Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1 Природные полисахариды хитин и хитозан 8
1.1.1 Хитин 8
1.1.2 Хитозан 10
1.1.3 Области применения хитозана 15
1.2 Взаимодействие хитозана с другими биополимерами 18
1.2.1 Взаимодействие хитозана с белками 19
1.2.1.1 Взаимодействие хитозана с белками сыворотки молока 22
1.2.1.1 Совместное использование хитозана и белков молочной сыворотки для стабилизации эмульсий 30
1.2.2 Взаимодействие хитозана с нуклеиновыми кислотами 32
1.2.3 Взаимодействие хитозана с полисахаридами
1.2.3.1. Взаимодействие хитозана с альгинатами 37
1.2.3.2. Взаимодействие хитозана с каррагинаном 40
1.2.3.3 Взаимодействие хитозана с пектином 44
1.2.3.4 Взаимодействие хитозана с целлюлозой 46
1.2.3.5 Взаимодействие хитозана с гликозаминогликанами
1.2.4 Взаимодействие хитозана с лигнином 53
1.2.5 Биоинкапсулирование и нанобиокомпозиты на основе хитозана 55
1.3 Меланин 60
1.3.1 Структура меланина 60
1.3.2 Свойства меланина 61
1.3.3 Биологическая роль меланина 62
1.4 Заключение по обзору литературы 64
Глава 2. Материалы, оборудование и методы исследования 65
2.1 Материалы и реактивы 65 \
2.2 Лабораторное оборудование 67
2.3. Методы получения и исследования 68
2.3.1. Определение степени дезацетилирования хитозана 68
2.3.2. Определение средневязкостной молекулярной массы хитозана 68
2.3.3. Ферментативный гидролиз высокомолекулярного хитозана 69
2.3.4. Выделение меланина 70
2.3.5. Получение хитозан-меланиновых комплексов и механических смесей хитозана и меланина 70
2.3.6 Термогравиметрический анализ образцов 71
2.3.7. Исследование электронного парамагнетизма образцов 71
2.3.8. Получение хитозан-меланиновых комплексов в виде гранулированного сорбента 71
2.3.9. Выделение хитин-меланинового комплекса из кутикулы насекомых 72
2.3.10. Радиационно-метрический анализ 73
2.3.11. Определение антиоксидантных свойств образцов 75
2.3.12. Изучение генопротекторных свойств образцов 76
2.3.13. Изучение антигипоксичсских свойств исследуемых образцов 76
2.3.14. Получение комплексов хитозан-р-лактоглобулин 77
2.3.15. Электрофоретический анализ белков 78
2.3.16. Атомно-силовая микроскопия образцов 79
2.3.17. Изотермическия калориметрия титрования 79
Глава 3. Результаты и обсуждение 80
3.1. Получение и исследование комплексов хитозана и его производных с меланинами 80
3.1.1. Исследование процесса комплексообразования хитозана и меланина 80
3.1.2. Физико-химические характеристики хитозан-меланиновых комплексов 82
3.1.3. Свойства хитозан-меланиновых комплексов 87
3.1.3.1. Сорбционные свойства 87
3.1.3.2. Антиоксидантные свойства 89
3.1.3.3. Генопротектроные свойства 90
3.1.3.4. Антигипоксические свойства 92
3.2. Использование хитозана для избирательного удаления р-лактоглобулина из состава молочной сыворотки 93
3.2.1. Исследование взаимодействия хитозана с Р-лактоглобулином...93
3.2.2 Влияние ранее выбранных параметров на селективность связывания р-ЛГ из раствора сывороточных белков 98
3.2.3 Использование хитозана для выделения Р-лактоглобулина из молочной сыворотки 100
3.2.4. Технологическая схема переработки молочной сыворотки с использованием хитозана 102
3.2.5. Технико-экономическое обоснование 106
Выводы 109
Список работ по теме диссертации ; ПО
Благодарности 113
Список литературы
- Взаимодействие хитозана с другими биополимерами
- Биоинкапсулирование и нанобиокомпозиты на основе хитозана
- Определение степени дезацетилирования хитозана
- Исследование процесса комплексообразования хитозана и меланина
Введение к работе
Актуальность темы. Биополимеры - высокомолекулярные природные соединения - являются структурной основой всех живых организмов и выполняют ключевые функции в процессах их жизнедеятельности. В настоящее время исследование и применение биополимеров, в том числе полисахаридов является одним из наиболее актуальных направлений фундаментальной и прикладной науки.
