Содержание к диссертации
Введение
1 Литературный обзор 6
1.1 Противовирусная и противоопухолевая активность модифицированных 6 нуклеозидов бензимидазола
1.2 Механизм действия аналогов нуклеозидов в отношении HCMV и HSV 19
1.3 Способы получения нуклеозидов бензимидазола 23
1.3.1 Химические способы синтеза нуклеозидов бензимидазола 23
1.3.1.1 Синтез -D-рибозидов бензимидазола по реакции гликозилирования
1.3.1.2 Синтез 2 -дезоксирибоаналогов 5,6-дихлорбензимидазола, замещенных по С2 положению основания
1.3.1.3 Синтез 2 -арабинозидов бензимидазола 30
1.3.1.4 Синтез фторированных по остатку углевода нуклеозидов бензимидазола
1.3.1.5 Синтез 5 -галогенированных производных 2,5,6- трихлорбензимидазола
1.3.1.6 Синтез серии -L-нуклеозидов бензимидазола 35
1.3.2 Ферментативный способ получения модифицированных нуклеозидов 39
1.3.2.1 Cинтез нуклеозидов бензимидазола с применением N- 39 дезоксирибозилтрансфераз (NDTs)
1.3.2.2 Cинтез нуклеозидов бензимидазола с применением 43 нуклеозидфосфорилаз (NPs)
2 Результаты и обсуждение 47
2.1 Синтез модифицированных нуклеозидов бензимидазола с 48
использованием нуклеозидфосфорилаз E. coli
2.1.1 Синтез серии 4,6-дифтор-5-замещенных-нуклеозидов бензимидазола рибо- и 2 -дезоксирибо рядов
2.1.2 Синтез серии 2 -дезокси-2 -фторарабинозидов 5,6-, 4,6- и 4,5,6- замещенных бензимидазолов
2.1.3 Синтез нуклеозидов бензимидазола, модифицированных по С2 80
2.3 положению бензимидазольного кольца Исследование субстратной специфичности PNP E. coli по отношению к гомологам бензимидазола, у которых один атом азота заменен на гетероатом кислорода или серы
Определение активности in vitro синтезированных нуклеозидов бензимидазола
2.3.1 Исследование активности нуклеозидов бензимидазола серий рибо, 2 -рибо и 2 -фторарабино в отношении HSV-1
2.3.2 Исследование активности модифицированных нуклеозидов 5,6-замещенного-2-аминобензимидазола в отношении HSV-1
2.3.3 Исследование противовирусной активности новых нуклеозидов бензимидазола в отношении инфекции, вызванной вирусом клещевого энцефалита
2.3.4 Исследование in vitro цитотоксической активности нуклеозидов бензимидазола на опухолевых клетках лейкемической моноцитарной лимфомы человека U937
Материалы и методы
Заключение
Список сокращений
Список литературы
Приложения
- Механизм действия аналогов нуклеозидов в отношении HCMV и HSV
- Синтез фторированных по остатку углевода нуклеозидов бензимидазола
- Синтез серии 4,6-дифтор-5-замещенных-нуклеозидов бензимидазола рибо- и 2 -дезоксирибо рядов
- Исследование активности нуклеозидов бензимидазола серий рибо, 2 -рибо и 2 -фторарабино в отношении HSV-1
Механизм действия аналогов нуклеозидов в отношении HCMV и HSV
Поскольку активные соединения были найдены как среди -D- так и среди -L-рибонуклеозидов, исследователям было интересно сравнить активность в ряду -D- и -L-2 -дезоксирибонуклеозидов бензимидазола, для чего было синтезировано несколько соединений с различными заместителями в бензимидазольном кольце (Рисунок 11, соединения (14) - (20)). Далее была проведена обширная работа по выявлению среди этих соединений активности против широкого спектра вирусов: вирусов рода Flavivirus, вируса иммунодифецита человека (HIV-1), вируса гепатита B (HBV), вируса гепатита C (HCV) и респираторно-синцитиальный вируса человека (human RSV) [39].
