Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 10
1.1 Роль капусты белокочанной в мировом сельском хозяйстве 10
1.2 Основные направления селекции капусты белокочанной 11
1.3 Применение методов биотехнологии в селекции капусты белокочанной (Brassica оleracea L.) 14
1.4 Морфогенез в культуре изолированных органов и тканей растений рода Brassica 32
Глава II. Объект и методы исследований 38
2.1. Условия культивирования изолированных эксплантов in vitro 38
2.2. Цитологические исследования 43
2.3. Получение растительных экстрактов из репродуктивных органов капусты белокочанной
2.4. Биохимические исследования 45
2.5. Статистическая обработка данных 48
ГЛАВА III. Морфогенетический потенциал репродуктивных органов капусты белокочанной (Brassica Oleracea L.) in vitrо 49
3.1 Влияние стадии развития микроспор и расположения бутонов в соцветии на процесс морфогенеза растений капусты белокочанной 49
3.2. Влияние различных методов предобработки соцветий и изолированных эксплантов на морфогенез 50
3.3 Влияние гормонального состава питательной среды на процесс морфогенеза 56
3.4 Влияние растительных экстрактов, полученных из репродуктивных органов, на процесс морфогенеза капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) in vitro 63
3.5 Компетенция пыльников и завязей Brassica oleracea L. к морфогенному развитию in vitro 68
3.6 Цитологическое исследование растений-регенерантов капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) 70
3.7 Адаптация растений-регенерантов капусты белокочанной in vivo 71
ГЛАВА IV. Физиолого-биохимические особенности ратсений-регенерантов капусты белокочанной (Brassica Oleracea L.) 75
4.1. Общее содержание фенольных соединений в листьях растений-регенерантов капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) 75
4.2 Цитотоксический эффект экстрактов капусты белокочанной на линию опухолевых клеток М HeLа 82
Выводы 87
Список литературы
- Применение методов биотехнологии в селекции капусты белокочанной (Brassica оleracea L.)
- Получение растительных экстрактов из репродуктивных органов капусты белокочанной
- Влияние различных методов предобработки соцветий и изолированных эксплантов на морфогенез
- Цитотоксический эффект экстрактов капусты белокочанной на линию опухолевых клеток М HeLа
Введение к работе
Актуальность темы. Капуста белокочанная (Brassica oleracea L.)
является важным источником биологически активных соединений и
питательных веществ таких, как витамины С и Е, растворимые волокна,
ферменты с антиоксидантной активностью (каталаза, супероксид дисмутаза,
пероксидаза и др.), каротиноиды, обладающие противовирусной,
антибактериальной и противораковой активностью. Данная овощная культура также богата ценными метаболитами, которые включают антоцианы, терпены, сульфорафан, кумарины и глюкозинолаты, действующие в качестве модуляторов в защите ДНК от повреждения. Таким образом, мы можем сказать, что потребление капусты белокочанной и других овощей Brassica связано с предотвращением угроз развития хронических заболеваний таких, как болезни Альцгеймера, сахарный диабет, рак, сердечно-сосудистые заболевания и др. (Петрушко Ю.Н. и др., 2003).
В связи со сложившейся обстановкой на мировой арене, вызванной сокращением импорта ряда продовольственных товаров в Россию, приоритетной задачей отечественной селекции является разработка новых, перспективных и усовершенствование имеющихся методов при создании сортов и гетерозисных гибридов сельскохозяйственных культур. Для выведения нового сорта капусты с комплексом хозяйственно-ценных признаков важно иметь разнообразный исходный материал с богатой генетической основой. Сочетание традиционных и биотехнологических методов селекции является эффективным в создании новых сортов с одновременным повышением продуктивности и устойчивости растений к абиотическим и биотическим стрессам.
Таким образом, для эффективного использования генетических ресурсов и реализации морфогенетического потенциала овощных культур, необходимо проведение исследований, направленных на усовершенствование или оптимизацию технологий in vitro и их интеграцию в селекционные схемы создания конкурентоспособных гибридов и сортов овощных культур.
Изучение морфогенеза является одним из важных направлений клеточной и генной инженерии растений, как для фундаментальных, так и прикладных исследований. Особое значение оно приобретает при культивировании репродуктивных органов растений in vitro. Реализация морфогенетического потенциала обуславливается комплексом взаимосвязанных факторов, которые необходимо учитывать при разработке технологий получения растений-
регенерантов в зависимости от их генетических и физиологических особенностей.
