишечника, а также малоизученные с позиций симбиотических взаимодействий протоки и резервуары кожных желез (Ушакова, 1984). Микроорганизмы развиваются на поверхности кожно-волосяного покрова, включая наружный слуховой проход, верхние дыхательные пути, в слизистых выстилках ротовой полости, ано-генитальных областей. Макроорганизм создает необходимые условия для жизнедеятельности микроорганизмов, однако контролирует и ограничивает степень их развития.
Роль микробного сообщества связана с его топографическим расположением, функциональными особенностями мест обитания микроорганизмов, и в общих чертах может быть подразделена на: 1) непосредственное участие в процессах пищеварения, 2) обеспечение хозяина необходимыми продуктами микробного метаболизма, включая витамины, антибиотики, сигнальные молекулы бактериального происхождения, в том числе, летучие вещества, нейропептиды и др., 3) участие в формировании неспецифической защиты организма и его иммунного статуса с момента рождения (Hungate, 1966; Петровская, Марко, 1976; Нейчев, 1977; Стейниер и др., 1979; Lee et all., 1980; Lee, 1985; Brown, Schellinck, 1992; Бабин и др., 1994; Tannock, 1995; Шендеров, 1998; Ковальзон и др., 1994; Крюгер, Ковальзон, 1994; Янковский, 2003).
Известные данные о функциональных взаимодействиях животного и его микробиоты позволяют сделать вывод, что симбиотические связи направлены на поддержание целостности всего организма и обеспечение его нормального функционирования и воспроизводства. Микросимбионты вносят вклад в биотрансформацию компонентов кормов в доступные для хозяина формы источников энергии, углерода, макро- и микроэлементов, синтезируют используемые животным метаболиты, принимают участие в химической
коммуникации животных, в том числе, в синтезе половых феромонов. Открытость системы, создающая возможность развития патогенов, вызывает комплексную защиту, включающую иммунные процессы хозяина и антагонистические свойства симбионтных микроорганизмов.
Несмотря на большой интерес многих исследователей к роли симбионтов, и, казалось бы, многостороннюю изученность данного вопроса, ряд принципиальных моментов, касающихся взаимоотношений микробиота — организм-хозяин, до сих пор остается неясным. Среди них основными являются оценка масштаба той пользы, которую получает макроорганизм от симбиоза, а также выяснение механизмов, управляющих связью хозяина с микроорганизмами (Бабин и др., 1994).
Физиолого-биохимические особенности симбионтных микроорганизмов позволяют использовать их в биотехнологических целях. Исследование мутуалистических взаимодействий хозяина с микроорганизмами может обеспечить целенаправленное выделение штаммов-продуцентов биологически активных веществ, разработку технологии их получения и применения. Таким образом, понимание механизмов симбиотических связей является основой для научного подхода к выделению и практическому применению микросимбионтов.
Настоящая работа основана на исследовании диких животных, обладающих системой органов и тканей, доступных для развития симбионтов, и исходит из положения, что животные являются природным фондом микроорганизмов с разнообразными и уникальными физиолого-биохимическими свойствами (Заварзин, 1987). Эффективное использование таких микроорганизмов зависит от комплексного подхода к изучению симбиотических взаимосвязей животного и бактерий, включающего микробиологические и зоологические (морфологические, этологические, экологические и физиолого-биохимические) исследования хозяина в сочетании с применением достижений современной биотехнологии.
Симбиотические взаимосвязи являются предпосылками для создания с помощью микроорганизмов препаратов, влияющих на животное-реципиент. К таким препаратам можно отнести антибиотики, ферменты, витамины. В число активно развивающихся в последнее время направлений использования симбионтов животных входит разработка пробиотических препаратов.
Пробиотики - живая микробная пищевая добавка, воздействующая на животное путем улучшения его микробного баланса (Fuller, 1992), обменные и иммунные процессы (Тараканов, и др., 2004). Актуальность задачи получения эффективных пробиотиков определяется как потребностями современного индустриального животноводства в стимуляторах роста сельскохозяйственных животных, так и ухудшением экологической, санитарно-эпидемиологической обстановки в мире на фоне тенденции общества к ограничению применения в кормах антибиотиков. В странах ЕС с 2006 года вводится запрет на использование антибиотиков в составе кормов для животных; аналогичный вопрос обсуждается и общественностью России (Ли В., 2003; Миронов А., Малов А., 2004), что ведет к увеличению спроса на пробиотики в качестве альтернативы антибиотиков. Однако теоретические основы создания таких препаратов: источники выделения микроорганизмов с пробиотическими свойствами, обоснованный подбор штаммов, использующихся в препаратах, механизмы их действия, реакция организма на введение пробиотика разработаны в недостаточной степени (Янковский и др., 2004).
