Введение к работе
Актуальность проблемы. Современные направления селекции и генетики
сельскохозяйственных культур ориентированы на использование достижений
биотехнологии растений. Среди. биотехнологических методов ускорения
селекционного процесса самым оптимальным и экологический абсолютно
безвредным является, применение > методов гаплоидной технологии. В
частности показано, что отбор по маркерным признакам у гаплоидной
технологии по сравнению с отбором в F4 было в 5-6 раз эффективнее (Howes
et. al., 1998). Существующая гаметоклональная изменчивость наблюдаемая
при применениии гаплоидов не может быть препятствием для использования
гаплоидов в селекции пшеницы (Baenziger et. al., 1991). В настоящее время
есть много экспериментальных примеров подтверждающих эффективность и
применимость гаплоидной биотехнологии в селекции зерновых культур
(Murigneux et. al., 1993). .-
В экологической селекции пшеницы на устойчивость, новые линии и сорта
наряду с устойчивостью к неблагоприятным факторам окружающей среды
(засухоустойчивость, солеустойчивость, устойчивость к болезням и др.)
должны сочетать в себе высокую урожайность и хорошие технологические
качества зерна., Гаплоиды позволяют за короткое время получать из
гибридных популяции гомозиготные, константные линии,' использование
которых в селекционных программах значительно сокращает время
получения новых высокопродуктивных сортов. Гаплоиды являются
уникальным и перспективным объектом для клеточной селекции и
генетической инженерии растений. Установлено, что чужеродные гены
(рекомбинантная ДНК) введенная в растительную клетку, в последующих
репродукциях расщепляются по 'закону Менделя (3:1). Поэтому для
генетической стабилизации трансформантов очень' эффективным и
перспективным , в теоретическом и в практическом плане является
использование гаплоидных клеток (Anapiyayevet. al., 1997). -'
, Для зерновых злаков разработано несколько методов получения гаплоидов
(метод "бульбозум", культура репродуктивных органов) среди которых более
эффективным для . массового получения растений-регенерантов является
метод культуры изолированных пыльников и микроспор. Проблеме культуры
изолированных пыльников и микроспор посвящено множество
экспериментальных работ и обзорных статьей и монографий (Бутенко, 1975,
Хохлов и др., 1976; Шамина, 1981; Суханов, 1983; Дьячук, Дьячук, 1989;
Picard et. al., 1990). . Однако, несмотря на некоторые успехи в настоящее
время этот метод все еще не находит широкого применения в практической
селекции из-за недостаточного развития теоретических разработок, низкого
выхода растений-регенерантов и других факторов. ....-.
Моск. сельско:эз академии
им. К. А. "Гимиояаова
'..jA-SUYt
Цели и задачи исследований. Целью данного исследования являются изучение закономерностей процессов морфогенеза и регенерации растений, разработка и усовершенствование гаплоидной биотехнологии в культуре изолированных микроспор пшеницы Для этого необходимо было решить следующие задачи
-
Выявление путей развития микроспор пшеницы in vitro, приводящих к образованию многоклеточных комплексов (МК), способных формировать эмбриоиды и морфогенные каллусы,
-
Цитоэмбриологические и биохимические исследования закономерностей процессов морфогенеза и регенерации растений из эмбриоидов и каллусных структур,
-
Разработка и усовершенствование гаплоидной биотехнологии в культуре микроспор пшеницы для получения эмбриоидов, морфогенных каллусов и растений-регенерантов из различных преспективных межсортовых, межлинейных, межвидовых и межродовых гибридов пшеницы,
-
Использование усовершенствованной гаплоидной биотехнологии в экологической селекции пшеницы на устойчивость к аботическим и биотическим факторам окружающей среды
-
Создание константных андроклиниых дигаплоидных линий (АДГ) и изучение их хозяйственно-ценных показателей и генетической стабильности
6 Внедрение высокопродуктивных АДГ линий в селекционные
программы по созданию ценных форм и сортов пшеницы, устойчивых к
неблагоприятным факторам среды