4,5,6,7-Тетрабромированный бензимидазол -L-2 -дезоксирибонуклеозид (17), так же как его -D-энантиомер (20), показали одинаковую активность против тестируемых ssRNA+ вирусов. Однако, эти соединения были также цитотоксичны в пределах того же диапазона концентраций. К сожалению, остальные L- и D-нуклеозиды бензимидазола не показали ни противовирусной активности ни цитотоксичности. L-нуклеозид (17) показал некоторую активность против вируса гепатита B (ДНК-вирус) при высокой цитотоксичности. Соединения (14) - (16) и (18) не проявили активности против HBV. Против респираторно-синцитиального вируса (RSV, ssRNA-) активных соединений выявлено не было ни среди L-, ни среди D-нуклеозидов [39].
Среди синтезированных позднее -D-рибозидов и 2 -дезоксирибонуклеозидов фторированного бензимидазола с различными заместителями в бензимидазольном кольце (21, Рисунок 12) также не оказалось активных соединений в отношении широкого спектра ДНК и РНК вирусов, в том числе HIV, HSV-1, HSV-2, HCMV, Коказаки вируса, респираторного синцитиального вируса и вирусов гриппа А и В. Одновременно соединения обладали низкой цитотоксичностью [40]. ХХЧ HO HO OH/H 21: R = F, OMe, OEt, Oi-Pr, морфолино, N-метилпиперазино Рисунок 12 – Серия рибо- и 2 -дезоксирибонуклеозидов 6-фторбензимидазолов (21) Тем временем, в рамках исследования, направленного на получение аналогов BDCRB со стабильной гликозидной связью было найдено, наконец, два активных соединения: 2-бром-4,5,6-трихлор-1-(2,3,5-три-O-ацетил--D-рибофуранозил) бензимидазол (BTCRB, 22) и 2,4,5,6-тетрахлор-1-(2,3,5-три-O-ацетил--D-рибофуранозил) бензимидазол (Cl4RB, 23) [41] (Рисунок
Синтезированные нуклеозиды (22) и (23) были активны в отношении HCMV, а механизм их действия был очень похож на механизм противовирусной активности BDCRB (4b, Рисунок 5). Интересно, что оба соединения ингибировали два вида клинических изолятов вируса: 1) чувствительный к ганцикловиру (GCV), и 2) GCV-устойчивый. Эффективность соединений при действии на первый вид изолята вируса, как у BTCRB (22) и Cl4RB (23), так и у BDCRB (4b) (контроль) была одинаковая, EC50 для трех соединений составляла 0.35 M. При действии на второй вид изолята самым эффективным оказалось соединение Cl4RB (23) (EC50 = 0.15 M), эффективность BTCRB (22) была на одном уровне с BDCRB (4b) (EC50 = 0.5 M). Кроме того, соединения были активны в отношении цитомегаловируса крыс (RCMV) и Варицелла-Зостер вируса. У BTCRB (22) наблюдалась некоторая активность в отношение HSV-1 [41, 42].
В рамках исследования зависимости "структура-активность" было синтезировано большое количество нуклеозидов бензимидазола с модификациями по углеводному остатку. Townsend и соавторы синтезировали серию из девяти 5 -модифицированных аналогов (22,
Профиль противовирусной активности некоторых соединений был похож на профиль активности TCRB, причем активность была хорошо отделима от цитотоксичности. 5 -Галогенированные производные (24a-d) проявили более выраженную активность против HCMV, чем остальные 5 -производные и даже немного более высокую, чем сам TCRB [43]. Изменение активности в ряду производных с различными 5 -заместителями практически не наблюдалось, несмотря на различия в электроотрицательности и размере заместителей. Активность в ряду соединений с алкокси-заместителями (24e-g) уменьшалась с увеличением размера алкильной группы от метила до бутила. Наличие азидо- и тиометил- заместителей явно не влияло на активность соединений, в связи с чем активность таких соединений в отношении HCMV была сравнима с TCRB. Все соединения с 5 -заместителями оказались более цитотоксичными, чем TCRB. Однако цитотоксичность у всех соединений была отделима от антивирусной активности. Наибольшая селективность наблюдалась у фтор-производного (24a). Был сделан вывод, что при поиске соединений с активностью против HCMV, допускаются модификации в 5 -положении TCRB, поскольку заместители в этом положении не уменьшают активность соединения против данного вируса [44].
