Введение к работе
; ' < -
Развитие молекулярной биологии, молекулярной генетики и генной инженерии привело к широкому использованию молекулярно-генетических методов в различных областях науки и практики/ в том числе и в животноводстве [Муромцев Г.С. и др. 1990, Эрнст Л.К. и др. 1995). Оки нашли применение в воспроизводстве и селекции сельскохозяйственных животных и становятся незаменимыми для сертификации существующих пород и популяций. Молекулярно-генетичеекие подходы являются неотъемлемой частью программ по получению, анализу и использованию трансгенных сельскохозяйственных животных.
Актуальность темы.. Серьезной проблемой при получении трансгенных , животных является низкая эффективность переноса генов. Исходя из этого, актуальным является поиск методических подходов, способствующих повышению эффективности трансгенеза.
В настоящее время интерес для современной животноводческой науки и практического животноводства представляет получение и использование трансгенных животных, экспрессирующих рекомбинантные белки [Эрнст Л.К. 1997]. Животные-продуценты являются альтернативой ми премиальным и эукаристическим производственным системам, которые характеризуются нарушением или не завершением в ряде случаев некоторых посттрансляционных модификаций [Стронгин А.Я. и др. 1987], большими потерями в конечном выходе и низкой рентабельностью [Гомилии H.S.идр. 1987].
Молочная железа трансгенных животных является идеальным источником синтеза рекомбинантных белков. Она обладает огромным синтетическим потенциалом, так как биологически приспособлена для синтеза и извлечения молочных белков. Кроме того, уже разработаны и внедрены в практику технологии содержания животных в санитарных условиях, что позволит извлекать молоко трансгенных животных без: риска контаминации патогенными микроорганизмами [Брем Г. и др. 1993, Эрнст Л.К и др. 1997]. В этой связи изучение синтеза рекомбинантных белков, с молоком трансгенных животных имеет большое теоретическое и практическое значение.
Возможность: практического' использования молочной железы трзнсгенных животных как источника рекомбинантных белков предусматривает предпочтительное получение женских особей, что предопределяет научный и практический интерес к диагностике пола эмбрионов на предымплантационной стадии. Наиболее актуальным это является длі животййх^іїм'еіДйїи^^Иинньїйі генерационный интервал (КРС, овцы, козы). Кром< UraflB, с^ПРедеде.ниер noja Эмбрионов актуально в
им, К. А, "(имис
fog. № ДГ,
воспроизводстве КРС. Как отмечает Б.Л.Завертяев [1989], получение животных определенного пола является не только биологической, но и практической задачей. Трансллантация - двух однополых эмбрионов позволяет избежать бесплодия -(фримартинизма) тепок, рождающихся в разнополых двойнях. Применение метода, криоконсервироаания эмбрионов делает реальным создание банка эмбрионов с заранее определенным полом от животных с выдающимся генотипом [Эрнст Л.К., Сергеев Н.И. 1969].
Молекулярно-генетические подходы играют важную роль в оценке животных по генотипу. В 1995 году был принят Федеральный Закон 'О племенном-животноводстве', в котором в Ст. 19 говорится о необходимости сертификации всего племенного материала, в том числе и по генотипу. Генотипироеание животных по полиморфным ' вариантам белков позволяет выявлять корреляции ' между, различными аллелями и хозяйственно-полезными признаками и целенаправленно вести селекцию на сохранение желательных аллелей в популяции. На сегодня уже установлены корреляционные связи между полиморфными вариантами белков молока и хозяйственно-полезными- признаками животных [Маринчук Г.Е. 1992, Ehrmann S. et at. 1993\. Молекуля'рно-генетические подходы незаменимы в выявлении ряда рецессивных наследственных заболеваний [Krausstich Н., Веет G. 1997]. Диагностика таких мутаций на уровне ДНК (ДНК-диагностика) сделает возможным не только разделение популяции на носителей и неносителей, ко и обеспечит выявление, а следовательно, и выбраковку скрытых носителей, что позволит избавиться от нежелательного аллеля в популяции за одно поколение. Такая комплексная оценка животных предусматривает выполнение большого числа анализов. В этой связи актуальным является разработка методик, позволяющих эффективно и с наименьшими затратами проводить необходимые исследования.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является разработка и оптимизация молекулярно-генетических методов исследований и их использование для решения проблемных вопросов современного животноводства. Для реализации указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:
оптимизировать технологию получения трансгенных животных а части, касающейся состава микроикьекционного буфера;
разработать новые *г оптимизировать существующие ^ методы для детального, исследования транскрипционных и трансляционных процессов рекомбинантных белков у трансгекных животных с интеграцией кДНК инсулине-
..._.з
подобного фактора роста 1 человека (hlGF-1) и гена лрохимоэина КРС под контролем промотора ast-каэеина (asiCn) КРС;
провести сравнительный анализ уровня экспрессии WGFH у гем и зиготных и
гомозиготных трансгенных кроликов для выявления возможности повышения уровня
экспрессии посредством селекции на гомозиготность;. .