Целью наших исследований является разработка регламента получения из репродуктивных органов капусты белокочанной (B. oleracea L.) растений -регенерантов и изучение их физиолого-биохимических особенностей.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
изучить влияние предобработки соцветий различными БАВ и температур на процесс каллусо- и органогенеза;
изучить влияние состава питательных сред на морфогенез репродуктивных органов капусты белокочанной;
изучить влияние растительных экстрактов на основе разных растворителей на частоту каллусо- и органогенеза;
изучить зависимость морфогенеза от типа первичного экспланта (пыльники или завязи) и совместного их культивирования;
провести анализ содержания фенольных соединений в листьях растений-регенерантов капусты белокочанной (B. oleracea L.) разной плоидности;
провести анализ цитотоксического действия экстрактов растений-регенерантов капусты белокочанной (B. oleracea L.) на раковые клетки линии М HeLa.
Научная новизна. Впервые проведены комплексные исследования по
изучению влияния условий культивирования на морфогенетический потенциал
изолированных репродуктивных органов (пыльников и завязей) капусты
белокочанной (Brassica oleracea L.) in vitro. Показано, что для изучаемых селекционных образцов применение ступенчатой предобработки соцветий, включающей выдерживание их в течение 1 суток при низкой положительной температуре (+4-60С) без БАВ, в дальнейшем в течение 2-х суток с использованием раствора Дропп (10 мг/л) и последующее культивирование изолированных пыльников и завязей in vitro при температуре +320С в течение 1 суток, оказало стимулирующее действие на формирование каллусной ткани и морфогенных структур. Установлено, что культивирование изолированных эксплантов на питательной среде, содержащей препарат Дропп в концентрации 0,01 мг/л, НУК - 1,0 мг/л, аспарагин - 500 мг/л, тирозин - 100 мг/л и сахарозу 10 г/л приводит к повышению их морфогенетического потенциала, который составляет 3,42% и 5,54%, в культуре пыльников и завязей соответственно.
Впервые для капусты белокочанной было изучено влияние различных растительных экстрактов, полученных из репродуктивных органов на основе разных растворителей, на морфогенетический потенциал пыльников и завязей. Установлено, что экстракты на основе DMSO в концентрации 1,0 мг/100 мл среды оказывают положительное влияние на процессы морфогенеза in vitro и формирование растений-регенерантов.
Впервые для изучаемых гибридов и инбредных линий было установлено положительное влияние совместного культивирования пыльников и завязей на процессы морфогенеза in vitro. При таком способе жизнеспособность и отзывчивость репродуктивных органов к органогенезу повысилась до 2,36% и к каллусогенезу - 4,8% по сравнению с культивированием пыльников и завязей по отдельности.
Впервые для капусты белокочанной было изучено суммарное содержание растворимых фенольных соединений, а также флаванов и флаванолов в листьях растений-регенерантов, имеющих разный уровень плоидности клеток (n, 2n, 3n, 5n). Экспериментально установлено, что с увеличением уровня плоидности уменьшается синтез фенольных соединений: у растений-регенерантов гаплоидных форм (n) он сохраняется на более высоком уровне по сравнению с диплоидными (2n), что, вероятно, свидетельствует об изменении фенольного метаболизма.
Впервые из растительной биомассы in vitro гаплоидных и диплоидных растений-регенерантов капусты белокочанной получены растительные экстракты, которые оказывают слабое ингибирующее действие (от 10 до 30%) на жизнеспособность клеток линии M HeLa (рак шейки матки человека). Однако наибольший цитотоксический эффект проявляется у экстрактов гаплоидных растений.
Практическая значимость. Разработанный регламент получения растений-регенерантов in vitro из репродуктивных органов может быть применен в исследованиях, направленных на создание гаплоидных растений рода Brassica.
Результаты можно использовать в учебном процессе при чтении лекций и
проведении лабораторно-практических работ по дисциплинам: «Физиология
растений», «Сельскохозяйственная биотехнология», «Прикладная
биотехнология», «Культура тканей и клеток растений» для студентов, обучающихся по направлениям «Агрономия» и «Биотехнология».
Методология и методы диссертационного исследования.
Диссертационная работа выполнена с использованием классических и современных методов культуры клеток и тканей, цитологические, а также биохимические исследования, на современном оборудовании. Подробно методология и методы исследования отражены в разделе «Материалы и методы».