В ряду 2 --D-дезоксирибозидов кроме 2 -дезоксиCRB и 2 -дезокси-BDCRB были синтезированы 2-амино (25a) и 2-изопропиламино (25b) производные, которые проявили активность в отношении HCMV. Однако, соединения оказались менее активными, чем TCRB. Следовательно, можно сделать важный вывод о том, что 2 -дезокси--D-рибозиды бензимидазола менее активны против HCMV, чем -D-рибозиды [33].
Синтез фторированных по остатку углевода нуклеозидов бензимидазола
Известно, что введение дополнительного атома фтора в гетероциклическое основание может повлиять на свойства нуклеозидов, в том числе на их биологическую активность. Примером может служить противоопухолевый препарат флударабин – С2 фторированный аналог противовирусного препарата видарабина [147]. Мы решили ввести в бензимидазол дополнительный атом фтора в С4 положение и синтезировать серию новых нуклеозидов, предполагая, что они окажутся более активными при том же невысоком уровне цитотоксичности. В ИОС УрО РАН (г. Екатеринбург) была получена серия производных бензимидазола (2) - (7) (Рисунок 2).
Наши коллеги из института ИОС УрО РАН предложили удобный метод получения модифицированных оснований - восстановление нитроанилинов (8), (9) до соответствующих диаминов (10), (11) оловом в соляной кислоте с последующей циклизацией в муравьиной кислоте (Рисунок 3). Преимущества данного метода заключаются в высокой чистоте гетероциклических оснований, используемых далее в реакции ферментативного трансгликозилирования. При этом отсутствует необходимость хроматографической очистки целевых 4,6-дифтор- и 4,5,6-трифторбензимидазолов (2), (3). Поскольку атом фтора в пара-положении к нитрогруппе в 6-нитро-2,3,4-трифторанилине (9) достаточно легко подвергается действию нуклеофилов, в результате нуклеофильного замещения фтора в реакциях с алкоголятами металлов (-OMe, -OEt) и биогенными аминами (морфолином, пирролидином) были получены 5-замещенные 2,4-дифтор-6-нитроанилины (12a-d), которые каталитическим восстановлением нитрогруппы превращены в соответствующие орто-фенилендиамины (13a-d) (Рисунок 4).
Лучшие результаты были достигнуты при восстановлении нитроанилинов (12а,Ь) до орто-фенилендиаминов (13а,Ь) кипячением в растворе соответствующего спирта с гидразин гидратом в присутствии никеля Рэнея в течение 1 ч (выходы 70 и 80 %). Нитроанилины (12c,d) восстанавливали до орто-фенилендиаминов (13c,d) оловом в соляной кислоте с выходами 40-70 %. 5-Замещенные 4,6-дифтор-Ш-бензимидазолы (4)- (7) получали кипячением орто-фенилендиаминов (ІЗа-d) в муравьиной кислоте с выходами 40 и 60 %.
На следующем этапе синтеза из оснований (2) - (7) необходимо было синтезировать нуклеозиды с природными остатками углеводов - рибозиды и 2 -дезоксирибозиды. Синтез модифицированых нуклеозидов бензимидазола проводили по общей схеме, представленной на рисунке 5. B
На первом этапе работ по синтезу нуклеозидов проводилось изучение субстратно-специфических свойств пуриннуклеозидфосфорилазы (PNP) E. coli [148] по отношению к 4,6-дифтор-5-замещенным аналогам бензимидазола (BIm) (соединения (2) – (7)).
При изучении реакции трансгликозилирования с участием неизученного основания можно ожидать три возможных результата: соединение – ингибитор PNP, cоединение – субстрат PNP, соединение – ни ингибитор, ни субстрат PNP.
