Введение к работе
v Актуальность темы. Эмбриональные стволовые (ES) клетки -плюрипотентные клетки, полученные непосредственно из эмбрионов шгекспитаюашх предимплаятациснных отадий развития. ES клетки мыши способны длительно расти в культуре, и при определенных условиях сохранять свой плюрипотентный статус. После реинтро-дукции в полость бластоцисти и последующей трансплантации в матку ложнобеременной самки, ES клетки, как nn»s::":, участвуют в образовании всех тканей и органов, включая линию половых клеток, химерного потомства.
ES клетки представляют собой новый генетический инструмент, который используется для различных целей: как. модель in vitro (Martin & Lock, 1983; Doetschiran et al., 1985) эмбрионального развития млекопитающих; для изучения регуляторних элементов генной экспрессии у химерных животных (Takahashi et al. , 1988); для получения трансгенных мышей (Robertson et al., 1989; Gossler et al., 1986) и как новый путь для идентификации регу-ляторных генов развития (Gossler et al. , 1989). Главный интерес представляет возможность осуществления экспериментов по гомологичной рекомбинации ES клеток и получению швей с детерминированными свойствами (Baribault & Kemler, 198Э).
Перенос генов, опосредованный трансформированными ES клетками, имеет ряд преимуществ. Генетически трансформированные ES клетки можно подвергать скринингу по критериям, наилучшим способом удовлетворяюким требованиям изучаемой экспериментальной проблемы. Целостность конструкции, введенной в ES клетки, всегда может быть проверена перед инъекцией клеток в бластоцисту. Использование ES-клетсчных линий создает возможность воспроизведения условий эксперимента, что'ке может быть достигнуто при использовании других методов трансгенеза. Это свойство дает, преимущества при тестировании вновь созданных векторов (Gossior et al. , 1936 ).
_ г> _
- о ~
ES клєїки, подученные от домашних животных, могли бы открыть путь для новых подходов, облегчить и улучшить получение трансгенных сельскохозяйственных .тавотных по сравнению с широко используемым методом микроинъекций в прокуклеус. Однако, до настоящего времени нет положительных данных о способности ES клеточных линий, полученных от различных видов млекопитающих, участвовать в формировании химерного организма.
В то ке время несмотря на то, что ES клетки мышей были изолированы более 10 лет назад, число ES клеточных линий, способных давать начало линии половых клеток, все еще ограничено. Причем, все указанные выше эксперименты были проведены с ES клеточными линиями, полученными от инбредной 129/Sv линии мышей. Таким образом, метод получения ES клеточных линий остается недостаточно отработанным даже у мышей, которые являются самым изученным объектом среди млекопитающих. Отечественная литерату1 ра не содержит данных по получению химерных животных с использованием эмбриональных стволовых клеточных линий, а также по их генетической трансформации.
Яель' и задачи исследований. Целью исследований являлась
отработка биотехнологических приемоЕ получения эмбриональных
стволовых клегок мыши, их генетической трансформации, а тагаке
использование ES клеток для получения генеративных химер.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
отработать методы получения ES клеток;
сравнить.влияние различных методов выделения внутренней клеточкой массы (ВКМ) и различных культуральных условий на зф(!ективность получения ES клеток;
- провести ретровирусную трансфекцига, сравнить ее эффек
тивность с ямєідцимиоя литературными данными но другим- ме
тодам трансформации ES клеток;
отработать метод получения химер с испольвованием ES клеток;
проЕести оценку химерных мышей на их способность передавать потомству ES генотип.
Научная новизна. Научная новизна работы заключается. в том, что впервые в нашей стране подучены стабильные ES клетки мыши. Шиорипотентность полученных ES клеточных линий подтверждена тестом на специфичен! активность шэлочкой фуефатгзы, а также способностью ES клеток образовывать змбриоидныг тельца в культуре.
Получены химерные мыши при использовании клона Б/43 D3-ES клеточной линии, одна аллель CNTF гена у которого инактивирова-на с помощью гомологичной рекомбинации (CNTF-D3). Три из полу-ченных химер оказались генеративными (передавали потомству ES генотип).
Путем ретровирусной инфекции конструкцией pPSneo (R С. Прасолов, ЕМ Чумаков. 1988), получены генетически трансформированные ES клетки, содержащие бактериальный ген пео, придающий клеткам устойчивость к антибиотику генетицину G418.
Проведен сравнительный анализ ретровирусной инфекции с другими методами введения чужеродных генов в ES клетки. Показана более высокая эффективность (на одия-два порядка) ретрови-русного метода трансформации по сравнению с литературными данными по трансформации ES клеток методом злектропорации и кальций- фосфат/ДНК преципитации.
Практическая значимость. В процессе экспериментов представлены данные показывающие влияние различных культуралькых условий на эффективность получения стабильных ES клеточных линий из бластоцист С57ВЗ/6 линии мышей. Представлены практические" рекомендации по получении инъекционных химер мыши с яспользова-
- 4 -ниєм ES-D3 клеточной линии. Показано, что в качестве реципиенг-ных бдастоцист предпочтительней использовать линию. мышей С57В1/6. Сочетание CNTF-D3-— С57Є1/6 дает Солее высокий процент как химер среди потомства, гак и генеративных химер по сравнению с сочетанием CWTF-D3 —Balb/c.
Результаты по трансформации ES клеток ретровирусной инфекцией доказывают перспективы ло использованию конструкции pPSneo в экспериментах по введению чужродных генов в ES клетки.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на первой республиканской научной конференции Украины " Биотехнологические достижения и перспективы их развития" (Львов. 1990); на 44-й научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых ВИЖа ( п. Дубровицы, 1991); на VI съезде общества генетиков и селекционеров им. Н. И. Вавилова ( Минск, 1992); на Всероссийской конференции " Клеточные культуры в биотехнологии и ветеренарии" (Москва, 1993); на семенарах лаборатории генетики развития Ыедико-генетического научного центра РАМН и лаборатории клеточной инженерии ЕИЖа ( 1991-1993).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 7-ю таблицами и 23-мя рисунками. Список литературы содержит 124 источника на русском и иностранных языках.