Содержание к диссертации
Оглавление 2
Список сокращений , 8
Общая характеристика работы 9
1. Обзор литературы. Невирусный перенос генов в экспериментальной гемотерапии. 19
1 1. Введение. 19
1.2. Перенос ДНК в "голом" виде. 20
1.3. Типы векторов, их достоинства и недостатки. 21
1.4. Механизм генного переноса. 23
1.5. Доставка генетических конструкций в ядро. 26
1.6. Применение в опытах и в практике различных невирусных систем. 27
1.6,1. Характеристика катионных лияосом и их комплексов с ДНК. 27
1.6.2. Основные закономерности при использовании геносом in vivo. 37
1.6.3. Хитозана и их взаимодействие с мембранами. 56
1.6.4. Поли амины. 60
1.6.5. Аминокислоты и белки. 61
1.6.6. Анионные рН-чувствительные полимеры. 64
1.6.7. Полиэтиленгликоль и цикл о декстрины. 65
1.6.8. Полиэтиленимины. 65
1.6.9. Полиуретан. 1.6.10. Полипрониленимины. 66
1.6.11. Наносферы. 69
1.6.12. Конъюгаты. 70
1.6.13. Магнитолипосомы.
1.7. Введение геносом людям. 76
1.8. Заключение.
2. Материалы и методы исследования. 83
2.1. Гидрофобные олигокатионы МОНО-, ДИ- и
2.2.Модифицированный лактозолипид. 83
2.3. Катионные липиды
2.4. Дикатионные липиды ДЕГА. 86
2.5. Глицирризин, а-токофероловый эфир янтарной кислоты и рН-чувствительные липосомы. 86
2.6. Липосомы. 89
2.7. Изучение сродства липосом к клеткам. 90
2.8. Получение тотальной [і4С]-меченой общей ДНК из эукариотических клеток, растущих в культуре. 91
2.9. Получение [14С]-аденозин меченой ДНК 92
2.10. Маркерные генетические конструкции 93
2.10.1. Получение плазмидной ДНК. 93
2.10.2. Очистка плазмидной ДНК с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ). 94
2.10.3. Электрофорез ДНК.
2.11. Приготовление геносом с [14С]-меченой и плазмиднои ДНК. 97
2.12. Физико-химические методы исследования,
2.12.1. УФ-спектры плавления ДНК. 97
2.12.2. Электронная микроскопия. 98
2.12.3. Исследование спектров люминесценции пирена в растворах ДНК при формировании комплексов ДНК - олигокатион.
2.13. Культуры трансформированных эукариотических клеток. 99
2.14. Исследование влияния возможных переносчиков генов и ДНК на компоненты системы комплемента. 100
2.14.1.Тестирование антикомплементарной активности. 101
2.15. Влияние липидов и липосом на рост клеток и на синтез ДНК в
культуре клеток. 102
2.15.1. Препараты ХОЛЕНИМ. 102
2.15.2. Препараты КЛИП и ГЛИКОКЛИП. 103
2.16. Определение активности репортерного гена в трансфицированных клеточных культурах. 103
2.16.1. pCMV-SPORT - [3-Gal. 103
2.16.2. Плазмидная ДНК с геном люциферазы светлячков pCMV-Luc. 105
2.16.3. Тестирование экспрессии гена зеленого флюоресцентного белка (pEGFP-Nl) 105
2.17. Трансфекция с использованием преципитата фосфата кальция ДНК. 107
2.1.8. Культивирование клеток с рН-чувствительными липосомами 107
2.1.9. Животные. 108
2.20. Введение геносом в воротную вену и почечную артерию. 108
2.20.1. Анестезия авертином. 108
2.20.2.В ведение в воротную вену печени. 108
2.20.3.Введение липоплексов в почечную артерию. 110
2.20.4.Введение геносом внутрибрюшинно. 110
2.21. Изучение биораспределения геносом ХОЛЕНИМ в организме мышей с помощью [ %С]-тимидин-меченой ДНК. 111
2.22.Введение комплексов с лактозолипидом и 3-галактозидазным геном. 112
2.23. Тестирование активности чужеродного гена в органах
экспериментальных животных. 112
2.23.1. Спектрофотометрическое определение. 112
2.23.2. Гистохимия. 114
2.24. Статистическая обработка числовых данных и графическое представление
2.25. Методика проведения эксперимента по включению радиоактивной метки в лшгоды и ее выведению из клеток, 115
2.26. Определение фракций липидов в тимусах. 116
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ П7
3. Физико-химические свойства комплексов ходеним с препаратами геномной ДНК. 117
3.1 Спектрофлуориметрия и критическая концентрация мицеллообразования. 117
3.2. Влияние на плавление ДНК. 119
3.3. Размеры и форма геносом. 124
3.4. Спектры кругового дихроизма (КД). 129
3.5. Результаты изучение сродства липосом к клеткам. 132
Проведение экспериментов на клеточных линиях. Безопасность липидных медиаторов и эффективность трансфекции 134
4.1. Влияние препаратов липосом и ХОЛЕНИМ на рост линий эукариотических клеток и на синтез ДНК в клетках.