Для изучения субстратной специфичности были приготовлены два типа реакционных смесей: тестовая (с содержанием модифицированных оснований (2) – (7)) и контрольная (без бензимидазолов, содержащая только природный нуклеозид - инозин (Ino)). Оба типа реакционных смесей содержали дигидрофосфат калия. В каждую реакционную смесь добавляли PNP и термомтатировали при 50 С в течение 2 суток. Контроль реакции осуществляли с помощью ВЭЖХ и LC-MS.
Заключение о субстратной специфичности делали на основе сравнения количества продукта фосфоролиза инозина - гипоксантина (Hyp), - в контрольной и тестовой реакциях, а также по появлению на ВЭЖХ в тестовой реакционной смеси пиков новых нуклеозидов. Во всех тестовых реакциях на ВЭЖХ появились пики новых соединений и при этом скорость образования Hyp в тестовых реакциях была выше, чем в контрольных, что говорит о реализации сопряженного процесса – переноса образующегося 1--D-рибозилфосфата на модифицированное основание-акцептор. Следовательно, все тестируемые основания являются субстратами PNP. Ингибиторов среди модифицированных по 4,5,6-положениям оснований обнаружено не было. В качестве примера на рисунке 6 приведены данные реакции, содержащей основание (6). Результаты всех тестовых реакций рибозилирования приведены в таблице 1 (24 ч от начала реакций). O F F
По указанной выше методике были проведены тестовые реакции образования 2 -дезоксирибозидов. В качестве донора углеводного остатка использовали 2 -дезоксиинозин (dIno). Интересно, что самыми хорошими субстратами в реакции рибозилирования оказались модифицированные основания (2) и (6), первое из которых не содержит заместителя, а второе содержит самый объемный из имеющихся в данной серии соединений заместитель (морфолинил) в 5-положении бензимидазольного кольца. Тестовые реакции образования 2 -дезоксирибозидов шли с конверсией в среднем 60 % (Таблица 1).
На следующем этапе работ осуществляли оптимизацию процесса ферментативного способа получения серии модифицированных нуклеозидов: рибозидов и 2 -дезоксирибозидов, структура которых представлена на рисунке 7. F Соединение X R Соединение X R OH H 14 OH OEt H 15 H HO—L__--o--, J 10 OH F 16 OH —N О H 17 H 12 OH OMe 18 OH -о OH X 13 H 19 H Рисунок 7 – Серия рибо- и 2-дезоксирибо-нуклеозидов 5-замещенных-4,6-дифторбензимидазолов (8) – (19)
Синтез серии 4,6-дифтор-5-замещенных-нуклеозидов бензимидазола рибо- и 2 -дезоксирибо рядов
Индекс селективности (показывающий, во сколько раз уровень цитотоксичности превосходит уровень противовирусной активности) соединений против вируса HSV-1 изменялся от 0 в случае нуклеозидов основания (20), до 9 в случае рибозида (3). Отобранные для синтеза арабинозидов и 2 -дезокси-2 -фторарабинозидов основания содержали в качестве заместителей только метоксигруппу и атомы фтора, причем количество атомов фтора в бензимидазольном кольце варьировалось от одного до трех, что, как мы предположили, должно было упростить корреляцию данных по активности полученных соединений с их структурой. Для синетза - -арабинозидов использовали NPs Е. coli и два типа донора арабинозы: 1 (- -арабинофуранозил)урацил и 1--фосфат арабинозы. Однако, нам не удалось получить ни одного нуклеозида бензимидазола с помощью такого подхода, хотя по отдельности каждый модифицированный бензимидазол и 1--фосфат арабинозы являются хорошими субстратами для PNP E. сoli [153-155]. Более того, даже в ферментативных реакциях арабинозилирования с незамещенным бензимидазолом (BI), которые были поставлены в качестве контроля, не было обнаружено образования нуклеозидов.
