Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 9
1.1. Свойства и функции мезенхимальных стволовых клеток костного мозга 9
1.2. Миграционная активность МСК 10
1.3. Методы противоопухолевой терапии с применением МСК 12
1.3.1. Таргетная доставка цитокинов с помощью МСК 14
1.3.2. Доставка пролекарств с помощью МСК 15
1.3.3. Применение МСК для доставки онколитических вирусов... 15
1.3.4. МСК - доставщики антиангиогенных веществ 16
1.3.5. Адресная доставка проапоптотических белков с помощью МСК 17
1.3.6. Применение немодифицированных МСК для терапии рака... 17
1.4. Распределение МСК после трансплантации 18
1.4.1. Способы визуализации МСК в организме реципиента после трансплантации 20
1.5. Современное представление о влиянии МСК на опухолевый рост... 23
1.5.1. Принципы регуляции опухолевого процесса
мезенхимальными стволовыми клетками 26
Заключение 31
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 33
2.1. Выделение МСК из костного мозга мышей 33
2.2. Культивирование МСК костного мозга 33
2.3. Культивирование клеток B16-F10 34
2.4. Индукция адипогенной дифференцировки МСК 35
2.5. Индукция остеогенной дифференцировки МСК 35
2.6. Иммунофенотипирование МСК 36
2.7. Исследование миграционной активности МСК к опухолевым клеткам с помощью двухкамерной культуральной системы 36
2.8. Оценка жизнеспособности опухолевых клеток с помощью МТТ теста 36
2.9. Прижизненная окраска МСК красителем Хехст 33342 37
2.10. Схема эксперимента изучения распределения МСК в организме здоровых мышей и мышей-опухоленосителей 37
2.11. Анализ выживаемости животных и изменения объема опухолей 38
2.12. Выделение ДНК 38
2.13. Количественная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени 39
2.14. Приготовление срезов на замораживающем микротоме 40
2.15. Статистическая обработка полученных результатов 41
ГЛАВА III. Результаты исследований 42
3.1. Получение и морфофункциональная характеристика штамма мезенхимальных стволовых клеток костного мозга мышей линии C57BL/6 42
3.2. Изучение миграционной активности МСК в условиях опухолевого роста и влияния МСК на пролиферацию клеток линии B16-F10 в системе in vitro 47
3.3. Влияние внутривенной трансплантации МСК на выживаемость животных-опухоленосителей и кинетику роста меланомы B16-F10 50
3.4. Количественное распределение трансплантированных МСК 51
3.4.1. Распределение МСК в организме здоровых животных и животных - носителей меланомы B16-F10 через 1 час после трансплантации
3.4.2. Распределение МСК в организме здоровых животных и животных - носителей меланомы B16-F10 через 3 суток после
трансплантации 56
3.4.3. Распределение МСК в организме здоровых животных и животных - носителей меланомы B16-F10 через 7 суток после трансплантации
3.4.4. Распределение МСК в организме здоровых животных и животных - носителей меланомы B16-F10 через 14 суток после трансплантации 58
3.4.5. Кинетика накопления МСК в различных органах здоровых
животных и животных-носителей опухоли в течение 14 суток 60
3.5. Исследование распределения МСК в организме животных -носителей меланомы B16-F10 при помощи флуоресцентной микроскопии "
ГЛАВА IV. Обсуждение результатов исследования... 70
Заключение 83
Выводы 86
Спиок сокращений 88
Список используемой литературы
- Миграционная активность МСК
- Индукция адипогенной дифференцировки МСК
- Изучение миграционной активности МСК в условиях опухолевого роста и влияния МСК на пролиферацию клеток линии B16-F10 в системе in vitro
- Распределение МСК в организме здоровых животных и животных - носителей меланомы B16-F10 через 7 суток после трансплантации
Введение к работе
Актуальность исследования. Развитие современной биотехнологии во многом
связано с использованием культивируемых in vitro клеток различного происхождения. В последние годы растет число публикаций, посвященных применению клеточных технологий для противоопухолевой терапии. Большинство этих сообщений посвящено применению мезенхимальных стволовых клеток (МСК) для адресной доставки различных терапевтических агентов в область опухолевого очага, что позволяет значительно минимизировать токсическое воздействие препарата на здоровые TKaHH(Mileticetal., 2007; Gunnarssonetal., 2010; vanEekelenetal., 2010; Studenyetal., 2002).