Исследование цитотоксичности и генотоксичности 135
4.2. Потенциальная цито- и генотоксичность ГЛЙКОКЛИПа, липосом ГЛИКОКЛИП/DOPE и КЛИШФХ, лактозилированного диглицерида 137
4.3. Обсуждение возможности переноса генов с помощью катионных липидов К ЛИШ и КЛИП6 и рН-чувствительных липосом. 141
4.4. Трансфицирование культур эукариотических клеток новыми невирусными системами 142
4.4.1. Перенос функционального гена в клетки PC-12 с помощью препаратов ХОЛЕНИМ. 142
4.4.2. Перенос функциональных генов в клетки эукариот с помощью липосом, содержащих препараты ХОЛЕНИМ и липиды-помощники. 146
4.4.3. Перенос функциональных генов в культуры эукариотических клеток с помощью рН-чувствительных липосом и катионных липидов 149
4.4.4. Перенос и экспрессия генов с помощью нового катион ного гликолипида ГЛИКОКЛИП и гликолипоплекса 150
4.4.5. Перенос гена GFP посредством липосом с ДЕГА. 153
5. Перенос ДНК in vivo и влияние липоплексов на иммунную
систему животных 157
5.1. Влияние новых липидных медиаторов на иммунную систему. 157
5.2. Биораспределение геносом ХОЛЕНИМ, содержащих [14С]-тимидин меченую ДНК, в организме экспериментальных мышей. 1
5.2.1. Внутрибрюшинное введение. 165
5.2.2. Введение комплексов ХОЛЕНИМов с [,4С]-ДНК в воротную вену печени. 166
5.2.3. Введение комплексов ХОЛЕНИМов с [14С]-ДНК в почечную артерию. 172
5.2.4. Перенос [14С]-тимидин меченой ДНК с помощью амфифильных липосом. 173
5.3. Генный перенос in vivo с помощью лактозилированных липосом при введении комплексов в воротную вену печени. 176
5.4. Биораспределение [,4С]-аденозин меченой ДНК. 176
5.5. Генный перенос in vivo плазмиды pCMV-SPORT-p-Gal с помощью ХОЛЕНИМов, 177
5.6. Гистохимическое исследование экспрессии гена бактериальной р-галактозидазы в тканях и клетках мышей при трансфекци in vivo липосомами на основе ХОЛЕНИМОВ и лактозилированных липосом. 179
5.7. Регистрация биораспределения плазмидной ДНК спектрофотометрически. 181
6. Исследование скорости обмена липидов в клетках эукариот. 185
Заключение 186
Выводы 191
Список литературы
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ.
В связи с бурным развитием молекулярной биологии и биотехнологии появляется все больше возможностей по осуществлению задачи генетической коррекции и модификации генома соматических клеток организма. Одним из наиболее перспективных направлений являются работы в новой области - генетической, или генной терапии -для лечения широкого спектра наследственных заболеваний и патологических состояний. Это направление берет свое начало с 1990-х г.г., с работ Френча Андерсена и его сотрудников по генотерапии недостаточности аденозиндезаминазы (Anderson, 1992), Ключевой стадией метода является перенос определенного терапевтического гена в соответствующие ткани и клетки с помощью ряда векторных систем. Самыми эффективными системами переноса генов в целях генотерапии оказались вирусные, однако они имеют ряд серьезных недостатков, среди которых опасность повторных введений комплексов с терапевтическими генами из-за возможности нежелательных иммунных реакций, вплоть до смертельного исхода, и инсерционного мутагенеза (Marshall, 2000; Wu and Burgess, 2004). Поэтому по всему миру ведется активный поиск невирусных медиаторов переноса генов, при использовании которых вместе с лигандами можно было бы достичь адресности и хорошей эффективности трансфекции (Templeton et al., 1997, Hashidaetal., 2001).