Научная новизна и практическая ценность Проведено комплексное физиолого-биохимическое, цитоэмбриологи-ческое и генетическое исследование с одноклеточного уровня микроспор, формирования многоклеточных комлексов по-этапно до организменного уровня дигаплоидных линий, что позволило разработать и усовершенствовать гаплоидную биотехнологию пшеницы В результате цитоэмбриологических исследований развития микроспор в культуре in vitro выявлены осовные пути формирование МК, способных формировать эмбриоиды и морфогенные каллусы - путь А1, путь В1 и путь Е При развитии микроспор по пути Е происходит образование МК путем прямого деления В процессе морфогенеза регенерация растений осуществляется через эмбриоидогенез (первичный, вторичный) и органогенез (геммогенез, гемморизогенез) В качестве биохимических маркеров морфогенеза могут быть использованы ключевые ферменты метаболизма, такие как, а-амилаза, нитратредуктаза, глютаматдегидрогеназа и ферментный комплекс малатдегидрогеназа -глютаматоксалоацетатаминотрансфераза
На основе изучения физиолого-биохимических и цитоэмбриоло-гических особенностей процессов морфогенеза и регенерации растений в куль-rvpe микроспор in vitro разработана и усовершенствована гаплоидная
биотехнология, которая может быть успешно использована в практической
селекции зерновых культур, клеточной селекции и генетической инженерии
растений. Продемонстрированы возможности использования гаплоидной
биотехнологии в экологической селекции пшеницы, на устойчивость к
абиотическим (ржавчинные болезни и септориоз) и биотическим (селекция на
засухоустойчивость) факторам < окружающей среды. Л Для создания
засухоустойчивых АДГ линий использованы гибриды несущие гены RL1 и
RL2, которые контролируют доминантный признак "свернутые листья".
Исследованиями установлено, что введение указанных генов улучшают
водный режим и способствуют повышению засухоустойчивости растений.
Для экологической селекции пшеницы на устойчивость к ржавчинным
(бурая, желтая, стеблевая) болезням и септориозу использован источник гена
Lr 24, который- является эффективным для регионов , Казахстана
возделывающих пшеницу. * -.- ." - „
Разработанная и усовершенствованная гаплоидная биотехнология успешно использована в культуре микроспор сортов и . межсортовых, отдаленных межродовых и межвидовых гибридов ТгШсит ' aestivum, L, Triticum durum, Aegilops cylindrica, Aegilops triaristata, , ТгШсит thimopheevi, Triticum turanicum, Triticum turgidum,Triticum dicoccoides, Triticum militina, Triticum kihara. В . результате использования усовершенствованной гаплоидной биотехнологии созданы более 370 перспективных АДГ. линий из различных гибридов пшеницы., Выделены . ценные номера АДГ линий, которые. по урожайности, устойчивости к. неблагоприятным факторам окружающей среды (засуха, ржавчинные болезни и др.), технологическим характеристикам зерна (содержание белка, клейковины, твердозерность и др.) значительно превосходят контрольные сорта. В результате исследования спектров запасных белков (глиадины, глютенины) в Н1-Н7 репродукциях показана генетическая стабильность и , чистота АДГ линий. Высокопродуктивные АДГ линий г внедрены в селекционный процесс, проходят конкурсное сортоиспытание и могут быть основой создания ценных линий и новых, сортов. Ценные дигаплоидные линии используются в прикладных и фундаментальных исследованиях совместно с КазНИИ земледелия (п. Алмалыбак, Алмати некая обл.), НИСХИ (птт. Гвардейский, Жамбылская обл.), КазГНУ им. Аль-Фараби (г.. Алматы), Институт молекулярной биологии и, биохимии, им. М.А. Айтхожина (г. Алматы), Институт общей генетики РАН (г. Москва),. .: Сельскохозяйственный университет (г. Файсалабад, Пакистан), Международной - организации по улучшению пшеницы и кукурузы CIMMYT (г. Анкара, Турция), Институт исследова-ния пустынь университета им. Бен-Гуриона (г. Седе Бокер, Израиль), Институт биохимии университета им. Г. Гейне (г. Дюссельдорф, Германия) и др.. ,
Теоретические подходы и методические разработки усовершенствованной гаплоидной биотехнологии могут быть использованы и адаптированы и для
других важных сельскохозяйственных культур и видов растений, в клеточной селекции и генетической инженерии растений