Положения, выносимые на защиту:
1. особенности получения растений-регенерантов капусты белокочанной
(Brassica oleracea L.) из репродуктивных органов in vitro;
2. эффективность применения растительных экстрактов и совместного
культивирования пыльников и завязей на процессы морфогенеза in vitro;
3. особенности содержания фенольных соединений в листьях
миксоплоидных ратсений-регенерантов капусты белокочанной, полученых из
репродуктивных органов in vitro;
4. действие растительных эсктрактов, полученных из листьев гаплоидных
и диплоидных растений-регенерантов капусты белокочанной (Brassica oleracea
L.) in vitro, на раковые клетки линии HeLa (рак шейки матки человека).
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: X Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Казань, 14-18 октября, 2013); 2-м Международном симпозиуме по вторичным метаболитам ISSMET (Москва, 17-22 мая, 2014); Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, посвященная созданию объединенного аграрного вуза в Москве (Москва, 3-4 июня, 2014); 15-ой Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 8 апреля, 2015); IX Международном симпозиуме «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 20-25 апреля, 2015); Международном симпозиуме «Биоразнообразие в Евразии» (SEAB-2015) (Баку, Азербайджан, 9-12 июня, 2015); Международной научной конференции молодых учёных и специалистов, посвящённой 150-летию РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (Москва, 3-4 июня, 2015); Международной научной конференции «Аграрное образование и наука в XXI веке: вызовы и проблемы развития» (Москва, 12 ноября, 2015), Всероссийской научной конференции с международным участием «Растения в условиях глобальных и локальных природно-климатических и антропогенных воздействий» (Петрозаводск, 21-26 сентября, 2015).
Личный вклад автора. Работа является результатом исследований, проведенных лично автором на всех этапах работы: выбор, разработка программы и методов исследований, проведение экспериментов, обработка и анализ полученных данных, подготовка публикаций. Исследования по определению цитотоксичности растительных экстрактов были проведены совместно с кандидатом биологических наук, с сотрудником лаборатории молекулярной биологии Института проблем химической физики РАН А.А. Балакиной.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, общим объемом 2,51 п.л., в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, а также получено положительное решение экспертизы на изобретение «Способ получения растений-регенерантов из репродуктивных органов Brassica oleracea L. in vitro» (заявка № 2015125094/10 (039053)).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, материала и методов исследований,
Применение методов биотехнологии в селекции капусты белокочанной (Brassica оleracea L.)
В настоящее время селекционеры практикуют как традиционные, так и биотехнологические методы создания новых форм, гибридов и сортов растений на основе использования новых или изменённых генетических признаков, нацеленных на отбор новых элитных сортов с улучшенной продуктивностью, адаптивностью к местным условиям, толерантностью к биотическому и абиотическому стрессам и т.д. Многие задачи по улучшению сортов капусты белокочанной не разрешимы классическими методами селекции из-за отсутствия доноров с желаемыми свойствами. Для решения этой проблемы, например, используют метод отдаленной гибридизации. Для растений рода Brassica с помощью данного метода был проведен ряд работ, направленных на повышение урожайности, устойчивости к вредителям и болезням, транспортабельности, а также получение большого разнообразия сортов по срокам созревания и лежкости (Лизгунова Т.В., 1967, 1975). Однако лишь ограниченное число межвидовых и межродовых скрещиваний в семействе Brassicaceae может привести к получению полноценных гибридных растений. Трудности создания отдаленных гибридов обусловлены барьерами несовместимости, которые выражены между растениями разных таксономических групп с момента опыления, а затем проявляются на протяжении всего онтогенеза гибридных растений (Котлярова Е.Б. и др.,2007).
Другим эффективным способом получения гибридных сельскохозяйственных растений является гетерозис, который позволяет получать F1 гибриды, обладающие высоким качеством урожая, фенотипической однородностью, транспортабельностью, скороспелостью и другими качествами.
Изучение особенностей проявления гетерозисного эффекта капусты белокочанной впервые в нашей стране было проведено Е.М. Поповой, Н.В. Белороссовой и Р.Е. Химичем на Грибовской опытной станции (Монахос Г.Ф. и др., 2013). Для получения 100% -го гибридного потомства в 1963 году профессор Тимирязевской академии А.В. Крючков изучал явление самонесовместимости. В результате этого в 1984 году был создан первый четырехлинейный F1 гибрид капусты СБ-3, который в 1991 году был включен в Госреестр.
