Введение к работе
Актуальность темы. Сахарная свекла (Beta vulgaris L) - важнейшая техническая культура, являющаяся сырьем для производства 35-40% сахара в мире В Российской Федерации это традиционный и основной отечественный источник получения сахара Ежегодно в РФ эту культуру высевают на площади около 1 млн га Однако за последние 15 лет произошло снижение урожайности и, как следствие, уменьшение производства сахара из сахарной свеклы и увеличение использования в качестве сырья импортного сахара-сырца (более 50%) Сложившаяся ситуация объясняется целым рядом экономических и агротехнических причин низкой эффективностью борьбы с патогенными микроорганизмами, сорняками и насекомыми-вредителями, отсутствием сортов и гибридов сахарной свеклы, устойчивых к гербицидам, абиотическим и биотическим стрессам
Основная причина расходов при возделывании сахарной свеклы (более половины всех затрат) - это борьба с сорной растительностью Потери от сорняков в среднем составляют 25-30% урожая и более
Методы генной инженерии позволяют получать растения сахарной свеклы, несущие гетерологичные гены, что может значительно улучшать агротехнические свойства данной культуры
Первые трансгенные растения сахарной свеклы были получены в 1990 году (Lmdsey К, Gallois Р, 1990) Однако создание трансгенных линий до сих пор под силу только крупным международным биотехнологическим компаниям, инвестирующим большие средства в изучение молекулярно-генетических основ данного процесса Существует ряд факторов, ограничивающих эффективность генетической трансформации этой культуры Прежде всего, регенерация и трансформация сахарной свеклы является в значительной степени генотип-зависимым процессом К тому же большинство опубликованных работ по трансформации выполнены на сортах и гибридах иностранной селекции Все сказанное выше показывает необходимость разработки систем регенерации и генетической трансформации сортов и гибридов отечественной селекции с целью создания растений сахарной свеклы, устойчивых к гербицидам
Цели и задачи исследования. Целью наших исследований являлось изучение регенерационной и трансформационной компетентности сортов и линий сахарной свеклы (Beta vulgaris L) отечественной селекции и создание трансгенных растений/линий, экспрессирующих ген bar, определяющий резистентность к гербициду сплошного действия Баста (Либерти) Дальнейшее включение таких растений в селекционный процесс приведет к созданию гербицид-устойчивых сортов и гибридов
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи
Определить для каждого из исследуемых генотипов оптимальную комбинацию ростовых регуляторов и тип эксплантата с целью получения регенерации побегов in vitro с частотой, подходящей для разработки системы генетической трансформации
Оптимизировать параметры проведения агробактериальной трансформации сахарной свеклы, используя для оценки системы транзиентной экспрессии маркерных генов
Разработать методику негативной селекции трансгенных клеток сахарной свеклы in vitro, основанную на устойчивости к фосфинотрицину (действующему веществу гербицида Баста), определяемую экспрессией гена bar
Получить трансгенные растения сахарной свеклы, несущие ген bar, обуславливающий устойчивость к гербициду Баста, и определи гь наличие экспрессии данного гена
Оценить устойчивость полученных трансгенных линий к действию гербицида Баста
Научная новизна. Разработан эффективный способ прямой регенерации побегов из семядольных узлов (достигнутая частота регенерации составила, в зависимости от генотипа, 35-61%) На основе этого способа регенерации разработана оригинальная система генетической трансформации с использованием Agrobacterium tumefaciens
Показано, что наиболее эффективным способом регенерации побегов от vitro для сахарной свеклы является прямое образование побегов из многоклеточных эксплантов При использовании данного способа частота побегообразования составила 35-97% (в зависимости от генотипа и типа экспланта), в то время как при регенерации через каллус 10-17,1%
Разработана эффективная система микроклонального размножения побегов, позволяющая получать более 500 клонов от одного растения сахарной свеклы за 2,5 месяца
Разработана система негативной селекции ш vitro трансгенных клеток, устойчивых к фосфинотрицину, позволяющая избежать возникновения химерных побегов среди первичных трансформантов
Практическая значимость полученных результатов. Полученные трансгенные линии сахарной свеклы российской селекции, устойчивые к гербициду Баста, являются ценным исходным материалом для селекционной работы
Разработанные системы регенерации и трансформации могут быть применены для получения трансгенных растений сахарной свеклы с другими хозяйственно-ценными генами
Разработанный способ микроклонального размножения сахарной свеклы может быть использован для оздоровления растений от вирусов, для сохранения и быстрого размножения ценного исходного материала, для скрининга генотипов сахарной свеклы на устойчивость к биотическим и абиотическим факторам, в качестве источника эксплантатов для генетической трансформации и как способ «расхимеривания» (получения однородных по введенному гену растений после генетической трансформации многоклеточных эксплантов)
Разработанная схема селекционного процесса с трансгенной составляющей представляет практический интерес для современного свекловодства в РФ, поскольку создание трансгенных гибридов сахарной свеклы на основе ЦМС (цитоплазматической мужской стерильности), устойчивых к гербицидам, позволит не только снизить потери урожая и увеличить долю отечественного сырья на российских сахарных заводах, но и минимизировать возможный риск распространения трансгенной пыльцы на другие сорта и линии, а также близкородственные виды
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 2-ой научной конференция Московского общества генетиков и селекционеров «Актуальные проблемы современной генетики» (Москва, 2003), на XVII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико- химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005), на Международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (Москва, 2005), на Четвертом Московском международном конгрессе «БИОТЕХНОЛОГИЯ состояние и перспективы развития» (Москва, 2007)
Публикации По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 2 статьи и патент РФ на изобретение
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и их обсуждение, выводы, список литературы