Применение мезенхимальных стволовых клеток для доставки противоопухолевых препаратов основано на гипотезе о том, что в условиях канцерогенеза стволовые клетки мигрируют преимущественно в опухолевую ткань. Тропизм МСК к злокачественным образованиям впервые был продемонстрирован в работе М. Studeny, в которой авторы применили МСК для доставки интерферона бета в область локализации опухолевого очага (Studenyetal., 2002). В последующих работах МСК были использованы для доставки к опухолям различных терапевтических агентов, например, цитокинов (Studenyetal., 2004), пролекарств (Kucerovaetal., 2007),онколитических вирусов (Yongetal., 2009; Nakamuraetal., 2004), антиангиогенных веществ (Batcheloretal., 2007) и других.
Однако свойствоМСК мигрировать в очаг новообразования не является абсолютно доказанным и требует дополнительного экспериментального подтверждения. Поскольку на сегодняшний день все больше появляется данных о том, что трансплантированные МСК обнаруживаются не только в опухолевой ткани, но и в других тканях, таких как, печень, селезенка, головной мозг (Wolfetal., 2005; Мелешинаи др., 2012; Bexelletal., 2009). Возможно, причины такого расхождения экспериментальных данных связаны с применением различных методов детектирования МСК после трансплантации (флуоресцентные и биолюминесцентные способы визуализации, различные виды томографии, ПЦР, флуоресцентная микроскопия и другие), которые обладают различной степенью чувствительности и специфичности.
Кроме того, на распределение МСК после трансплантации влияет множество других факторов, таких, как способ введения клеток, ксеногенная или сингенная трансплантация МСК и опухоли, источник мезенхимальных стволовых клеток (костный мозг, жировая ткань, пуповинная кровь и другие), тип опухолевых клеток, срок проведения исследования после трансплантации клеток (1 час, сутки, месяцы).
Таким образом, учитывая расхождение экспериментальных данных, применение различных методов визуализации трансплантированных МСК, различных экспериментальных моделей, установление особенностей распределения МСК после внутривенной трансплантации в условиях канцерогенеза является актуальной задачей.
Цели и задачи
Целью данного исследования является установление особенностей распределения МСК после внутривенной трансплантации в условиях опухолевого роста на модели меланомы В16-F10.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
-
Получение и морфофункциональная характеристика штамма мезенхимальных стволовых клеток костного мозга мышей линии C57BL/6.
-
Изучение миграционной активности МСК в условиях опухолевого роста и влияния МСК на пролиферацию клеток линии B16-F10 в системе in vitro.
-
Оценка влияния внутривенного введения МСК на выживаемость животных - опухоленосителей и рост меланомы B16-F10.
-
Изучение распределения МСК после внутривенного введения в организме интактных мышей и при наличии опухолевого процесса методом ПЦР в режиме реального времени.
-
Исследование распределения МСК в организме животных - носителей меланомы В16 при помощи флуоресцентной микроскопии.
Научная новизна
Впервые получен штамм мезенхимальных стволовых клеток костного мозга мышей линии C57BL/6, который обладает стабильными свойствами, безопасен и перспективен для проведения фундаментальных научных исследований и доклинической оценки мезенхимальных стволовых клеток в качестве средства доставки противоопухолевых препаратов.
Впервые продемонстрированы различия в распределении мезенхимальных стволовых клеток после внутривенной трансплантации в организме интактных мышей и мышей с привитой меланомой B16-F10.