Особое место среди природных полимеров занимают хитин и его дезацетилированное производное - хитозан благодаря наличию уникальных физико-химических характеристик и биологических свойств, а также способности к биоразложению и низкой токсичности. Полисахаридная природа хитозана и присутствие реакционноспособных функциональных групп обеспечивает возможность разнообразных химических модификаций, позволяющих усиливать присущие им свойства или придавать новые в соответствии с предъявляемыми требованиями. Получение комплексов хитозана с другими биополимерами (белками, нуклеиновыми кислотами, полисахаридами и др.) также расширяет спектр его применения.
Известно, что в организмах членистоногих и базидальных грибов хитин находится в комплексе с другими биополимерами, такими как белки, гликаны, меланины. Это придает биоматериалу определенные структурно-функциональные свойства, необходимые организму для адаптации к условиям окружающей среды. Одним из малоизученных биополимеров является меланин. Характерной особенностью меланина является наличие высокостабильных парамагнитных центров, разнообразных функциональных групп, а также системы сопряженных связей в их молекулах. Эти особенности структуры определяют их фото-, радиопротекторные, антиоксидантные и другие свойства. В этой связи представляется интересным конструирование комплексов на основе хитозана и меланина, которые будут обладать свойствами, отличными от исходных биополимеров, что позволит использовать их в биотехнологии, медицине, для защиты окружающей среды и других областях.
Способность хитозана взаимодействовать с другими биополимерами с образованием комплексов может быть использована в различных областях науки и производства, например, для фракционирования белковых смесей.
В частности, в сфере производства молочных продуктов существует проблема переработки и утилизации молочной сыворотки (СМ), в виду большого содержания белка и других соединений. Несмотря на высокую пищевую ценность, белки сыворотки молока способны вызывать аллергические реакции, что особенно опасно для детей первых лет жизни. При этом наибольшими сенсибилизирующими свойствами обладает Р-лактоглобулин (Р-ЛГ).
В этой связи удаление Р-ЛГ из состава молочной сыворотки путем комплексообразования с хитозаном позволит осуществлять процесс производства профилактических и лечебно-профилактических смесей для детского питания в более мягких условиях, обеспечивающих сохранность пищевой ценности компонентов молочной сыворотки.
Цели и задачи исследования. Целью работы являлось получение и исследование свойств комплексов хитозана и его производных с меланинами, а также разработка подхода, позволяющего избирательно удалять Р-лактоглобулин из состава молочной сыворотки с помощью хитозана.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
1. Исследовать особенности взаимодействия хитозана и его производных с
меланинами;
2. Изучить физико-химические характеристики полученных хитозан-
меланиновых комплексов;
3. Исследовать свойства хитозан-меланиновых комплексов;
Установить особенности взаимодействия хитозана и Р-лактоглобулина и выбрать условия, обеспечивающие селективное извлечение Р-ЛГ из смеси белков молочной сыворотки;
Разработать технологическую схему процесса переработки молочной сыворотки с использованием хитозана.
Научная новизна. В настоящей работе впервые рассмотрено получение комплексов хитозана и его производных с меланиновыми пигментами различного
происхождения. Определено влияние различных факторов на процесс комплексообразования. Исследованы физико-химические характеристики полученных комплексов с применением термогравиметрического, элементного анализа, а также с помощью метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Впервые описано явление самопроизвольного увеличения концентрации парамагнитных центров в структуре хитозан-меланинового комплекса с течением времени.
Изучена способность нерастворимых хитозан-меланиновых комплексов связывать из раствора радионуклиды (уран и стронций). Определены значения коэффициентов распределения, степени извлечения, а также емкость хитин/хитозан-меланиновых комплексов в виде порошка и гранулированного сорбента.