Перспективным направлением микробной биотехнологии является разработка пробиотических препаратов кормового назначения. При этом большое внимание уделяется пробиотикам с целлюлолитическими свойствами в связи с проблемами российского кормопроизводства. В последние годы структура фуражного сырья в стране претерпела значительные изменения, которые привели к вынужденному введению в корма трудно перевариваемых и низкокалорийных компонентов (отруби, рожь, овес, ячмень, просо). Большое значение имеет отказ от применения в кормах сельскохозяйственных животных мясо-костной муки и замене ее на белок растительного происхождения (соевую муку, кукурузный глютен), продажные формы которого содержат примеси клетчатки. Это приводит к увеличению доли трудно перевариваемой клетчатки в кормах и ставит задачу повышения ее усвоения, поскольку клетчатка оказывает существенное влияние на использование животными питательных веществ рациона. Накопление растительных отходов, обогащенных клетчаткой (пивная дробина, различные типы шротов, жомов и др.), вызывает попытки их утилизации введением в корма сельскохозяйственных животных, что также вызывает необходимость разработки препаратов, стимулирующих пищеварение клетчатки. Поэтому актуально изучение внутренних цепей
питания растительноядных животных с высокой степенью переваримости клетчатковых волокон, выделение из них целлюлолитических и иных симбионтных бактерий, участвующих в пищеварении, и разработка биотехнологии промышленного получения и применения таких микроорганизмов.
К числу важнейших теоретических и практических вопросов относится обеспечение животных азотом, незаменимыми аминокислотами, витаминами -и соответствующий поиск симбионтов, продуцирующих аминокислоты и витамины, создание генноинженерных модификаций бактерий-продуцентов, например, лизина, разработка способов увеличения переваримости и усвоения белков существующих рационов путем введения ферментов, в том числе, микробного происхождения.
Не меньший интерес представляет химическая коммуникация животных и участие бактерий в этом процессе, с перспективой создания микробных препаратов - стимуляторов размножения животных.
Разрабатываются и другие направления применения микросимбионтов в практических целях, такие, как индикация состояния здоровья хозяина, создание противоопухолевых вакцин, гормональных препаратов - стимуляторов или ингибиторов ряда гормонов.
Микроорганизмы, обладающие специфическими ферментами, расщепляющими различные углеводороды, ароматические вещества и иные токсины, могут использоваться для биодеградации токсических органических соединений в практических целях.
Общий методологический подход к разработке способа применения отдельного симбионтного микроорганизма или микробного ценоза, примененный в настоящей работе, заключается в следующем. Основой является морфо-функциональный анализ отдельных органов и тканей животного как среды обитания симбионтных микроорганизмов, что в сочетании с особенностями физиологии, поведения и экологии хозяина определяет возможное направление использования микросимбионтов. Технология культивирования микросимбионта и целенаправленное получение биологически активных метаболитов основывается на специфике природной экологической ниши данного микроорганизма и возможной его роли в конкретном микробиоценозе и в симбиотической системе. В качестве примера
поиска штамма-продуцента биологически активных веществ и разработки способа его применения в биотехнологических целях использовано направление исследований мутуалистических взаимодействий между микроорганизмами и животным, связанное с изучением полезных бактерий микробиоты с пробиотическими свойствами. Другие направления - индикация состояния здоровья особи, использование для биодеградации токсических веществ и участие симбионтных микроорганизмов в химической коммуникации высших позвоночных - обозначены как перспективные.
Полезные бактерии микробиоты животного - продуценты биологически активных веществ
В течение последних десятилетий в мире резко возрос интерес к симбионтным микроорганизмам и биологически активным препаратам на их основе. Все большее внимание уделяется разработке новых пробиотических добавок для животноводства. Нормальное физиологическое состояние и продуктивность животных в значительной мере зависят от работы пищеварительной системы, состояния микробного биоценоза кишечника, то есть от соотношения в нем непатогенных, условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. Жизнедеятельность макроорганизма и населяющих его микроорганизмов регулируется по принципу обратной связи. Нарушения в видовом составе форм бактериального сообщества или в их количественном соотношении, ведущие к неполноценному функционированию микробной составляющей системы, дестабилизируют организм животного. Дисбаланс в функционировании макроорганизма (стресс, неправильное питание, инфекционный процесс и др.) вызывает изменение состава эндогенного микробиоценоза.
В настоящее время наблюдается увеличение числа заболеваний, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, являющимися по существу, представителями нормального микробиоценоза. Применение антибиотиков не всегда оказывается эффективным, и к тому же вызывает нарушение микробного сообщества, отрицательно сказывается на качестве продукции, нарушая экологическую безопасность, а также способствует формированию штаммов микроорганизмов, устойчивых к действию антибиотиков. Идея целенаправленного изменения состава симбиотической микрофлоры желудочно-кишечного тракта принадлежит И. И. Мечникову. Еще в начале XX века он говорил о том, что причиной многих заболеваний может быть воздействие на ткани организма разнообразных токсинов, продуцируемых микроорганизмами, обитающими на коже и слизистых, в пищеварительном тракте, или попадающими в организм извне. Илья Ильич Мечников явился также основоположником концепции пробиотиков и предложил практическое использование микробных культур-антагонистов для борьбы с болезнетворными бактериями. По его мнению, продолжительность активной жизни людей существенным образом зависит от микробиоты кишечника. Заселение этого биотопа гнилостными бактериями, хронически отравляющими организм хозяина токсичными продуктами гниения белка, такими, как фенол, индол, скатол, сероводород, аммиак и др., ведет к развитию патологических состояний в организме, его преждевременному старению и смерти. Эффективным подходом к сохранению здоровья И.И.Мечников считал заселение кишечника лактобактериями путем использования в пище молока, ферментированного молочнокислыми бактериями Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus, вошедшего в историю как «болгарская простокваша» (Панин и др., 2000).
Материалы и методы
Объектами исследования являлись симбионтные микроорганизмы животных, содержащихся в виварии Института проблем экологи и эволюции им.А.Н.Северцова РАН, на Черноголовской научно-экспериментальной базе и Утришской черноморской морской станции Института, в Московском зоопарке, Приокско-террасном заповеднике, в том числе: большая песчанка Rhombomys opimus (п=15), монгольская песчанка Meriones unguiculatus (n=10), обыкновенная полевка Microtus arvalis (n=10), сирийский хомяк Mesocricetus auratus (n=65), хомячок Кэмпбелла Phodopus campbelli (n=60), африканская цивета Civettictis civeta (n=2), европейская косуля Capreolus capreolus (n=2), кабарга Moschus moschiferus (n=4), северный морской котик Callorhinus ursinus (n=7), дельфины - афалина Tursiops truncatus (n=5), иния Inia geoffrensis (n=2), глухарь Tetrao urogallus (n=2), полуобезьяна малый толстый лори Nycticebus pygmaeus coucang (n=10), зубр Bison bonasus (n=1), бизон Bison bison (n=2). Влияние пробиотика исследовали на курах Megapodius reinward (n=120), содержащихся во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте птицеводства, свиньях Sus scrofa (п=95), крупном рогатом скоте Bos taurus L (n=54) - в экспериментальном хозяйстве «Кленово-Чегодаево» Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства, песце Alopex lagopus (п=34) и американской норке Mustela vison (n=32) - во Всероссийском научно-исследовательском институте пушного звероводства и кролиководства на базе ОАО «Племзавод Родники», служебных собаках Canis familiaris (п=40) пород: немецкая овчарка, лабрадор, ротвейлер Методико-кинологического центра служебного собаководства ВС РФ (табл.1).
Кожный покров
Кожный покров - это полифункциональная система органов. Он образован кожей и различными производными эпидермиса, к которым относятся волосы, иглы, ногти, когти, рога, копыта, и многочисленные кожные железы. В коже располагаются нервные элементы, кровеносные и лимфатические сосуды, мышечные и коллагеновые волокна, а также сальные, потовые (апокриновые и эккриновые) и гепатоидные железы, выделяющие богатые органическими веществами секреты, которые могут являться питательными субстратами для бактерий (Соколов, 1988). Морфологическое строение поверхности кожи удобно для закрепления на ней микроорганизмов вследствие наличия складок, выемок, различных неровностей (рис.2, 3). Картина, представленная на гистологических срезах различных участков кожи муравьеда Tamandua tetradactyla и антилопы Kobus ellipsiprymnus наглядно показывает изрезанный профиль эпидермиса (1), в котором располагаются волосы (3), выходят протоки желез (6).др., 1990, 1991). В таких местах затруднен доступ кислорода, поддерживается тепло, влажность, присутствует большое количество органических веществ: содержимое секрета (белки, липиды, углеводы), отшелушившиеся клетки эпителия - т. е. имеются все условия для развития микроорганизмов (Balakrishnan, Alexander, 1885).
На рис. 4, 5 изображено расположение апокриновых и сальных кожных желез на коже морды рукокрылых. Наружная поверхность кожи имеет бугристый вид за счет образования эпидермальных воронок, в которые выходит на поверхность кожи волос. Полости желез (6) и железистые выводные протоки (7) заполнены секреторной массой. На рис.6 представлена гистологическая картина срезов кожи морды рукокрылых, на которых видны сальная (А) и апокриновая (Б) железы. Развитые апокриновые протоки, как правило, расширяющиеся у поверхности, имеют диаметр от 10 до 70 мкм, длину до 120 мкм. Следовательно, в этих относительно узких и длинных протоках могут располагаться только единичные клетки бактерий, так как морфологические размеры большинства клеток микроорганизмов находятся в интервале 0.5 мкм х 1.0-5.0 мкм (для бациллярных форм). Например, размеры наиболее обычных представителей кожного микробиоценоза - Staphylococcus epidermidis и Propionibacterium acnes составляют, соответственно: диаметр клеток стафилококка 0.5-1.5 мкм; пропионовокислых бактерий - 0.5-0.8 мкм в диаметре и длина 1-5 мкм (Bergey s manual of ...1986). Объем полости сальной железы, исходя из данных морфометрии, может составлять по нашим расчетам в среднем 20-30 мкм3, что также свидетельствует о возможности развития лишь ограниченного количества микросимбионтов в полости сальной железы при отсутствии воспалительного процесса.