Практическая значимость
Получен и заложен на хранение в коллекцию культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» штамм мезенхимальных стволовых клеток костного мозга мышей линии C57BL/6. Штамм охарактеризован в соответствии с требованиями к диплоидным и перевиваемым культурам клеток.
Разработана стандартная операционная процедура «Выделение мезенхимальных стволовых клеток костного мозга мышей линии C57BL/6», которая внедрена в работу отдела клеточных технологий ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».
Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры анатомии, физиологии и безопасности жизнедеятельности ФГБОУ ВПО Новосибирского государственного педагогического университета (Новосибирск).
Положения, выносимые на защиту
-
Стабильность характеристик штамма мезенхимальных стволовых клеток костного мозга мышей линии C57BL/6 позволяет использовать его для проведения фундаментальных научных исследований и доклинической оценки МСК в качестве средства доставки противоопухолевых препаратов.
-
Особенности распределения мезенхимальных стволовых клеток после системного введения зависят от наличия и стадии опухолевого роста.
-
На поздних стадиях канцерогенеза миграция мезенхимальных стволовых клеток изменятся с направленностью преимущественно в костный мозг.
Апробация работы. По результатам работы опубликовано 3 статьи, из них 2 в журналах из списка научных журналов, рекомендуемых ВАК Минобрнауки России, также
материалы работы представлены на всероссийских и международных конференциях, по итогам которых опубликовано 7 тезисов.
Личный вклад. Экспериментальные исследования, представленные в диссертации, проводились либо лично автором, либо при непосредственном участии автора. Автор принимал активное участие в обработке экспериментальных данных, обсуждении и опубликовании результатов.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 105 страницах текста, содержит 20 рисунков. Список литературы содержит 141 ссылку на зарубежные и отечественные работы.
Миграционная активность МСК
Исследования распределения мезенхимальных стволовых клеток после трансплантации необходимы не только для анализа эффективности клеточной терапии различных заболеваний, но и для оценки возможных рисков причинения вреда здоровью человека. На сегодняшний день получено множество данных о распределении МСК после введения на различных экспериментальных моделях.
Среди способов введения клеточного материала в организм наиболее актуальна в настоящее время внутривенная трансплантация мезенхимальных стволовых клеток с последующей задержкой клеток в кровеносных сосудах легких либо миграцией в печень и селезенку реципиента [73]. Помимо внутривенного введения, среди способов трансплантации МСК животным-опухоленосителям можно выделить следующие: интратрахеальное [74], внутриартериальное [48], внутрибрюшинное [58] и подкожное [75]. Показано отсутствие накопления МСК в очаге опухолевого роста в головном мозге при внутривенной трансплантации и детектирование МСК в глиоме при внутриопухолевом введении клеточного материала [61].
Критическим фактором, определяющим распределение клеток после трансплантации, является выбор экспериментальной модели in vivo: сингенная или ксеногенная трансплантация МСК и опухоли. Показано, что при внутривенном введении сингенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга мышам линии BALB/c - носителям мышиной карциномы почек, клетки донорского происхождения были обнаружены как в опухолевой ткани, так и в здоровых тканях: печени, селезенке и легких [10]. Выбирая ксеногенную модель, исследователи используют иммунодефицитных мышей NOD или SCID, которым прививают опухоль человека и вводят мезенхимальные стволовые клетки человека. Так, например, при внутривенном введении МСК человека иммунодефицитным мышам - носителям рака молочной железы человека MDA 231, либо меланомы человека A375SM большинство трансплантированных клеток авторы детектировали в опухолевых тканях и единичные клетки в -печени, в остальных исследованных органах и тканях: почках, селезенке, мышцах МСК не обнаружены [5].
Кроме того, в различных экспериментальных моделях исследователи используют различные источники мезенхимальных стволовых клеток. Так, группа авторов исследовала распределение после трансплантации МСК, выделенных из двух самых популярных источников: костного мозга и жировой ткани. Через 7 дней и 91 день после трансплантации МСК жировой ткани детектировали в ткани легких, тогда как клетки, выделенные из костного мозга, в легких не были обнаружены [76].
Другим не менее важным аспектом исследований распределения МСК является срок после трансплантации клеток. Было показано, что в первые часы после внутривенной трансплантации интактным мышам мезенхимальные стволовые клетки в основном обнаруживали в легких. После чего клетки рециркулировали, и через 48-96 часов после введения МСК детектировали в печени, селезенке, поджелудочной железе, головном мозге, почках, сердце и костном мозге [77]. При изучении распределения МСК костного мозга в течение длительного времени (7 дней и 3 месяца) трансплантированный клеточный материал был найден только через 7 дней в селезенке [76]. В более долгосрочных экспериментах от 4 до 13 месяцев после внутривенного введения МСК интактным мышам показано присутствие трансплантированных клеток в костной и хрящевой ткани, костном мозге, селезенке и мышцах [78].
Таким образом, можно сделать вывод, что на распределение клеток после трансплантации оказывает влияние множество факторов, таких как способ введения клеток, экспериментальная модель, источник мезенхимальных стволовых клеток (костный мозг, жировая ткань, пуповинная кровь и другие), срок проведения исследования после трансплантации клеток (1 час, сутки, месяцы). Систематический анализ этих и других факторов позволит разработать безопасные протоколы лечения различных заболеваний стволовыми клетками.
Способы визуализации МСК в организме реципиента после трансплантации Методы изучения участия мезенхимальных стволовых клеток в онкогенезе и визуализации клеток в организме реципиента после трансплантации можно разделить на две большие группы: прижизненные и поствитальные.
Персонифицированное лечение с использованием аутологичных и аллогенных МСК уже на сегодняшний день является реальностью, поэтому возрастает потребность в неинвазивных прижизненных методах визуализации. Прижизненные способы биовизуализации делят на оптические (флуоресцентные и биолюминесцентные способы визуализации) и неоптические (различные виды томографии).
Неоптические методы визуализации, такие как магнитно-резонансная томография, однофотонная эмиссионная компьютерная томография, позитронно-эмиссионная томография широко применяются в клинической практике для исследования распределения клеток после трансплантации в организме человека.
Магнитно-резонансная томография (МРТ) - это неинвазивный способ визуализации, основанный на измерении электромагнитного отклика ядер атомов водорода. В настоящее время МРТ - высокоточный, чувствительный, специфичный метод диагностики злокачественных новообразований человека [79]. Магнитно-резонансная визуализация была использована для детекции МСК, меченных магнитными наночастицами, в организме иммунодефицитных мышей - носителей глиомы [80].
Индукция адипогенной дифференцировки МСК
Для индукции остеогенной дифференцировки МСК в ростовую питательную среду добавляли 100 нМ дексаметазона, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты (Sigma-Aldrich, США), 10 мМ глицерофосфата (Sigma-Aldrich, США). Через 3 недели культивирования дифференцированные клетки дважды промывали фосфатно-солевым буфером и фиксировали в растворе 4 %-ного формальдегида 60 мин при комнатной температуре, затем инкубировали в 2 %-ном растворе ализаринового красного (Sigma-Aldrich, США) 5-10 мин при комнатной температуре, затем отмывали от остатков красителя водой. Остеоциты фотографировали с использованием фазово-контрастного микроскопа Ахіо Observer.Al (Carl Zeiss Inc., Германия). 2.6. Иммунофенотипирование MCK
Фенотип MCK, выделенных из костного мозга мышей, исследовали на проточном цитометре FACSCantoII (Becton Dickinson, США). Фенотип MCK исследовали с помощью моноклональных антител (Stem cell kits, RD Systems, США), меченых FITC (CD45), РЕ (CD34, CD73), APC CD105.
Для оценки миграционной способности in vitro культуру 5x104 МСК в 200 мкл бессывороточной питательной среды переносили на поликарбонатную мембрану (Chelikon, США) с диаметром пор 8 мкм. За 24 часа до эксперимента высевали клетки меланомы В16 в лунки 24-луночного планшета в концентрации 100 000 клеток/лунка. Опухолевые клетки в лунках планшета промывали фосфатно-солевым буфером и заливали бессывороточной питательной средой Игла MEM (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Россия), затем инкубировали совместно с мезенхимальными стволовыми клетками 48 часов. Параллельно в качестве негативного контроля в лунки планшета добавляли бессывороточную питательную среду и инкубировали совместно с МСК в течение 48 часов. После этого неинвазивные мезенхимальные стволовые клетки удаляли с помощью ватного тампона. Мигрировавшие клетки окрашивали кристалл фиолетовым и подсчитывали количество окрашенных клеток в 10 полях зрения микроскопа. Микроскопию полученных препаратов проводили на инвертированном микроскопе Axio Observer.Zl (х40). Затем вычисляли среднее количество клеток в одном поле зрения. 2.8. Оценка жизнеспособности опухолевых клеток с помощью МТТ теста
Жизнеспособность опухолевых клеток меланомы B16-F10, которые предварительно совместно культивировали с МСК (опыт) либо бессывороточной питательной средой (контроль) в двухкамерной культуральной системе в течение 48 часов, оценивали на микропланшетном ридере Tecan Sunrise (Тесап, Австрия) при длине волны 492 нм по включению опухолевыми клетками 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромида (МТТ) (Sigma, США) и преобразования его в формазан митохондриальными дегидрогеназами. Далее снимали значения оптической плотности субстрата в лунках. Процент жизнеспособных опухолевых клеток вычисляли по формуле: оптическая плотность раствора опыта / оптическая плотность раствора опыта 100 %.
Для исследования распределения трансплантированных клеток в органах реципиента-опухоленосителя с помощью флуоресцентной микроскопии использовали метод прижизненной окраски клеток красителем Хехст 33342 (Sigma-Aldrich, США). Краситель Хехст 33422 проникает через неповрежденные мембраны и окрашивает ядра живых клеток в сине-зеленый цвет. Окраску проводили в ростовой питательной среде Игла MEM (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Россия) с добавлением 10 %-ной сыворотки крови плодов коров, с красителем в конечной концентрации 1 мкг/мл в течение 5 минут, после чего клетки трижды промывали фосфатно-солевым буфером. Эффективность мечения оценивали при помощи флуоресцентного микроскопа Axio Observer.Al (Carl Zeiss Inc., Германия). После мечения клеток красителем Хехст 33342 специфичность окрашивания ядер клеток составляла 100%.
Самкам мышей линии C57BL/6 в правую заднюю лапу подкожно вводили суспензию клеток меланомы B16-F10 в дозе 250 х Ю клеток/мышь в 200 мкл фосфатно-солевого буфера. Степень прививаемости опухоли животным составила 100%. Через 3 дня после трансплантации опухолевых клеток животным в хвостовую вену внутривенно вводили суспензию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток самца в дозе 500 х Ю клеток/мышь в 500 мкл фосфатно-солевого буфера. Затем животные были разделены на 2 группы по 16 особей в каждой группе: первая группа для проведения количественного анализа содержания трансплантированных МСК с помощью ПЦР в реальном времени, вторая группа - флуоресцентной микроскопии. Через 1 час, 3, 7 и 14 суток после введения мезенхимальных стволовых клеток животных умерщвляли методом дислокации шейных позвонков. Опухоль, сердце, кожу, лимфатические узлы, легкие, печень, селезенку, головной мозг, костный мозг забирали для дальнейших исследований с помощью ПЦР либо флуоресцентной микроскопии.
Через 3 дня после трансплантации животным меланомы B16-F10 (как описано выше), животные были разделены на 2 группы случайным образом, по 10 животных в каждой группе: животным первой группы внутривенно вводили суспензию МСК в дозе 500 х 10 клеток/мышь, животным второй группы - физиологический раствор. Контролем служили интактные животные. Через 12 суток после трансплантации опухоли и последующие дни до гибели животных измеряли объем опухоли, используя штангенциркуль. Изменение объема опухолей рассчитывали по формуле V = л/6 АВ , А, В - разнонаправленные размеры опухоли, см, как описано [122]. Животные находились в эксперименте до естественной гибели, после чего проводилась оценка достоверных различий выживаемости животных с помощью метода Каплан-Майера [123].
Изучение миграционной активности МСК в условиях опухолевого роста и влияния МСК на пролиферацию клеток линии B16-F10 в системе in vitro
Через 14 суток после трансплантации МСК объем опухоли достигал максимального объема 2 см , в ткани опухоли начинались некротические процессы.
В костном мозге мышей - носителей меланомы B16-F10 выявлено значительное количество МСК (среднее - 2010/105, стандартное отклонение - 540/105), что достоверно выше чем количество МСК в костном мозге здоровых животных (среднее - 39/105, стандартное отклонение - 8/105) (р = 0,00007).
Помимо этого в околоопухолевых лифатических узлах обнаружено большое число МСК (среднее - 460/105, стандартное отклонение -140/105), тогда как в остальных лимфатических узлах мышей -опухоленосителей введенные клетки не найдены, что доказывает влияние опухолевого процесса на распределение МСК.
В сердце животных с привитой опухолью также детектированы трансплантированные МСК (среднее - 83/105, стандартное отклонение -17/105), тогда как у здоровых животных в этом органе клетки не выявлены.
Установлено статистически значимо более высокое содержание МСК в головном мозге мышей - носителей опухоли (среднее - 20/105, стандартное отклонение - 7/105) по сравнению с накоплением МСК в этом органе интактных мышей (среднее - 4/105, стандартное отклонение - 1/105) (р = 0,003).
Распределение MCK в организме здоровых животных и животных -носителей меланомы В16 через 14 суток после трансплантации клеток. Данные представлены в виде среднего ± стандартное отклонение.
Примечание: р - достоверность различия показателей накопления Y-позитивных клеток в органах интактных животных по сравнению с животными -опухоленосителями (U- критерий Манн-Уитни). Разницу считали достоверной при р 0,05.
Между количеством МСК ткани селезенки здоровых мышей (среднее - 17/105, стандартное отклонение - 8/105) и мышей с привитой опухолью (среднее - 22/105, стандартное отклонение - 10/105) статистически значимых различий не выявлено.
На данном сроке выявлено небольшое число МСК в крови интактных мышей (среднее - 35/105, стандартное отклонение - 7/105), тогда как в кровеносном русле мышей - носителей меланомы В16 трансплантированные клетки не выявлены.
Стоит также отметить, что через 2 недели после трансплантации клеток МСК в опухолевой ткани не выявлены. Таким образом, можно сделать вывод, что опухолевый процесс стимулирует миграцию и/или пролиферацию МСК в костный мозг через неделю после трансплантации МСК на стадии сформированной опухоли.
Кинетика накопления МСК в различных органах здоровых животных и животных-носителей опухоли в течение 14 суток
Кинетика накопления трансплантированных МСК в печени, селезенке, легких, сердце и костном мозге здоровых животных и животных - носителей меланомы B16-F10 была прослежена в течение 14 суток.
В легких интактных мышей и животных - носителей опухоли количество МСК достигло максимума через 1 час после трансплантации клеток (рис. 14 А). Число МСК в легких здоровых мышей через 1 час после введения клеток достоверно выше, чем через 3 суток после трансплантации (р = 0,002), а на более поздних сроках (через 7 и 14 суток после введения) стволовые клетки в данном органе не обнаружены. В легких мышей - опухоленосителей через 1 час после трансплантации МСК число введенных клеток достоверно выше, чем через 7 суток после введения (р = 0,003). Через 3 и 14 суток после введения у мышей -носителей опухоли МСК в ткани легких не обнаружены.
В печени интактных реципиентов через 1 час после введения выявлено большое количество МСК, статистически более высокое чем через 7 суток после трансплантации (р = 0,0007), через 3 и 14 суток после введения трансплантированные клетки в печени здоровых реципиентов не детектированы (рис. 14 Б). Незначительное количество МСК в печени реципиентов - носителей опухоли отмечено через 3 и 7 суток после введения, однако число МСК через 3 суток достоверно выше чем через 7 суток после введения (р = 0,0018). Между количеством МСК ткани печени здоровых мышей и мышей с привитой опухолью через 7 суток после введения клеток статистически значимых различий не выявлено. Трансплантированные МСК в селезенке здоровых мышей и мышей -носителей меланомы B16-F10 обнаружены на всех исследуемых сроках (рис. 14 В). Максимальное количество МСК в селезенке здоровых животных и животных - опухоленосителей накапливалось через 1 час после введения (р 0,05). Установлено, что через 3 суток после трансплантации содержание стволовых клеток в селезенке здоровых животных достоверно выше, чем в селезенке опухоленосителей (р = 0,001), в остальные сроки исследования статистически значимых различий между этими показателями не выявлено.
В сердце интактных животных МСК обнаружены только на ранних сроках после введения (1 час и 3 суток), причем через час после трансплантации клеток число МСК достоверно более высокое, чем через 3 суток (р = 0,001) (рис. 14 Г). В сердечной ткани животных -опухоленосителей МСК детектированы на всех сроках после введения, максимальный показатель накопления МСК отмечен через 3 суток после введения (р 0,05), а минимальный показатель - через 7 суток (р 0,05).
Трансплантированные МСК в костном мозге интактных мышей обнаружены на всех исследуемых сроках (рис. 14 В), при этом число введенных клеток в этом органе здоровых животных не превышало показатель 40/105. Тогда как у мышей - носителей меланомы В16 введенные клетки в костном мозге выявлены только на поздних сроках исследования (на 7 и 14 сутки), при этом количество МСК у животных -опухоленосителей было достоверно выше чем у здоровых животных (р 0,05).
Распределение МСК в организме здоровых животных и животных - носителей меланомы B16-F10 через 7 суток после трансплантации
На данном сроке значительное число МСК обнаружено в костном мозге, околоопухолевых лимфатических узлах и головном мозге реципиентов - носителей меланомы В16. Также как и через 7 суток после введения на данном сроке максимальное количество МСК детектировано в костном мозге.
Поскольку для меланомы характерен лимфогенный путь метастазирования, логично предположить, что большое число детектированных в регионарных околоопухолевых лимфатических узлах МСК свидетельствует о миграции стволовых клеток в область метастазирования.
В организме здоровых животных небольшое количество стволовых клеток обнаружено в костном мозге, крови, селезенке и головном мозге. При этом число трансплантированных МСК в костном мозге и головном мозге реципиентов - опухоленосителей достоверно выше по сравнению с количеством МСК в этих органах здоровых реципиентов.
Подводя итог, можно сделать вывод о том, что внутривенное введение МСК костного мозга мышам - носителям меланомы В16 на данной экспериментальной модели не повлияло на опухолевый рост и выживаемость животных - опухоленосителей. Сравнительный анализ распределения стволовых клеток в организме здоровых животных и животных с привитой опухолью показал, что опухолевый процесс влияет на распределение трансплантированных клеток в организме реципиента. Изучение локализации МСК, окрашенных красителем Хехст 33342, в органах животных - опухоленосителей показало присутствие введенных клеток на различных стадиях канцерогенеза в опухолевой ткани, что подтверждает способность стволовых клеток мигрировать в область развития опухолевого очага. Кроме того, через 7 и 14 суток после трансплантации клеток обнаружен тропизм и энграфтинг МСК в очаг метастазирования в костном мозге. Данный факт может быть использован для разработки нового подхода для противоопухолевых препаратов в МСК. диагностики ДОК и адресной доставки очаги метастазирования при помощи ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В последние годы быстрыми темпами развиваются клеточные технологии, которые привлекают всеобщее внимание не только научными достижениями, но и социальной значимостью. Одной из основных областей применения клеточных технологий в медицине является использование мезенхимальных стволовых клеток в качестве носителей лекарственных препаратов для селективного накопления действующих веществ в опухолевых очагах.