Работы в этом направлении продолжаются в РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева и по настоящее время. Например, Г.Ф. Монахос с сотрудниками установили, что обработка цветков инбредных линий белокочанной капусты раствором хлорида натрия в концентрации 3,0-3,5% за 20-30 минут до опыления существенно снижает проявление самонесовместимости, тем самым повышая завязываемость семян (Монахос Г.Ф., Абдул Хамид, 2001).
В последнее время большое внимание уделяется практической разработке эффективных методов получения гибридных семян с цитоплазматической мужской стерильностью. У представителей семейства Вrаssicaceae наблюдается более сложное наследование ЦМС, что до недавнего времени отражалось на эффективности ее использования в гетерозисной селекции. Так, фенотипическое проявление мужской стерильности у капустных растений чаще обусловлено взаимодействием цитоплазмы с генами ядра, находящимися в гомозиготном состоянии. Поэтому, в отличие, например, от кукурузы, это требует создания специальных линий - закрепителей стерильности, что усложняет селекционно-семеноводческий процесс. В ряде стран, таких как Голландия, Дания, Бельгия, Франция, Япония и др. успешно проводятся селекционные работы по использованию форм капусты с ЦМС. В России в РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева на Селекционной станции им. Н. Н. Тимофеева создан гибрид среднепоздней капусты Фаворит с использованием метода отдаленной гибридизации при передаче ЦМС из рапса (B. napus) в капусту пекинскую (B. pekinensis) (Монахос Г.Ф., Куленкамп А.Ю., Абдул Хамид, 2000). С развитием биотехнологии, в частности клеточной и генной инженерии, возникла возможность включения этих методов в схему классической селекции, с целью преодоления трудностей, возникающих при оплодотворении, развитии зародыша и формирования новых форм растений, устойчивых к различным факторам абиотической и биотической природы. К таким методам можно отнести: оплодотворение in vitro, культура изолированных зародышей, соматическая гибридизация, создание гаплоидных растений in vitro, проведение клеточной селекции, а также получение трансгенных растений. Преодоление прогамной и постгамной несовместимости. Для преодоления постамной и прогамной несовместимости растений существуют биотехнологические методы, заключающиеся в культивировании изолированных зародышей, завязей и семяпочек, а также оплодотворение в условиях in vitro, что позволяет получать фертильные растения многих важных сельскохозяйственных культур. Эти приемы были хорошо апробированы на озимой пшенице (Барабанова Е.А. и др., 1988), ржи (Першина Л.А.и др., 2003), хлопчатнике (Азизходжаев А., Даминова Д.М., 1988), кукурузе (Прасад М. Сатья и др., 1988), томате (Тодераш Л.Г., 1988), луке (Титова И.В., 1988) и других растениях.
Одним из перспективных методов преодоления прогамной несовместимости является искусственное опыление завязи и семяпочек пыльцой другого растения в контролируемых условиях in vitro. Этот метод применяется в том случае, когда пыльца не способна прорастать на рыльце пестика из-за физиологических (например, разные сроки созревания пыльцы) и морфологических (блокировка роста пыльцевой трубки на разных этапах развития) особенностей растений (Калашникова Е.А., 2012). Возможность оплодотворения в условиях культивирования изолированных семяпочек возрастает при удалении рыльца, столбика и стенок завязи (Першина Л.А., Шумный В.К., 1991). Изучение эффективности использования методов изолированных семяпочек и завязей проводили на гибридах, полученных в скрещиваниях между различными подвидами В. campestris, видами В. oleracea, В. napus, В. juncea и Raphanus sativus. Оказалось, что культивирование семяпочек было предпочтительнее перед культивированием завязей по частоте образования гибридов при использовании В. oleracea в качестве женского компонента скрещивания. При использовании В. oleracea в качестве пыльцевого родителя культивирование семяпочек не привело к лучшим результатам, чем культивирование завязей (Takeshita, 1980). В работе Котляровой Е.Б. (2007) показано, что с помощью культуры семяпочек получены гибриды как в межвидовых скрещиваниях, например, между репой и капустой белокочанной (в качестве отцовской формы) (Diederichsen, Sacristan, 1994), капустой белокочанной (в качестве материнской формы) и репой (Hossain et al., 1988), так и межродовых между сурепицей яровой и репой (Kaneko et al., 1996), капустой белокочанной и сурепицей яровой (Hossain et al., 1990), рогачкой и капустой белокочанной (Sarmah В. К., Sarla, 1998).