В настоящее время известны основные закономерности распределения в организме катионных липидов как медиаторов трансфекции и их выведения из него. Определены оптимальные весовые соотношения между этими липидами и ДНК в комплексах. Обнаружено, что липосомы с высоким содержанием холестерина отличаются повышенной стабильностью, вероятно, благодаря повышению стабильности липидного бислоя, что предохраняет комплексы от распада при адсорбции белками плазмы крови (Bennett et al., 1995; Solodin et al., 1995; Templeton et al., 1997). Однако, ввиду недостаточной эффективности и специфичности известных невирусных переносчиков генов, задача поиска новых липидных систем по-прежнему остается актуальной. Кроме того, почти отсутствуют данные о возможной иммуногенности и токсичности таких систем и характере взаимодействия ДНК и липида в комплексе, влиянии липида на структуру ДНК. Познание закономерностей строения и биораспределения, проверка безопасности таких комплексов, придание им органоснецифичности приведет к созданию веществ, которые позволят осуществить цель генной терапии как части биотехнологии -замену поврежденных генов здоровыми без применения каких-либо дорогостоящих и опасных методов лечения.
ЦЕЛЬ НАСТОЯЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ разработка системы для исследования и тестирования потенциальных невирусных медиаторов трансфекции для направленного транспорта генов в целях безопасной и эффективной генотерапии. В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
1) изучить физико-химические свойства новых медиаторов трансфекции генов и их комплексов с ДНК;
2) оценить безопасность невирусных векторов, исследовав их цитотоксичность и генотоксичность; 3) выявить эффективность препаратов - медиаторов переноса репортерных генов в культуре эукариотических клеток;
4) определить влияние новых векторов на систему комплемента;
5) провести сравнение биораспределения комплексов [UC]-меченой ДНК с медиаторами трансфекции в зависимости от условий их введения животным;
6) доказать возможность переноса функциональных генов с помощью новых векторов in vivo и эффективной трансфекции органов животных;
7) подтвердить правильность выбора фосфатидилхолина и холестерина в качестве липидов-помощников.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Разработана система тестов для характеризацию новых липидных молекул в целях отбора медиаторов для направленного транспорта генов в локальной и системной гемотерапии. Впервые оценены физико-химические свойства липоплексов на основе препаратов ХОЛЕНИМ и ДЕГА. Разработаны новые невирусные системы для переноса генов в культуры клеток in vitro и в ткани экспериментальных животных in vivo: рН-чувствительные липосомы, гидрофобные олигокатионы, гликокатионный липид, лактозилированные липосомы. Показано, что новые липиды и липосомы не влияют на рост эукариотических клеток в культуре и эффективны при переносе функциональных генов в культуры трансформированных клеток на уровне коммерческих препаратов. Обнаружено повышение эффективности трансфекции для липосом на основе гликозилированного катионного липида (ГЛИКОКЛИП) в 1000 раз по сравнению с негликозилированным (КЛИП), что свидетельствует о рецептор-опосредованном механизме трансфекции. Показано, что при внутрибрюшянном введении биораспределение [,4С]-ДНК не зависит от липидного состава липосом, а при внутривенном может определяться природой липида. Впервые при исследовании биораспределения использовалась ДНК не из прокариот, а из эукариот.
Исследовано влияние новых невирусньгх липидных систем и геносом на их основе на компоненты системы комплемента СЗЬ и С4Ь. Показано, что липосомы на основе ДИХОЛЕНИМа и фосфатидилхолина в концентрации, эквивалентной 0,0375 мг/мл иммуноглобулина, не влияют на эти компоненты, а липосомы на основе ДИХОЛЕНИМа и кардиолипина - слабо их активируют. Явление активации системы комплемента, опсонизации липоплексов и их клиренс с участием селезенки, печени и почек может быть использовано для достижения направленного переноса генов в эти органы.