Нас очень заинтересовало, почему PNP не способна синтезировать 1-(-D-арабинозил)бензимидазолы. Мы предположили, что это явление может быть связано с тем, что -D-арабинозиды бензимидазола, образующиеся в активном центре фермента, являются его ингибиторами. Чтобы это проверить и установить тип ингибирования, мы синтезировали 1--D-арабинофуранозид незамещенного бензимидазола (Arafur-BI) химически.
Литературный поиск химических способов синтеза арабинозидов бензимидазола показал, что в основном все описанные ранее арабинозиды бензимидазола имеют L конфигурацию [81, 82]. Единственное упоминание о синтезе 2,5,6-трихлор-1-(-D арабинофуранозил)бензимидазола из 2,5,6-трихлор-1-(2,3,5-три-O-бензоил--D арабинофуранозил)бензимидазола дается в патенте [83], однако, и в нем структура соединения не была охарактеризована. Поэтому мы синтезировали 1-(-D-арабинофуранозил)бензимидазол (26) из арабинозы и силилированного по N1 положению бензимидазола (24) по новой методике (Рисунок 20).
Существует три основных подхода к получению нуклеозидов -D-арабинофуранозы: обращение конфигурации при втором атоме углерода в остатке рибозы рибонуклеозидов, химический нуклеозидный синтез и ферментативный (химико-ферментативный) синтез нуклеозидов [153]. Самый простой, первый подход, эффективен только в случае рибопиримидинов, образующих 2,2-ангидронуклеозиды [156, 157]. Если это невозможно (как для рибопуринов и имидазолидов), соответствующие производные получают путем многостадийных синтезов, требующих выделения промежуточных соединений, зачастую с помощью сложной хроматографии. Разработанная в нашей лаборатории последовательность стадий химического синтеза позволяет минимизировать количество таких разделений, что существенно упрощает общую методику.
Первый этап синтеза - алкилирование арабинозы (21) тремя эквивалентами метоксиметилхлорида (MOM-Cl) (Рисунок 20), в результате чего образуется сложная смесь МОМ-эфиров арабинофуранозы и арабинопиранозы и, в том числе, МОМ-эфир арабинофуранозы (22) и арабинопиранозы со свободной гликозильной OH-группой. При обработке полученной смеси реагентом Вильсмейера (оксалилхлорид/DMF) образуется смесь 2,3,5-три-О-метоксиметил-арабинофуранозил- (23) и пиранозил- хлоридов. Последующая реакция с 1-N-триметилсилилбензимидазолом (24) проходит стереоспецифически с образованием смеси из двух защищенных бета-аномеров арабинозилбензимидазола в пиранозной и фуранозной (25) форме (вместо образования смеси из четырех возможных арабинозилнуклезидов). Последующая обработка реакционной смеси трифторметансульфокислотой в метаноле привела к получению смеси -D-арабинопиранозил-и фуранозил- (26) бензимидазола, которая легко разделялась препаративной ВЭЖХ.
Поскольку после алкилирования арабинозы (21) MOM-Cl в диоксане и последующих преобразований получается смесь арабинопиранозил- и фуранозил- бензимидазолов в соотношении 7:3, необходимо было оптимизировать первую стадию синтеза таким образом, чтобы процент пиранозных форм был минимальным. Мы обнаружили, что проведение реакции алкилирования арабинозы (21) при пониженной температуре в неполярных растворителях (бензоле, дихлорметане) в итоге приводит к существенному (7:1) преобладанию фуранозного производного (22).