Получение растительных экстрактов из репродуктивных органов капусты белокочанной
Для различных видов Brassica изучена зависимость стадии развития микроспор от размера бутона и временного интервала их изоляции. Однако эта зависимость сильно коррелирует с видовыми и сортовыми особенностями представителей данного рода. Именно поэтому процесс массового получения растений-регенерантов для многих видов Brassica сильно затруднён. В связи с этим, для повышения эффективности получения растений-регенерантов, целесообразно включать в работу соцветия, как с главного, так и с боковых побегов, тем самым, увеличивая сроки введения изолированных органов в культуру in vitro.
В ранних исследованиях нами установлено, что изолирование бутонов длинной от 2 до 3 мм, в которых микроспоры находятся в сильно вакуолизированной стадии, является оптимальным первичным эксплантом для получения растений-регенерантов из репродуктивных органов (рис.3).
Соцветия капусты белокочанной Предложенный нами прием был взят за основу при проведении дальнейших исследований с селекционными образцами капусты белокочанной (Brassica oleracea L.). Из литературных источников известно (Тюкавин Г.Б., 2007), что в качестве стимулирующего фактора для повышения эффективности процессов каллусогенеза и органогенеза in vitro используют различные виды предобработки бутонов. Одним из важных факторов, способных вызвать индукцию эмбриогенеза у представителей рода Brassica является применение различных регуляторов роста или биологически активных веществ, а также проводить предобработку эксплантов как низкой положительной, так и высокой температурой.
Обработка низкой положителной температурой (+4-60С) в течение 1 суток без помещения их в раствор БАВ и дальнейшее использование раствора ИУК (20 мг/л) в течение 2-х суток при температуре +4С с последующим культивированием изолированных репродуктивных органов при температуре +320С в течение 1 суток. Кроме того, был апробирован вариант (№ 11), в котором соцветия не подвергались предварительной предобработки, а воздействие высокой положительной температурой (+320С) в течение 1 суток было испытано непосредственно на изолированных пыльниках и завязях, культивируемых в условиях in vitro.
Как следует из таблицы 1 применение различных способов предобработки соцветий привело к повышению частоты морфогенеза по сравнению с контрольным вариантом, где не применялась предобработка. Исключение составили варианты под номерами 1 и 2, в которых формирование морфогенных структур было на уровне контроля. Наилучшие результаты были получены в варианте №9, в котором отмечалось положительное влияние предобработки на процесс морфогенеза в культуре изолированных пыльников и завязей. В данном варианте частота морфогенеза составила 2,22% (в культуре изолированных пыльников) и 3,7% (в культуре изолированных завязей), что почти в 2 и 4, соответственно раза выше, по сравнению с контрольным вариантом. Вероятно, повышение морфогенетического потенциала репродуктивных органов связано с применением ступенчатой предобработки различными температурами и БАВ (Дропп, ИУК) (рис.4).
Как известно, стрессовое воздействие низких положительных температур приводит к нарушению морфогенетических корреляций в развитии репродуктивных органов, вследствие чего происходит нарушение целостности пыльника и завязи как интегрированных систем. Исходя из этого, очевидно, что стрессовое воздействие холодом является индуктором (триггером) морфогенеза в культуре in vitro репродуктивных органов. Дальнейшее их развитие может осуществляться в соответствии с различными путями морфогенеза (эмбриогенез или органогенез - через каллусогенез), что зависит от условий культивирования, и, в первую очередь, от гормонального состава питательной среды (Батыгина Т.Б. и др., 2010).
Как правило, частота морфогенеза репродуктивных органов in vitro для различных генотипов можеть варьировать от 1 до 5%. Низкая компетенция репродуктивных органов к морфогенезу, вероятно, связана с выделением ими гормона этилена, который приводит к снижению или полной потере их морфогенетического потенциала. Поэтому целесообразно проводить предобработку соцветий различными БАВ, которые блокируют синтез этилена и повышают морфогенетический потенциал изолированных репродуктивных органов. К одним из таких веществ относится препарат Дропп, под влиянием которого резко интенсифицируется образование абцизовой кислоты (АБК) в клетках растений (Муромцев Г.С. и др., 1990). Кроме того, АБК оказывает стимулирующее действие на органогенез (побегообразование) и эмбриогенез, а также частично ингибирует процесс каллусообразования (Ралдугина Г.Н. и др., 1994, 1995; Малышенко С. И. и др., 2003). Таким обрзом, применение комплексной предобработки соцветий препаратом Дропп и низкими положительными температурами оказало стимулирующее действие на морфогенетическую активность репродуктивных органов, культивируемых in vitro.