* разработать оптимальную схему активирования лрохимозина КРС в молоке трансгенных кроликов и овец для достижения максимальной активности фермента:
-' разработать новые и оптимизировать существующие методы подготовки
ДНК для анализа посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) из различных
исходных материалов; _
разработать точный,- эффективный и экономичный метод'определения
точковых мутаций ' у сельскохозяйственных животных на основе
аллелеспецифической (АС) ПЦР;
- показать универсальность нового * метода АС-ПЦР на примере точковых
мутаций, обуславливающих злокачественный гипертермический синдром (MHS) у
свиней, варианты к-казеина (кСл) у КРС, синдром лейкоцитарной адгезии у черно-
пестрого скота (BLAD) и варианты р-лактоглобупина (pLG) у овец.
Научная новизна, впервые предложено использование микроинъекционного раствора на основе биологического буфера (синтетическая среда яйцеводов, MSOF) для микроинъекции зигот кроликов и по ряду показателей, таких как выживаемость зигот in vivo, степень трансгенности, общая эффективность переноса генов и др., показаны преимущества MSOF по сравнению со стандартным буфером ТЕ.
Разработана методика, позволяющая использовать молоко трансгенных животных для анализа экспрессии рекомбинантной мРНК.
Изучена на уровне мРНК экспрессия hlGF-1 и лрохимозина КРС в молочной железе кроликов, трансгенных по генным конструкциям a$iCn-h!GF-1 и asiCrv-прохимозин, и оаец, трансгенных по генной конструкции а$іСп~прохимозин, Показана строгая тканевая специфичность экспрессии рекомбинантных мРНК.
При исследовании транскрипции природного лрохимозина в желудке КРС установлено существование альтернативного сплайсинга мРНК лрохимозина. Показана полная идентичность рисунка экспрессии мРНК эндогенного фермента и лрохимозина, синтезируемого трансгенными животными.
4 :
Дана характеристика экспрессии рекомбинантьіх hiGF-1'и прохимозина КРС в: молочной железе трансгенных, кроликов и овец. Выявлено, что большая часть рекомбинэнтных белков присутствует в казеиновой фракции и может быть идентифицирована только после отделения от мицелл казеина. С использованием функциональных тестов показана - биологическая: активность, синтезируемых: с молоком трансгенных животных hlGF-1 и прохимозина КРС. ","'''
На примере КРС показана, возможность диагностики пола, эмбрионов с использованием для анализа единичных блэстомеров, С целью повышения точности г результатов предложено выполнение повторных анализов.
Разработан универсальный метод на основе АС-ПЦР для диагностики точковых мутаций у сельскохозяйственных животных и на, рядет примеров показаны его преимущества перед традиционными методами ПЦР-ПДРФ и стандартного АС-ПЦР,
Практическая' ценность, работы. Даны. практические рекомендации по приготовлению, и использованию для-микроинъекции зигот кроликов буферного раствора MSOF. Показано, что предложенный инъекционный буфер по ряду физиологических показателей -in v/vo./a. также ло показателям эффективности: трансгенеза превосходит стандартный инъекционный буфер ТЕ.
Выявлено наличие в молоке, трансгенных кроликов и овец hlGF-1 и прохимозина:КРС, способных к проявлению своих биологических функций, что делает возможным практическое использование синтезируемых трансгенными животными рекомбинэнтных белков.
Фракционные исследования молока трансгенных животных показали, что большая часть рекомбинэнтных бепков присутствовала в казеиновой фракции (около 60%), что необходимо учитывать при очистке бепков: из молока с тем, чтобы исключить возможные потери в конечном выходе.