Достигнута эффективная трансфекция in vivo гена бактериальной }-галактозидазы при введении геносом на основе лактозилированного диглицерида и препарата ДИХОЛЕНИМ в воротную вену печени, Гистохимически и спектрофотометрически показана экспрессия этого гена в легких, печени и селезенке.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Предложены новые классы медиаторов переноса генов ХОЛЕНИМы, гликолипиды, дикатионные липиды ДЕГА. Установлены закономерности переноса и экспрессии функциональных генов в зависимости от типа медиатора, липида-помощника, соотношения липид/ДНК, взаимодействия липоплексов с компонентами сыворотки питательной среды и крови. Обнаружено, что введение холестеринового остатка в структуру олигоэтилениминов улучшает характеристики соответствующих липоплексов: увеличивает соотношение гидрофобности/гидрофильности, стабилизирует липоплекс и обеспечивает оптимальное значение критической концентрации мицеллообразования (ККМ). Выявлены закономерности биораспределения геносом в зависимости от их липидного состава и способа введения. Подтверждена способность веществ с глюкозными и лактозными группировками усиливать трансфекцию и придавать ей направленный характер. Определены причины повышения стабильности липоплексов при использовании холестерина как липида-помощника.
Обоснована возможность адресной доставки генов в селезенку, печень и почки при использовании явления слабой активации системы комплемента липоплексами.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Разработанный комплекс физико-химических, цитологических и иммунологических методов тестирования свойств невирусных систем может быть использован для отбора эффективных векторов для направленного переноса генов в генотерапии. С помощью этого комплекса охарактеризованы в качестве медиаторов трансфекции in vitro и in vivo новые классы рН-чувствительных липосом, поликатионов, гидрофобных олигокатионов ХОЛЕНИМ, гликолипидов и лактозолипида. Обнаружен эффективный перенос репортерных генов (3-Gal, GFP или Luc) в культуры эукариотических клеток посредством новых классов медиаторов трансфекции. Комплексы из липосом, содержавших ХОЛЕНИМы и плазмидную ДНК, позволили добиться уровня экспрессии гена [3-галактозидазы на уровне коммерческих препаратов.
Изучение свойств ХОЛЕНИМов показало, что эти препараты стабилизируют двойную спираль ДНК, образуют с плазмидной ДНК комплексы размером 100-200 нм, не оказывают существенного влияния на рост клеток в культуре и синтез ДНК. Чем больше холестериновых остатков содержало вещество, тем меньшее его количество было необходимо для достижения оптимума трансфекции, что коррелирует с физико-химическими свойствами этих соединений.
Предложен метод прогнозирования биораспределения репортерного гена на основе результатов распределения комплексов новых переносчиков с [14С]-ДНК. С его помощью было установлено, что внутрибрюшинные введения таких комплексов приводят к одинаковому распределению ДНК, не зависящему от строения переносчика, а изменение соотношения ДНК/липид может влиять на биораспределение ДНК in vivo и уровень экспрессии репортерного гена in vitro так же сильно, как и замена одного липида на другой.
Показано, что уменьшение длины мостика в молекуле медиатора ДЕГА приводит к образованию более компактных комплексов с ДНК, что может быть верно и для других классов медиаторов. Липосомы из ДЕГА-3 оказались способными легко проникать через мембрану культивируемых клеток. Применение комплексов из липосом, содержавших ДЕГА-3 и плазмидную ДНК, позволило добиться значительного уровня экспрессии зеленого флуоресцентного белка in vitro.
Предложен метод оценки влияния невирусных векторов на иммунную систему, который позволяет отобрать из них безопасные для введения животным и человеку. Показано, что ДИХОЛЕНИМ не оказывает никакого влияния на систему комплемента, в случае КЛ липоплексов наибольший вклад в их антикомплементарную активность вносит кардиолипин, в то время как в случае с ФХ-липоплексами плазмидная ДНК. Слабой активацией комплемента объясняется значительное накопление [ С]-ДНК при использовании липоплексов на основе липосом ФХ/ДИХОЛЕНИМ в почках и печени и максимума экспрессии гена р-галактозидазы в селезенке, печени и легких при использовании липоплексов на основе липосом ФХ/ДИХОЛЕНИМ/лактозолипид. Предлагается использовать явление активации системы комплемента для достижения адресности доставки генов в выделительные органы (в первую очередь в печень).
Полученные результаты свидетельствуют о перспективности препаратов на основе лактозилированного диглицерида (лактозолипида) и ГЛИКОКЛИПа, содержащих углеводные группировки. Комплексы из липосом, содержавших ГЛИКОКЛИП и ген люциферазы, позволили добиться уровня экспрессии белка в 1000 раз большего, чем при использовании негликозилированного липида (КЛИП). Максимум накопления комплексов [!4С]-ДНК и липосом из лактозолипида наблюдался в почках и в печени, а не в легких, что говорит о возможности направленного транспорта с помощью этого вещества.