Влияние различных методов предобработки соцветий и изолированных эксплантов на морфогенез
Как следует из представленных на рисунке 21 данных, динамика накопления фенольных соединений одинаковая и не зависит от исследуемых селекционных образцов. Экспериментально нами доказано, что на процесс синтеза этих веществ существенное влияние оказывает уровень плоидности клеток растений – чем выше уровень плидности, тем ниже их синтез. Полученные данные согласуются с результатами других авторов (Загоскина Н.В., Федосеева В.Г., Запрометов М.Н., 1997).
Известно, что в процессе онтогенеза накопление фенольных соединений в клетках растений может меняться (Минаева В.Г., 1978; Запрометов Н.М., 1993). Причем эти изменения могут присходить на уровне одного органа, находящегося при различном ярусном расположении. В своей работе мы изучали сумму растворимых фенольных соединений (СРФС) в листьях 1-ого и 3-его ярусов (рис. 22, 23).
Исследования показали, что у растений-регенерантов капусты белокочанной с плоидностью 3n и 5n эти изменения были существенными. В листьях 3-его яруса СРФС у растений 5n увеличилась на 80%, а у растений 3n - на 35% по сравнению с листьями 1-ого яруса. Для диплоидных и гаплоидных растений существенных изменений в содержании СРФС в листьях 1-ого и 3-его ярусов не было отмечено.
В следующей серии экспериментов было изучено содержание хлорофилла а и b, так как общеизвестно участие фенольных соединений в процессах фотосинтеза и дыхания. Именно фотосинтез связан с синтезом полифенолов, поскольку в хлоропластах происходит образование флавоноидов (Запрометов Н.М., Николаева Т.Н., 2003). Определение содержания хлорофилла а и b показало, что у гаплоидных форм капусты белокочанной уровень этих пигментов был выше, чем у других форм растений, отличающихся по плоидности. Динамика же их накопления как в листьях 1-го яруса, так и в листьях 3-го яруса была не существенна(рис.24).
Рис.24 Содержание хлорофилла а и b (мг/г свежей массы) в листьях 1-го и 3-го яруса в растениях-регенерантах капусты белокочанной (n-5n форм) Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что у гаплоидных форм растений-регенерантов капусты белокочанной, полученных из репродуктивных органов in vitro, синтез фенолных соединений сохраняется на более высоком уровне, что свидетельствует об изменении фенольного метаболизма в растениях. Вероятно, эти изменения могут способствовать формированию новых форм растений, обладающих устойчивостью к стресовым факторам окружающей среды.
В последние годы химиотерапии уделяют особое внимание как средству блокировки злокачественной трансформации на ранних стадиях заболевания и прогрессирования на более поздних стадиях (Tracy et al., 2003; Blok et al.,1992). Фитотерапия по-прежнему является наиболее распространенным источником первичной медико-санитарной помощи у 65 80 % населения мира, в основном в развивающихся странах. Это связано с лучшей культурной приемлемостью, лучшей совместимостью с человеческим телом и меньшим количеством побочных эффектов. Листья, цветы, стебли, корни, семена, плоды являются составляющими растительных лекарственных средств (Verhoeveven et al., 1997). Именно растения имеют фитохимические компоненты, которые оказывают определенные физиологические действия на организм человека (Zhung, 1994; Johnson, 2005). Наиболее важными из этих компонентов являются алкалоиды, дубильные вещества, флаваноиды и фенольные соединения (Musk and Johnson, 1993). Ареалом происхождения Растений рода Brassica являются Западная Европа, Средиземноморье и умеренные области Азии. В дополнение к культивируемым видам, которые выращиваются по всему миру, многие из диких видов растут как сорняки, особенно в Северной и Южной Америке, Австралии. Растения этого рода являются самыми главными представителями семейства Brassicaceae. Некоторые виды и типы крестоцветных являются важными масличными, овощными и кормовыми культурами, а также культурами, которые используются в производстве приправ, таких как горчица. Виды Brassica находят широкое применение в кухне многих стран и признаны в качестве ценного источника пищевых волокон, витаминов и минералов (Yu et al., 2013). Они содержат мало жира и большое количество фитохимических веществ, некоторые из которых защищают от канцерогенеза. Следовательно, крестоцветные, как полагают, могут быть полезными в профилактике лечения раковых заболеваний (Zhang et al., 1992; Huang et al., 1994; Cohen et al., 2000).
Капуста белокочанная (Brassica oleracea L.) - двулетнее растение семейства Brassicaceae, распространенная во всех странах мира с умеренным климатом. Эта культура хорошо известна в народной медицине. Ее применяют при лечении таких заболеваний, как язвенные болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, воспалительных процессов слизистых покровов, а также рака желудка и кишечника. Экстракты капусты белокочанной проявляют цитотоксическую активность по отношению к раковым клеткам in vitro, что предположительно обусловлено действием цитотоксических метаболитов растения(Yokata, 2000).
Исходя из выше сказанного, нами был проведен эксперимент с целью изучения цитотоксического действия экстрактов гаплоидных и диплоидных растений капусты белокочанной против линии раковых клеток М HeLa. Изучали действие экстракта в концентрации 50 мкл/мл и 500 мкл/мл на селекционном образце 11-30 (ВНИИССОК) (рис.25).
Установлено, что высокие концентрации растительных экстрактов гаплоидных растений приводили к гибели раковых клеток в 28,7% случаев, в то время как экстракты диплоидных растений - 10,04 % случаев. При низких концентрациях (50 мкл/мл) цитотоксический эффект был слабо выражен. Поэтому в следующей серии эксперимента нами было изучено действие экстракта только в концентрации 500 мкл/мл на других селекционных образцах (рис. 26).Таким образом, в гаплоидных растениях сохраняется присущая диплоидным растениям цитотоксическая активность.
Уменьшение роста клеток может быть связано с влиянием какого-либо соединения, особенно таких, как изотиоцианаты - сульфорафан, эруцин (4 метилсульфинил-3-бутенил), которые связаны с индукцией II фазы детоксикации ферментов (монофункциональные индукторы), играющие важную роль в детоксикации канцерогенов (Prestera and Talalay, 1995; Yokata, 2000; Talalay et al., 2007). Также сульфорафан участвует в ингибировании пролиферации опухолевых клеток, индукции апоптоза, защиты от повреждений ДНК, вызванных различными ксенобиотиками (Fahey et al., 2002). Эруцин (4 метилсульфинил-3-бутенил), который является аналогом сульфорафана, также представляет интерес для исследователей в области здравоохранения (Yoshizawa et al., 2005). Именно он участвует в остановке клеточного цикла на клетках Т-лейкемии Jurkat и в будущем может служить в качестве химиопрофилактического агента (Hwang and Bowen, 2007). Эти изотиоцианаты уменьшают риск развития различных видов рака, таких как рак молочной железы, рак желудка и рак кожи (Williamson et al., 1996). Многие исследования показали, что некоторые соединения, такие как индолы, естественным образом присутствуют в растениях рода Brassica, и они индуцируют апоптоз в различных типах рака (Ge et al., 1996). Таким образом, нужно отметить, что экстракты растений рода Brassica имеют цитотоксическое действие по отношению к опухолевым клеткам, т.к. содержат соединения, которые ингибируют рост клеток при низких концентрациях.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что у растений-регенерантов капусты белокочанной, полученных из репродуктивных органов in vitro, синтез вторичных соединений сохраняется на более высоком уровне у гаплоидных растений, что, вероятно, и оказывает влияние на цитотоксическую активность их экстрактов.
Цитотоксический эффект экстрактов капусты белокочанной на линию опухолевых клеток М HeLа
Растительные продукты содержат значительное количество биологически активных соединений, которые полезны для здоровья человека, а потребление пищи, богатой именно овощами и фруктами имеет положительные результаты. В последние десятилетия особое внимание уделяется растениям богатых вторичными метаболитами, которые часто называют фитохимическими веществами, среди которых особый интерес представляют вещества с антиоксидантной активностью. Установлено, что овощи семейства Крестоцветные являются хорошим источником природных антиоксидантов, в которых содержится высокий уровень каротиноидов, токоферолов, аскорбиновой кислоты, а также фенольных соединений, выполняющих защитную функцию в организме человека. В этом аспекте растения видов Brassica, пользуются популярностью, а потребление их в пищу постоянно возрастает. Это связано с тем, что данные растения способствуют уменьшению риска возникновения хронических заболеваний, включая сердечно-сосудистые и рак (Podsedek,2007; Jahangir et al., 2009).