-D-Арабинофуранозил бензимидазол (Arafur-BI, 26) был выделен колоночной обращенно-фазовой хроматографией с выходом 40 %. Структура соединения была подтверждена данными 1H- и двумерной гомо- и гетеро-ядерной ЯМР-спектроскопии: 1H/1H-COSY, 1H/13C-HSQC, 1H/13C-HMBC, 1H/15N-HSQC, 1H/15N-HMBC и [1H,1H] NOE спектрами. В [1H,1H] NOE спектре присутствуют кросс-пики взаимодействия С2 протона бензимидазола (8.43 м.д.) с Н5 протонами (3.66 и 3.72 м.д.), с Н3 протонам (4.12 м.д.) и OH2 (5.55 м.д.) арабинозы (Рисунок 21). Кросс-пики С2 протона с Н4 протоном (м.д.) отсутствовали. Все эти данные в совокупности свидетельствуют о -конфигурации синтезированного нуклеозида (26). HOJ 3.66Н
Мы синтезировали Arafur-BI для того, чтобы определить тип ингибирования фермента данным соединением. Для этого была изучена кинетика фосфоролиза инозина с помощью PNP в присутствии предполагаемого ингибитора Arafur-BI. Было установлено, что максимальная скорость реакции уменьшается, а константа Михаэлиса увеличивается с увеличением концентрации Arafur-BI. Такая зависимость характерна для ингибиторов смешанного типа. Константу ингибирования рассчитывали в соответствии с уравнением ингибирования смешанного типа (Рисунок 22). Среднее значение Ki составило 0.17 ± 0.04 мМ, а значение – 2.9 ± 1.0. Эти результаты проиллюстрированы на графике Лайнуивера-Берка (Рисунок 23).
Исследование активности нуклеозидов бензимидазола серий рибо, 2 -рибо и 2 -фторарабино в отношении HSV-1
Одним из вариантов модификации структуры нуклеозидов бензимидазола является введение заместителя во второе положение имидазольного кольца. Однако синтез нуклеозидов с такой модификацией может быть ограничен структурными особенностями активного центра фермента. Такой подход может быть использован для синтеза новых модифицированных нуклеозидов бензимидазола с 2-амино заместителем, поскольку известно, что 2-аминобензимидазол является хорошим субстратом для PNP К coli [130]. Использовать реакцию трансгликозилирования для синтеза нуклеозидов с 2-изопропиламино заместителем и другими объемными заместителями во 2-ом положении имидазольного кольца невозможно. Это ограничение связано с субстратной специфичностью PNP и подтверждено в отношении гетероциклических оснований пуринового ряда, имеющих объемные заместители в восьмом положении кольца [130, 162], которое соответствует второму положению бензимидазола. Мы решили изучить возможность синтеза именно 2-амино- и 2-изопропиламино производных 5,6-замещенных бензимидазолов с целью получить фторированные аналоги единственного нуклеозида бензимидазола, введенного в настоящий момент в клиническую практику в США и проходящего последние стадии клинических испытаний в Европе - Марибавира [37, 38].
Для этих целей в ИОС УрО РАН (г. Екатеринбург), был получен 2-амино-5,6-дифторбензимидазол (37) и его метоксианалог - 2-амино-5-фтор-6-метоксибензимидазол (38) (Рисунок 28). Основания (37) и (38) были получены конденсацией соответствующих орто-фенилендиаминов (35) и (36) с бромцианом. Реакция проходила в ацетонитриле при комнатной температуре без нагревания реакционной смеси. На втором этапе к отфильтрованному и суспендированному в воде осадку добавляли водный раствор карбоната натрия. В предложенном способе не образовывалось побочных продуктов по нитрильной группе. Выход 2-амино-5,6-дифтор-бензимидазола (37) составил 70 %, выход 2-амино-5-метокси-6-дифтор-бензимидазола (38) - 78 %. NH2 Т f " —NH2 R 4 NH 2 R /"-N R /- N H H 35 36 R = F (35), (37) 37, 38 R = OMe (36), (38) a: BrCN, CH3CN, около 30 C, 24 ч b: Na2C03, комнатная температура, 25 C, 1 ч Схема химического синтеза модифицированных оснований (37) и (38)
Кроме того для определения субстратной специфичности PNP в ИОС УрО РАН был синтезирован еще один 2-замещенный аналог бензимидазола - 2-метансульфонил-5,6 дифторбензимидазол (42) (Рисунок 29). F F NH2 a F \\ Ъ» F Г v N " N у sH Г NH2 c F H40T ЇГ У—s—снз F -4/ H41 42 a: KOH, CS2 b: CH3I, KOH c: H202, CF3COOH
На первом этапе к раствору орто-фенилендиамина (39) добавили сероуглерод и KOH в этаноле. Реакционную массу нагревали при кипении, затем при охлаждении добавили уксусную кислоту и выпавший осадок 2-меркапто-5,6-дифторбензимидазола (40) использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. 2-Меркапто-5,6-дифторбензимидазол (40) суспендировали в этаноле, при перемешивании добавляли спиртовый раствор КОН и йодистый метил, в результате чего образовался 2-метилтио-5,6-дифторбензимидазола (41), который использовали на следующей стадии также без дополнительной очистки. На третей стадии к раствору 2-метилтио-5,6-дифторбензимидазола (41) в CF3COOH добавили H2O2 при перемешивании и температуре не выше 15 С. Выход целевого бензимидазола (42) составил 81 %.
Все три основания (37) - (39) были исследованы в качестве субстратов для PNP E. coli. Изучение субстратно-специфических свойств фермента по отношению к модифицированным бензимидазолам велось по общей методике.
Заключение о субстратной специфичности делали на основе сравнения количества гипоксантина (Hyp) в контрольной и тестовой реакции, а также по появлению в тестовой реакционной смеси новых нуклеозидов. Поскольку в реакционных смесях с основаниями (37) и (38) были обнаружены новые соединения (по данным LC-MS), а скорость образования Hyp в тестовых реакциях была выше, чем в контрольных (не содержащих модифицированные основания), мы сделали вывод, что эти основания являются субстратами для PNP. В тестовой реакции с основанием (42) не наблюдалось образования нового продукта, следовательно, основание 42 – не субстрат для PNP.
Параллельно были проведены тестовые реакции синтеза 2 -дезоксирибозидов по этой же методике с единственным отличием - в качестве источника 2 -дезоксирибозы был использован dIno. Результаты всех тестовых реакций приведены в таблице 11. Результаты трансгликозилирования, указанные в таблице (время - 24 часа от начала реакций).
Соединение Cубстрат/не субстрат Конверсия основания в рибозид, % Конверсия основания в 2 -дезоксирибозид, % 37 субстрат 36.4 50.0 38 субстрат 20.5 40.0 42 не субстрат - Поскольку 2-амино-5,6-дифтор-бензимидазол (37) и 2-амино-5-метокси-6-дифтор-бензимидазола (38) оказались хорошими субстратом для PNP E. coli, на их основе с использованием реакции ферментативного трансгликозилирования были синтезированы новые нуклеозиды (Рисунок 30).
Для того, чтобы наработать нуклеозиды (43) - (46) по стандартной методике, необхидимо было оптимизировать основные условия реакции ферментативного трансгликозилирования. Все реакции по оптимизации условий проводили в KH2PO4 буфере при pH 7 и 50 С. Объем реакционных смесей составлял 1 мл. Количества ферментов, добавленные в каждую тестовую реакцию указаны на подписях к рисункам 31-36.
Ферментативный синтез 2-амино-5,6-дифтор-1-(-D-рибофуранозил)-бензимидазола (43) был оптимизирован по следующей схеме: выбор донора рибозы (Рисунок 31), подбор соотношения исходного основания (37) и донора углевода (Рисунок 32), подбор оптимального количества ферментов - нуклеозидфосфорилаз (PNP и UP) (Рисунок 33). По такому же алгоритму был оптимизирован синтез (2 -дезоксирибофуранозил)бензимидазола (44). В результате было выяснено, что лучшим донором в реакции рибозилирования является уридин (Urd), оптимальное соотношение основания (37) к Urd составляло 1:5, а оптимальное количество ферментов - 2420 e.a. PNP/ммоль основания и 200 e.a. UP/ммоль Urd. В реакции синтеза дезоксирибозида (44) лучшим донором оказался дезоксиинозин (dIno), соотношение основание/dIno составило 1:3, а количество PNP - 215 e.a./ммоль основания. На рисунках 31-33 представлены данные по оптимизации синтеза нуклеозидов на примере синтеза рибозида (43).