Разработан метод количественной оценки экспрессии гена 3-галактозидазы in vivo с помощью спектрофотометрии гомогенатов органов, являющийся более объективным, чем гистохимический.
Разработанная методика введения комплексов липидов с ДНК в воротную вену мышам может быть использована в дальнейших работах по испытаниям вновь создаваемых векторов. Некоторые из новых невирусных систем могут быть использованы для переноса терапевтических генов в протоколах генотерапии моногенных наследственных заболеваний, в частности, муковисцидоза и миодистрофии Дюшенна, а также суицидного гена в протоколе генотерапии рака.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Материалы диссертации были доложены на: I Международном Конгрессе "Congress on Molecular Medicine" (Берлин, Германия, 1997); школе НАТО "ASI Summer School on Gene Therapy" (Спетсай, Греция, 1997); Keystone Symposium on Gene Therapy (Кистоун, США, 1997); 6W Symposium on Gene Therapy "Towards Gene Therapeutics", MDC Symposium (Berlin-Buch, Germany, 1998), IX и XI Школе-конференции по физико-химической биологии ИБХ РАНЯОНЕСКО (Москва, 1999 и 2001); на семинарах в Институте биологии гена РАН (Москва, декабрь 1999 г.), Московской медицинской академии им И.М. Сеченова (Москва, 2000 г.), Институте акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН (С.-Петербург, март 2001 г.), на семинарах Института биотехнологии Университета им. Мартина Лютера, Халле, Германия, 2002-2003, European Polymer Congress (Москва, 2005), the 9l National Congress on Medical Biology (Маниса, Турция, 2005).
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1. Сформированная система физико-химических, цитологических и иммунологических тестов и тестов in vivo позволяет отобрать из серии новых липидов эффективные векторы для направленного переноса генов в целях генотерапии.
2. Физико-химические методы исследования позволили определить, что новые липидные векторы ХОЛЕНИМ, липосомы ГЛИКОКЛИП/DOPE, КЛИП/ФХ, ГЛЖОКЛИПЯЮРЕ/ХОЛЕНИМ и ДЕГА-3 образуют с ДНК сферические комплексы небольшого размера (до 100 нм), состоящие из гидрофильного кора, окруженного гидрофобной «шубой», стабильные при хранении и поэтому оптимальные для трансфекции.
3. Хорошая проницаемость через мембраны и нетоксичность позволяют новым липидным системам в комбинации с липидами помощниками обеспечить эффективность трансфекции генов 0 галактозидазы (ХОЛЕНИМы), люциферазы (ГЛИКОКЛИП) и зеленого флуоресцентного белка (ДЕГА-3) in vitro на уровне коммерческих препаратов, а в ряде случаев и выше. При трансфекции с помощью препаратов ХОЛЕНИМ эффективность зависит от соотношения гиброфобность/гидрофильность: чем больше холестериновых остатков содержало вещество, тем меньшее его количество было необходимо для достижения оптимума трансфекции. Липидные векторы с адресными углеводными группами, в частности, ГЛИКОКЛИП, позволяют добиться более высокого уровня экспрессии белка, чем при использовании негликозилированного липида (КЛИП).
4. Новые липидные векторы при введении их животным в дозах до 150 мг на мышь не вызывают токсических явлений в виде видимых повреждений органов и ухудшения состояния животных. Они способны незначительно активировать систему комплемента, однако именно это явление может быть одной из причин адресной доставки комплексов с радиоактивной ДНК в выделительные органы наряду со способом введения, соотношением липид/ДНК и химической структурой липида.
5. Изучение трансфекционной способности новых векторов in vivo с применением не только гистохимии, но и спектрофотометрии, позволяет увеличить эффективность поиска и отбора самых эффективных переносчиков генов в целях генотерапии. Наиболее эффективными из исследованных нами являются препараты ХОЛЕНИМ и лактозолипид в виде липосом с фосфатидилхолином и холестерином.
ПУБЛИКАЦИИ
Основное содержание работы отражено в 17 научных публикациях (из которых 3 - в центральной, 4 - в иностранной печати и 10 - в материалах международных и отечественных конференций и симпозиумов). Список публикаций приводится в конце автореферата.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ
Работа изложена на русском языке, состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 223 наименования работ отечественных и зарубежных авторов. Общий объем диссертации составляет 227 страниц машинописного текста. Текст иллюстрирован 6 таблицами и 42 рисунками.
