Введение к работе
\.l..Актуальность темы. Главной проблемой в области генетики сельскохозяйственных животных и связанных с ней разделов биотехнологии является установление детерминации биологически важных и хозяйственно-полезных признаков. '
В этой связи, одним, из подходов оценки животных является их' характеристика по генетическим и физиологическим маркерам. Она включает в себя" оценку по группам крови, полиморфным системам, белков, а в последнее время и по молекуяярно-генетическим маркерам {Roychoudhury А.К. HeiM,. 1968; «арзаков Н.с.. 1991.* 1994; Gortarl H.J. де et al.. 1997).
Выявление генотипов животных по ряду аллелей позволяет вести, поиск "генов кандидатов* для локусов количественных признаков сельскохозяйственных животных. Выявление таких генов позволит эф-' Фективно использовать их в качестве маркеров признаков продуктивности, что в конечном счете позволит повысить эффективность веде-;., ния селекционной работы.
Среди целого ряда молекулярно-генетических методов наиболь-" шее распространение для оценки животных по генотипу, вследствие быстроты и точности оценки.. а также использования небольшого количества исходного материала, получил метод полимераэной цепной реакции(ПЦР-анализ). Этот метод позволяет увеличивать в миллионы раз количество копий детектируемого участка ЛНК с помощью фернен-. . та ДНК-поламеразы. что делает возможным его визуализацию. ' .';. Большой интерес для науки и практики представляет исследова-, нив полиморфизма генов белков молока. Уже выявлены закономерные-; связи между вариантами белков молока и хозяйственно-полезными. признаками у крупного рогатого скота. Что касается других видов', животных, то работы в этом направлении ведутся менее;интенсивно. / данная диссертационная работа направлена на создание банка ДНК из крови, разработку экспресс-метода аллелеспецифическои по--лимеразкой цепной реакции (АС-ПЦР) для выявления аллелей р-лак-тоглобулкка и изучения методом электрофореза в полиакриламидном-геле<ШАГ) полиморфизма белков'молока у овец. "-.'.'; ^, * ,;,-'
\.2 Цел>, л. дадачи исследования. Целью работы являлось иссле-
дование различных аород ааецЛФ-яовеиедювакмм в .качестве маркера; гена 0 - лактоглобулкйаАя'"других б*е"лШіВДйш! :а,::
fwiOC!'. . , . (ДОММ4
_ 4--
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1. Создать банк ДНК крови овец породы ромни-нарш, цигайская и синтетической полутонкорунной популяции. 2. Разработать экспресс метод аллелеспешіФической ПЦР для диагностики вариантов р-лактоглобулина, овец. 3. Провести характеристику пород овец по частотам встречаемости различных аллелей и генотипов р-лактоглобулнна и других-белков молока. 4. Выполнить статистические расчеты, о целью выявления корреляционных связей между вариантами р-лактрглобулина и хозяйственно-полезными признаками.
1, Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые в данной'работе предложен метод АС-ПЦР для анализа р-лактоглобулина у овец. Создан банк ДНК от нескольких популяций.овец. Проведен популяционно-генетический анализ 7 локусов белков молока. Выполнен статистический анализ для установления корреляционных связей между генотипами, по р-лактоглобулину и хозяйственно-полезными признаками.
-
Положення, выносимые на зашиту. Создание банка ДНК из крови овец различных пород. Генотипирование (S-лактоглобулина и других белков молока у пород и половозрастных групп овец с использованием методов ДНК-диагностики и гельэлектрофореза.
-
Апробация работа. Материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции ^Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи.кадрового обеспечения", РАМЖ, Быково. 16-20 июня і 1997 г.: на восьмой международной конференции "Новые направления биотехнологии".. Москва, 27-29 апреля, 1998 г.
-
Публикация материалов. *По:материалам.диссертации;опубликовано і научные работы.
-
Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, выводов, практических предложений, ' списка литературы. Материал изложен на .Вл страницах машинописногоТекста. содержит *&? таблиц, /& рисунков. Список литературы включает /$? источника, в томчисле да^на иностранных, языках.
:.';" ' В качестве объекта исследований были выбраны .следующие' поро-; ды полутонкорунных овец: ромни-марш из ГПЗ*'Кбтовский" . Рязанской: -.облает (n^zil). цигайская из Биотехцентра(п»25) и синтетическая
популяция овец из э/х'Кленово-Чегодаево". ВНИИ животноводства (финский ландрас х линкольн х ромни-марш х тексель) (п»160). Исследования были проведены по схеме представленной на рис.1.
і ; і
t Хозяйственно- [-Ч-полезные | I признаки і
і - .і
I Химический |
(анализ молока|
і— . 1
I Гельэлектрофорез (белков молока в ПАГ
( Генотипирование (белков молока
і - 1
Н ПОРОДИ ОВЕЦ Н
—і
і — 1 і— 1 і ' 1
I популяция
L.
I Синтетическая| 1Ромни-марші (Цигайская I
| х , 1 і , 1
і ' ' 1
| Взятие крови и выделение ДНК (
I , , и
, . ,
гЧ ПЦР
анализ Hi
1 j'
(Создание( I банка |
її її ДНК |
(ПДРФ -І ІАС- ПЦРПОднопроби-Р ^
I- ПЦР і <-
I—,—I I
J(рочный ) АС-ПЦР
I статистическая *—(обработка подучен--|ных данных
Гельэлектрофорез продуктов ПЦР
1 :
, 1
і Определение генотипов по p-Lgt
Рис.. 1. общая схема исследования.
Для выделения ДИК из крови использовали два метода: феколь-но-хлороформовый(ВНп-1К,-Stafford D.W., 1976) и солевой экстракции (Miller S.A., 1988). Концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре при длине волны 260 нм, -а для характеристики степени очистки использовали показатель соотношения оптической плотности раствора ДНК при длине волны 260 и 280 HM(Sambrook J. . et al..l989).
С цель» идентификации полимерфизмз гена . р-лактоглойулина овйц применяли: стандартный метод ПЦР-ПДРФ. метод ПЦР-анзлпзз с
.-6-
использованиемаллелеспецифических праймеров(АС-ПЦР), а также модификацию стандартного метода АС-ПЦР-''Slngle tube", предложенную Зиновьевой Н.А. и др.(1996). Для проведения реакций использовали прецизионный программируемый термостат "Cyclo Temp 106". Разделение продуктов амплификация выполняли в 2 агарозном геле.
Полиморфизм белков молока у овец изучали методом электрофореза в полиакриламишом геле при рн 8.6(Иолчиев Б.С. 1993)'.
Процентное содержание хира, белка, лактозы и сухого вещества в молоке овец определяли о помощы) прибора Milko-Skan 203<Дания).
Цифровые материалы обрабатывали общепринятыми методами(Пло-хинский Н.А.,1978) с применением персонального компьютера IBM PC.