Применение МСК для адресной доставки противоопухолевых препаратов основано на предположении о том, что в условиях канцерогенеза стволовые клетки мигрируют исключительно в опухолевую ткань. Тропизм МСК в область новообразования показан на множестве экспериментальных моделей [4, 5, 6]. Однако в последние годы появляются сообщения о том, что МСК после трансплантации обнаруживаются не только в опухолевом очаге, но и в других органах и тканях [10, 11, 12]. Учитывая расхождение экспериментальных данных, данная работа посвящена исследованию особенностей распределения МСК после трансплантации в условиях опухолевого роста на модели меланомы B16-F10.
Для исследования возможности применения МСК в качестве средства доставки противоопухолевых препаратов был получен и охарактеризован штамм клеток из костного мозга мышей линии C57BL/6, который обладал признаками, характерными для мезенхимальных стволовых клеток, включая фибробластоподобную морфологию, иммунофенотип, способность адгезироваться к пластику при стандартных условиях культивирования, а также способность дифференцироваться в адипогенном и остеогенном направлении.
Проведенный анализ взаимодействия МСК и клеток меланомы В16-F10 в системе in vitro показал усиление миграционной активности МСК при совместном культивировании с клетками меланомы В16. Кроме того установлено, что совместное культивирование клеток меланомы B16-F10 и МСК не оказало влияние на жизнеспособность опухолевых клеток.
Затем исследовали влияние внутривенной трансплантации МСК на продолжительность жизни животных с привитой меланомой B16-F10 и кинетику опухолевого роста. В результате было установлено, что внутривенное введение сингенных МСК на 3 сутки после прививки опухоли мышам не повлияло на рост меланомы B16-F10 и на выживаемость животных - носителей опухоли. Полученные экспериментальные данные могут быть полезными для определения сроков введения МСК при разработке безопасных протоколов противоопухолевой терапии.
Изучение количественного распределения МСК после внутривенного введения в организме интактных мышей и при наличии опухолевого процесса было проведено в следующие сроки: через 1 час после трансплантации МСК, 3, 7 и 14 суток после введения МСК методом ГЩР в реальном времени. Для дополнительного подтверждения результатов ПЦР была выполнена флуоресцентная микроскопия срезов органов мышей с привитой меланомой B16-F10, которым вводили флуоресцентно меченные МСК.
Нами установлено, что максимальное количество МСК через 1 час после внутривенной трансплантации в организме интактных животных и животных - носителей меланомы B16-F10 накапливается в легких.
Через 3 суток после внутривенного введения также выявлены отличия в распределении МСК в норме и в условиях опухолевого роста. В головном мозге и сердце мышей с привитой меланомой обнаружено достоверно более высокое число трансплантированных МСК по сравнению с интактными животными.
Через 7 и 14 суток после введения МСК отличия в распределении клеток после трансплантации усилились. В организме интактных животных на данных сроках выявлены лишь единичные МСК в различных органах. Тогда как максимальное количество МСК в организме мышей -носителей опухоли было обнаружено в костном мозге. Причем число МСК в костном мозге мышей - носителей меланомы B16-F10 было достоверно выше, чем количество МСК в костном мозге здоровых животных.
Таким образом, сравнительный анализ распределения стволовых клеток в организме здоровых животных и животных с привитой опухолью показал, что опухолевый процесс влияет на распределение трансплантированных МСК в организме реципиента на всех исследуемых сроках.