Особый интерес у исследователей к культурам Brassica проявляется в связи с тем, что в них содержится комплекс фенольных соединений, содержание которых может быть совершенно разным у разных видов и даже среди культур одного и того же вида. Полифенольный состав различных видов Brassica хорошо описан как с количественной, так и с качественной стороны. Например, Podsedek сделал обстоятельный обзор по фенольным соединениям у различных видов Brassica и обнаружил, что, например, антиоксидантная активность у красной и брюссельской капусты в 2,2-5 раз выше по сравнению с зеленой капустой, горчицей, капустой китайской и капустой белокочанной (Podsedek,2006). Авторы предполагают, что такая высокая антиоксидантная активность данных видов может быть связана с наличием различных антиоксидантных компонентов фенольной природы.
На основе ВЭЖХ были идентифицированы и определены количественные составы основных фенольных соединений у различных видов Brassica (Vallejo et al., 2004; Bahorun et al., 2004; Harbaum et al., 2007; Ferreres et al., 2005; Llorach et al., 2003). Было показано, что овощные культуры Brassica содержат флавоноиды и особенно большое количество флавонолов. Так, например, были найдены гликозиды - кемпферол и кверцетин, их производные в сочетании с гидроксикоричными кислотами, а также производные синаповой кислоты, которые являются наиболее важными представителями фенольных соединений видов Brassica (Vallejo et al., 2002; Martinez-Sanchez et al., 2008; Nielsen et al., 1998). Большинство исследований было проведено на таких культурах как брокколи (Brassica oleracea var. botrytis italica) (Price et al., 1998), капуста белокочанная (Brassica oleracea var. capitata L.) (Chu et al., 2000; Nielsen et al., 1998 ) и кале (Brassica oleracea var. sabellica) (Ferreres et al., 2006). Однако в последнее время интерес в этой области исследований был проявлен и к другим представителям Brassica: B. rapa, B. napus и B. juncea (Fernandes et al., 2007; Francisco et al., 2009;Velasco et al., 2010).
Известно, что биосинтез и концентрация фенольных соединений в растениях зависит от многочисленных факторов окружающей среды (свет, температура, минеральное питание, УФ-излучение и др.), а также от генотипических особенностей исследуемых растений. Кроме того, экспериментально установлено, что эти показатели могут изменяться в процессе онтогенеза, в пределах одного растения и одного органа по ярусам. Например, наглядно это было продемонстрировано на репе (Brassica rapa) (Francisco et al., 2010), капусте пекинской (Brassica pekinensis) (Harbaum et al., 2007) и капусте цветной (Brassica oleracea var. botrytis L.) (Ferreres et al., 2006; Fernandes et al., 2007). С другой стороны, фенольные соединения, присутствующие в растениях рода Brassica, очень чувствительны к способам и режимам хранения продукции, а также к послеуборочной обработке (De Pascale et al., 2007; Gawlik-Dziki, 2011), которые оказывают влияние на конечную концентрацию соединений фенольной природы в тканях растений. Для капусты белокочанной, изучение зависимости синтеза фенольных соединений преимущественно флавановой природы в динамике от условий культивирования мало исследовано. Поэтому работы в этом направлении актуальны и являются важными для разработки технологии рационального использования растительных ресурсов.
Известно, что изменение генома растений сопровождается значительными изменениями в их физиологических и биохимических функциях. Уровень плоидности относится к числу важных цитогенетических характеристик клеток, определяющих физиологические и биохимические особенности растений. В ряде случаев отмечалась прямая взаимосвязь между уровнем плоидности растительных тканей и их способностью к образованию различных классов фенольных соединений (Загоскина Н.В., Федосеева В.Г., Запрометов М.Н., 1997). В свою очередь, уровень накопления фенольных соединений в определенной степени служит «критерием» потенциальной устойчивости растений к стрессовым факторам окружающей среды (Загоскина Н.В., 2005).
В данном эксперименте было изучено накопление соединений фенольной природы (суммы растворимых фенольных соединений, флаванов и флаванолов) в листьях капусты белокочанной в зависимости от уровня плоидности клеток. Экспериментально установлено, что исследуемые в работе растения-регенеранты, полученные из репродуктивных органов in vitro и представляющие собой миксоплоидные культуры, обладают разной способностью к синтезу фенольных соединений. Так, содержание суммы растворимых фенольных соединений в листьях гаплоидных растений капусты белокочанной в 1,3-1,4 раза выше, по сравнению с диплоидными