Методы исследований и результаты работы включены в "Методические рекомендации по культуре пыльников и изолированных микроспор ячменя и пшеницы» (Кударов и др, 1990), в учебник "Биотехнология растений' (Валиханова, 1997) и используются при чтении спецкурсов 'Биотехнология растений", входящих в программы учебного процесса кафедры физиологии и биохимии растений Биологического факультета КазГНУ им Аль-Фараби, кафедры Биотехнологии Аграрного университета и других высших учебных заведений
Апробация работы. Результаты исследовании и основные положения диссертации докладывались на Международных, Всесоюзных и Республиканских научных конгрессах и конференциях конференциях молодых ученых КазГНУ (Алматы, 1988,1990), МГУ (Москва, 1989), Уфа (1989), Республиканской научно-практической конференции "Повышение продуктивности и устойчивости зерновых культур" (Алматы, Целиноград Алматы, 1988, 1990, 1991, 1999) Всесоюзной конференции по биотехнологии злаковых культур (Алматы, 1988, 1989), Международном симпозиуме по эмбриологии и семенному размножению (Санкт-Петербург, 1990), 1I-IV съезде ВОФР (Минск, 1990, Санкт-Петербург, 1993, Москва, 1999), ! Всесоюзной планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия" (Пущино-на-Оке, 1990), Всесоюзной конференции "Генетические механизмы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды (Новосибирск, 1991), V конференции биохимиков Средней Азии и Казахстана (Ташкент, 1991), II Международной конференции Биология растительных клеток и биотехнология (Алматы, 1993), VII Международном конференции Биология клетки растений in vitro Биотехнология и сохранение генофонда (Москва, 1997), Международной конференции «Состояние и перспективы развития биотехнологии растений» (Алматы, 1997), Международной конференции «Проблемы экологии АПК и охраны окружаюшей среды (Акмола, 1997, Тараз, 1998, Усть-Каменогорск, 2000), Международной научно-технической конференции «Почвозащитная система и зерновое пр-во на Евразийском континенте в XXI в (Акмола, 1998), II Международном конгрессе FESPP (Варна, Болгария, 1998) Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы стрессовых ответов у растений» (Москва, 1998), VI Международной конференции по развитию пустынных земель (Каир, Египет, 1999), Всероссийском симпозиуме по изучению генома и генетической трансформации растений (Иркутск, 1999), Международном симпозиуме по растению и биотехнологии (Тулуза, 2000), 11-ой Международной конференции по анеуплоидии пшеницы (Новосибирск, 2000), VI Международной конференции пшеницы (Будапешт, Венгрия, 2000), Втором Международном Балканском ботаническом конгрессе (Стамбул, Турция, 2000), Международной конференции по биотехнологии
(Степногорск, 2000); Международном семинаре презентации инновационных
научно-технических проектов Биотехнология 2000 (Пущино; 2000); Научных
семинарах кафедры физологии и биохимии растений КазГНУ. им.. Аль-
Фараби, Лаборатории роста и устойчивости Института физиологии, генетики
и биоинженерии растений, Центра биологических исследовании (Сегед,
Венгрия), Биотехнологическом центре Венгрии (Годолло,, > Венгрия),
Лаборатории по-'биотехнологии растений Национального института
биотехнологии и генетической инженерии растений (Файсалабад, Пакистан),
Интитуте . исследования пустынь университета Бен-Гуриона (Седе , Бокер,
Израиль), расширенном семинаре отдела биологии клетки и биотехнологии
Института физиологии растений (Москва, Россия).и кафедры биотехнологии
МСХА им. К.А. Тимирязева (Москва, Россия). . ,
Публикации. Основные положения диссретации отражены в 97 печатных работах опубликованных в отечественных и зарубежных изданиях, включая две монографии и одну заявку на изобретение.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 210 страницах
. машинописного текста. Состоит из введения, основной части, включающей
следующие разделы: обзор литературы, объекты и методы исследования,
результаты исследования - и их обсуждение, заключения, - выводов,
рекомендации по использованию полученных результаов и приложения.
Содержит. 23 таблиц, 42 рисунков. Список использован-ных. источников
содержит 373 ссылок, из них 217 на иностранных языках.; .....-. .Y-,