Диагностика пола предымплактационных эмбрионов имеет важное практическое^ значение при разведении трансгенных животных-продуцентов биологически активных белков с молоком. Кроме того, диагностика пола эмбрионов, попученных in vitro, позволит пересаживать эмбрионы заранее известного пола и тем самым исключить появпение разнополых двоен.
Предложен универсальный - метод анализа точковых мутаций у сельскохозяйственных животных, позволяющий выполнять диагностику, любых мутаций независимо от вида животных. Метод оптимизирован для анализа MHS у свиней, вариантов кСл у КРС, BLAD у черно-пестрого скота и вариантовриз у овец.
5 .
Основные положения, выносимые на защиту.:
. -. новый подход; в . составе микроинъекционного раствора для- более эффективного получения трансгенмых животных;
траисгенные животные «сак продуценты с мопоком биологически активных белков WGF-1 и прохимозина КРС; ' '
полная идентичность рисунка экспрессии: рекомбинангтных' белков, у трансгенных животных и природных белков;
»* достоверное повышение уровня экспрессии рекомбинантых белков в молоке (на примере hlGF-1) у гомозиготных животных по сравнению с гемизиготными;
- единичные бластомеры" как материал для диагностики пола эмбрионов КРС,
полученных in vitro; ..-'"
* методы подготовки ДНК для исследования' методом ПЦР из наиболее доступных исходных материалов - молока и спермы животных;
' * новый универсальный метод АС-ПЦР как альтернатива метода ПЦР-ПДРФ и стандартного метода АС-ПЦР для диагностики . точкоеых мутаций у сельскохозяйственных животных.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены; 1) на конференции немецкого общества скотоводов'в Геттингене (Германия), 28-29 сентября 1993 г.; 2) на Международной научной конференции «Молекулярная генетика и биотехнология- в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных» в Пушкине, Санкт-Петербург, 25-27 мая 1994 г.; 3) на Международной конференции общества по пересадке эмбрионов в Калгари (Канада), 2-8 января 1995 г.; 4) на заседании немецкого общества по пересадке эмбрионов (AET-d) в Клеве (Германия), 1-2 июня 1995 г.; 5) на конференции Европейской Ассоциации по животноводству в Праге (Чехия), 2-6 сентября 1995 г.; 6) на конференции Немецкого общества скотоводов в Ганновере (Германия), 20-21 сентября 1995 г.; 7) на' 3 Международном: Симпозиуме IBC «Использование трансгенных технологий. для коммерческих разработок» в Сан-Диего (США), 30 ноября-1 декабря 1995 г.; 8) на научно-практической конференции IFA в Тулльне (Австрия), 25 апреля 1996 г.; 9) на It Международной конференции 'Мопекулярно-генетические маркеры животных» в Киеве, 15-17 мая 1996 г.; 10) на Международной конференции, посвященной памяти академика ААБаева, в И6Х, Москва, 20-21 мая 1996 г.; 11) на XXVII международной конференции ISAG, Франция, 21-25 июля 1996 г.; 12) на украинско-австрийском симпозиуме «Сельское хозяйство: наука и практика» вг. Львов (Украина), 22-26 сентября 1996 г.; 13) на международной конференции
"Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии* во ВНИИСХБ, Москва, 30-31 октября 1996 г.; 14) на научно-практической конференции 'Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения', в Быково, Моск. Обл., 16-20 июня 1997 г.; 15) на конференции IBC Траксгены-терапевты' в Вест Пальм Спринг (США). 7 февраля 1997 г.;'16) на VIII конференции-РАН«Новые направления биотехнологии» в г. Москва, 27-29 апреля 1998 Г.; 17) на австрийско-украинском симпозиуме.«Сельское хозяйство: наука и практика» в г. Вена (Австрия), 14-16 сентября 1998 г.
Публикации. Опубликовано 47 работ, а_т.ч. методические рекомендации по использованию метода полимераэной цепной реакции в животноводстве (47 с), публикации в журналах «Биотехнология», «Вестник РАСХН», «Доклады РАН», «Доклады РАСХН», «Онтогенез», .«Сельскохозяйственная, биология», «Успехи современной биопогии», «Animal Biotechnology», «Gene»,„«Reproduction Domestic Animals», «Theriogenology», «Veterinary Records», Сборнике научных трудов РАСХН, материалах российских и зарубежных научных конференций. Переведена на русский язык и дана специальная редакция книги Брема Г., Кройслиха Х„ Штранцикгера. Г. «Экспериментальная генетика в животноводстве».
Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах,