Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы II
1.1. Биораспределение коллоидных систем при внутривенном введении. Влияние поверхностно-активных веществ на фармакоки-нетику коллоидных систем. 11
1.2. Коллоидные носители лекарственных веществ - способ повы- 17 сить эффективность противотуберкулезных агентов.
1.2.1. Внесосудистое введение 17
1.2.2. Внутривенное введение 20
1.3. Наночастицы из ПАЦА как носители лекарственных средств. 24
2. Материал и методы 31
3. Результаты и их обсуждение 37
3.1. Получение экспериментальной лекарственной формы 39
3.1.1. Изучение стабильности экспериментальной лекарственной формы, разработка методов анализа 39
3.1.2. Влияние технологических параметров на свойства наноча- 53 стиц
3.2. Изучение фармакокинетики наносомального рифампицина 69
3.2.1. Сравнительная фармакокинетика свободного и наносомаль- 69 ного рифампицина
3.2.2. Влияние модификации поверхности наночастиц на биораспределение наносомального рифампицина. 76
3.2.2.1. Влияние полоксамера 407 на фармакокинетику нано- 77 сомального рифампицина
3.2.2.2. Влияние полоксамина 908 на фармакокинетику нано сомального рифампицина 86
3.2.3. Накопление наносомального рифампицина в селезенке 87
Заключение 91
Выводы 95
Список литературы 97
- Биораспределение коллоидных систем при внутривенном введении. Влияние поверхностно-активных веществ на фармакоки-нетику коллоидных систем.
- Материал и методы
- Изучение стабильности экспериментальной лекарственной формы, разработка методов анализа
Введение к работе
Лечение внутриклеточных инфекций является серьезной проблемой, одним из решений которой может стать направленный транспорт антибиотиков в инфицированные клетки. Многие возбудители внутриклеточных инфекций, такие как Mycobacteria, Salmonella, Staphylococcus aureus и др., способны выживать и размножаться в макрофагах, естественной функцией которых является захват и уничтожение микроорганизмов. В этом случае макрофаги становятся нишей для патогенных микроорганизмов и мишенью для химиотерапии, а результативность лечения, очевидно, зависит от того, удается ли доставить лекарственное вещество в макрофаги в эффективных концентрациях.
Одним из путей решения этой проблемы является применение коллоидных систем доставки ЛВ на основе наночастиц. Хорошо известно, что наночастицы обеспечивают эффективный транспорт адсорбированных ЛВ в макрофаги. Попадая в кровяное русло, наночастицы фактически повторяют путь бактерий, то есть фагоцитируются резидентными макрофагами и циркулирующими моноцитами. Во внутриклеточной среде частицы подвергаются деградации под действием ферментов и выделяют ЛВ, что позволяет достичь высоких внутриклеточных концентраций и, таким образом, обеспечить повышение терапевтической эффективности. Кроме того, наночастицы способны проникать и накапливаться в очагах патологии, для которых характерны повышенная проницаемость капилляров и нарушения лимфотока (зоны воспаления и опухолевого роста). Эти свойства наночастиц, наиболее выраженные при внутривенном введении, легли в основу концепции о возможном повышении эффективности противобактериальных ЛВ с помощью наночастиц. Действительно, было показано, что наночастицы значительно повышают эффективность антибиотиков при лечении экспериментальных инфекций, для которых характерна внутриклеточная локализация возбудителей, таких как, например, сальмонеллез или листериоз (77).
В последнее время в литературе появились также данные о высокой активности наносомальных препаратов при лечении туберкулеза у мышей (75). Однако эта область применения наночастиц мало изучена. В то же время, можно полагать, что создание наносомальных лекарственных форм позволит повысить эффективность и снизить токсичность применяемых в клинической практике противотуберкулезных средств. Это направление исследований приобретает особую актуальность в условиях значительного роста заболеваемости туберкулезом легких во всех странах мира.
Среди синтетических биодеградируемых полимеров, используемых для получения наночастиц, интерес представляют полиалкилцианокрилаты. Наночастицы из полиалкилцианокрилатов обладают низкой токсичностью и эффективно сорбируют различные ЛВ [52, 101]. В водных растворах эти на-ночастицы образуют устойчивые коллоидные системы, пригодные для парентерального введения; препараты на их основе можно стерилизовать и хранить в лиофилизированном виде. Таким образом, наночастицы из полиалкилцианокрилатов являются перспективным носителем для создания коллоидных систем доставки ЛВ.
Биораспределение коллоидных систем при внутривенном введении. Влияние поверхностно-активных веществ на фармакоки-нетику коллоидных систем.
Известно, что при внутривенном введении коллоидные системы распределяются преимущественно в тех тканях и органах, где капилляры фенестри-рованы (печень, селезенка) или где целостность эндотелия нарушена (очаги воспаления, некоторые опухоли). Размер фенестров капилляров печени составляет 100-150 нм, в воспаленных тканях он может достигать 700 нм (66). Частицы размером менее 10 нм очень быстро покидают системный кровоток через почки (99), а также через лимфоузлы. Частицы небольшого размера (до 70 нм) могут проникать в ткани между клетками эндотелия. Наиболее длительно циркулирующими являются частицы размером до 200 нм, размер таких частиц несколько превышает размер фенестров капилляров печени. Частицы значительно большего размера покидают кровоток при механической фильтрации в селезенке, подробнее это будет рассмотрено ниже. Частицы размером 5—10 мкм и более непригодны для внутривенного введения, поскольку диаметр наименьших капилляров составляет около 7 мкм; такие системы можно вводить перорально, интраперитонеально и т. п., то есть, создавая «депо» лекарственного вещества, постепенно высвобождающегося в кровоток (66,104).
Биораспределение коллоидных систем определяется не только пассивным накоплением в тканях с повышенной проницаемостью капилляров, но и, главным образом, их фагоцитозом. При внутривенном введении частицы быстро покрываются белками плазмы крови - опсонинами, затем опсонизиро-ванные частицы фагоцитируются моноцитами
и резидентными макрофагами. Таким образом, коллоидные системы накапливаются преимущественно в органах, богатых макрофагами, и типичное распределение можно представить следующим образом: печень - 60-90%, селезенка - 2-10%, легкие — 3-20% (55), небольшое количество обнаруживают в костном мозге. Эффективным способом уменьшить накопление частиц в печени является стерическая стабилизация наночастиц веществами, специфически или неспецифически влияющими на опсонизацию и фагоцитоз. Поли-этиленоксиды являются одними из наиболее часто применяемых стабилизаторов. Молекулы ПЕГ полностью гидрофильны, и этим определяется их способность к стерической стабилизации, однако ПЕГи не обладают поверхностно-активными свойствами. Для эффективного взаимодействия с коллоидной частицей в молекуле должны присутствовать гидрофильный и гидрофобный сегменты. Среди большого числа таких соединений можно выделить сополимеры этиленоксида и пропиленоксида — полоксамеры (Плюрони-ки) и полоксамины (Тетроники) (рисунок 1),
Полоксамеры и полоксамины прочно сорбируются на гидрофобной поверхности наночастиц с помощью центрального гидрофобного блока - поли-пропиленоксида. Таким образом, гидрофильные блоки полиэтиленоксида обращены в водную фазу, что обеспечивает стабильность суспензии. Эффективность сорбции ПАВ и конформация полимерной цепи зависят от многих параметров. Наиболее важными являются размер гидрофильного и гидрофобного сегментов, их соотношение, заряд наночастиц, количество водородных связей между эфирными группами ПЕО-сегмента и функциональными группами наночастиц, гидрофобные взаимодействия между ПЕО-цепями, взаимодействия ПВО-сегментов с водой. Кривизна поверхности частицы также влияет на эффективность адсорбции ПАВ: частицы небольшого размера (менее 100 нм) могут принимать меньшее число молекул на единицу поверхности, что приводит к меньшей толщине покрывающего слоя, большему интервалу между гидрофильными «хвостами» и большей подвижности последних. Размер именно центральной гидрофобной части молекул полокса-меров или плюроников определяет плотность слоя ПАВ; удлинение же гидрофильной части приводит к разрыхлению покрывающего слоя и, таким образом, к увеличению мобильности гидрофильных цепей (65).
Материал и методы
Реактивы. В работе использовали: бутилцианоакрилат (Sichel Werke, Германия), рифампицин, рифамшщин SV, декстран с мол. Массой 70000, соляная кислота, гидроксид натрия, плюроник Ф68 (Сигма), маннит (ICN, Biomedicals). Остальные реактивы были марки «хч».
Получение наносомальной формы рифампицина. Наночастицы получали методом эмульсионной полимеризации в водной среде. Декстран-70 (100мг), плюроник Ф68 (0 мг - 50 мг) растворяли в 10 мл соляной кислоты (рН 1,5-3). К этому раствору при перемешивании на магнитной мешалке (Multipoint Magnetic Stirrer, Bios an, Латвия) при 400 об/мин медленно добавляли 100 мкл бутилцианоакрилата. Смесь перемешивали в течение 30 мин, после чего добавляли 1 мл раствора рифампицина в 0,Ш соляной кислоте так, что концентрация рифампицина в полимеризационной среде составляла 0,27 — 2,7 мг/мл. Синтез продолжали еще 2,5 часа, после чего смесь нейтрализовали 2N NaOH до рН 6,0-7,0 (рН-метр ЕІЛТ 3305, Великобритания), добавляли криопротектор - маннит (0,3 г), фильтровали через стеклянный пористый фильтр, разливали по флаконам (обычно по 1-2 мл), замораживали и лиофилизовали (лиофильная сушка Alpha Christ 2-6, Германия) в течение 24 часов.
Спектрофотометрический способ определения рифампицина. Работу проводили на спектрофотометре Helios Alpha, Thermospectronics. Построение калибровочных кривых. 1. Около 10 мг рифампицина (точная навеска) растворяли в 1 мл 0, IN соляной кислоты. Этот раствор разбавляли в фосфатном буфере (рН 7,4), определяли оптическую плотность при длине волны 475 нм и строили калибровочный график. Калибровка была линейна в диапазоне концентраций 10-100 мкг/мл. 2. Около 10 мг рифампицина (точная навеска) растворяли в 1 мл диметилформамида. Этот раствор разбавляли в диметилформамиде, определяли оптическую плотность при длине волны 480 нм. Калибровка была линейна в диапазоне концентраций 10 — 100 мкг/мл.
Спектрофотометрически определяли стабильность рифампицина, степень сорбции, содержание рифампицина во флаконе (см. ниже). Определение рифампицина методом ВЭЖХ. Работу проводили на жидкостном хроматографе SP 8000 фирмы «Спек-тра-Физикс» (США). Колонка размером 250 х 4 мм (А) или 150 х 4.1 мм (В), упакованные сорбентом «Separon С8» с размером частиц 7 мкм. Предколонка размером 30x2 мм, упакованная сорбентом «CoPell ODS» с размером частиц 37-53 мкм. Скорость потока подвижной фазы 1 мл/мин. Работу проводили при комнатной температуре. Объем петли инжектора 10 мкл. В качестве подвижной фазы использовали 50% ацетонитрил, содержащий 0,1% трифторук-сусной кислоты и 0.1 г трилона Б/1 л подвижной фазы. Все растворители и образцы фильтровали через нейлоновый фильтр с размером пор 0,45 мкм. Детектирование проводили при 254 нм. Около 10 мг рифампицина (точная навеска) растворяли в 5 мл подвижной фазы; этот раствор разводили подвижной фазой до концентраций 0-200 мкг/мл, хроматографировали и строили калибровочный график. Калибровка была линейна в диапазоне концентраций 0 - 200 мкг/мл. Хроматографически определяли стабильность рифампицина при различных рН, содержание рифампицина во флаконе, наличие специфических примесей.
Изучение стабильности экспериментальной лекарственной формы, разработка методов анализа
Одним из важных параметров технологического процесса является стабильность активного ингридиента. Синтез наночастиц из ПАЦА проводится в кислой среде, потом применяют щелочь, поэтому необходимо контролировать стабильность рифампицина в процессе полимеризации. Известно, что в кислой среде рифампицин может деградировать до дезоксиформи л рифампицина (РИФ-СВ). В щелочной или слабощелочной среде в присутствии света или кислорода воздуха рифампицин окисляется до рифампицина-хинона. В щелочной среде в отсутствии кислорода образуется 25-дезацетилрифампицин, который в дальнейшем может деградировать до 25-дезацетил-21 -ацетилрифампицина и 25-дезацетил-23-ацетилрифампицина(11) (рисунок 3). Эти родственные соединения обладают различной противо-микробной активностью, как правило, меньшей по сравнению с рифампици-ном. В НТД на препараты рифампицина сумма примесей не должна превышать 1,5 - 4%; содержание рифампицина-хинона нормируется отдельно, допускается наличие до 3% хинона (1, 2, 3). Таким образом, была поставлена задача изучить стабильность рифампицина в полимеризационной среде.
Наиболее простым способом изучения стабильности рифампицина является спектрофотометрия. Форма спектра не должна меняться, если деградации не происходит. Из рисунка 4 видно, что спектр поглощения практически не меняется в течение 3 часов после растворения рифампицина в ОД н соляной кислоте. При образовании РИФ-СВ форма спектра должна была бы поменяться, поскольку спектры поглощения РИФ и РИФ-СВ различны.
Однако, как указано выше, наносомальная форма рифампицина, помимо РИФ-СВ, может содержать рифампицин-хинон, а также продукты взаимодействия рифампицина с алкилцианоакрилатами. В связи с этим спектро-фотометрический метод недостаточно информативен, и естественным представляется использование хроматографических методов для определения специфических примесей рифампицина. Основной проблемой в разделении рифампицина и сопутствующих ему примесей является разделение рифампицина и образующегося из него хинона. Действительно, при инкубации рифампицина в ацетонитриле наблюдали появление пика со временем удерживания 7,9 минут (рисунок 5, сверху).
Рифампицин окисляли до хинона (к раствору AgN03 добавляли O.ln NaOH; выпавший в осадок оксид серебра отделяли центрифугированием, промывали водой до достижения нейтральной реакции среды и обезвоживали, несколько раз промывая метанолом; избыток оксида серебра добавляли к раствору рифампицина в ацетонитриле, смесь перемешивали в
течение 10 минут (серебро осаждалось на стенках сосуда); раствор фильтровали через нейлоновый фильтр, после чего отбирали аликвоты для хроматограф ирования), хроматограмма реакционной смеси представлена на рисунке 5 (снизу). Время удерживания для этого соединения составляет 7,9 минут, и очевидно, что дополнительный пик на рисунке 5 (сверху) соответствует хи-нону. Таким образом, состав подвижной фазы позволяет добиться удовлетворительного разделения рифампицина и рифампицина-хинона. Изучение гидролиза рифампицина в кислой среде. Стабильность рифампицина изучали в буфере при рН 1,68 по убыли основного пика. Результаты приведены на рисунке 6.