Исследованы антиокисидантные свойства водорастворимых комплексов производных хитозана и меланина. Изучена возможность комплексов ингибировать процесс разрушения ДНК фага X продуктами пероксидазного окисления бензидина. Антигипоксические свойства комплексов были исследованы в условиях острой нормобарической гипоксии и гиперкапнии, острой гипоксической гипоксии, а также изучено влияние хитозан-меланиновых комплексов на физическую работоспособность.
В процессе работы исследованы особенности процесса комплексообразования хитозана и Р-лактоглобулина, а также установлено влияние различных факторов на эффективность формирования нерастворимого хитозан-белкового комплекса. С помощью изотермической калориметрии установлены термодинамические параметры процесса комплексообразования.
На основании полученных исследований разработана технологическая схема переработки молочной сыворотки с использованием хитозана.
Практическая значимость работы. Получены сорбенты на основе хитин/хитозан-меланиновых комплексов в виде гранул и порошка, способные эффективно связывать радионуклиды из водных растворов. В связи с этим, хитин/хитозан-меланиновые комплексы могут быть рекомендованы для использования в процессах концентрирования радионуклидов из растворов при
реабилитации природных и техногенных сред, а также для мониторинга загрязнений водных объектов.
Эксперименты в условиях in vivo, выявили способность комплекса сульфосукциноил хитозан-меланин увеличивать выживаемость мышей в условиях недостатка кислорода, избытка углекислого газа, а также при нарушении потребления кислорода тканями. Поэтому данный комплекс может послужить основой для создания препаратов антигипоксического действия.
На основании проведенных исследований разработана и апробирована технологическая схема переработки молочной сыворотки с использованием хитозана пищевого ТУ 9289-067-00472124-03. Разработана технологическая инструкция на производство белкового продукта со сниженными аллергенными свойствами из смеси белков молочной сыворотки с помощью хитозана. Предлагаемый подход позволяет получить два функционально важных продукта: сыворотку молока со сниженными аллергенными свойствами (CM-ГА) и Р-лактоглобулин в индивидуальном виде.
Апробация работы. Основные результаты и отдельные положения работы представлены на следующих конференциях: 91 International Conference of the European Chitin Society (Italy, Venice, 2009), 15th Workshop "New aspects on chemistry and application of chitin and its derivaties" (Poland, Toran, 2009), Десятой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Нижний Новгород, 2010), XI Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии», (Казань, 2010), Седьмых Шорыгинских чтениях (Московская обл. 2010), Научно-практической конференции «Инновационные технологии и оборудование в молочной промышленности (Воронеж 2010), 10і International Conference of the European Chitin Society EUCHIS11 (St-Peterburg, 2011), IV Международной молодежной научной конференции «Экология-2011» (Архангельск, 2011), V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011).
Работа получила премию им. П.П. Шорыгина в 2011 г. за лучшие разработки в области хитинологии, стала победителем программы «Участник Молодежного Научно-Инновационного Конкурса» («У.М.Н.И.К.») в 2010 г.
Личный вклад соискателя. Личный вклад автора заключается в проведении теоретических и экспериментальных исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК.
Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 132 страницах машинописного текста и включают 32 рисунка и 10 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, раздела с обсуждением экспериментальных результатов, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 161 научного источника и приложения.
Взаимодействие хитозана с другими биополимерами
Как и хитин, хитозан представляет собой аморфно-кристаллический полимер. Наряду с другими параметрами, степень кристалличности и молекулярная структура являются ключевыми факторами для объяснения растворимости, механических и других функциональных свойств хитозана.
В отличие от хитина, полученный при его дезацетилировании хитозан растворяется, в разбавленных органических кислотах, например, в водном, растворе уксусной1 кислоты. При этом для растворов хитозана характерна существенная; зависимость вязкости от концентрации (при увеличении концентрации раствора; хитозана в 1-2%-HOMV растворе уксусной: кислоты с 2 до А%: вязкость раствора увеличивается1 примерно ы 30 раз): Появление; в каждом элементарном звене макромолекулы свободной; аминогруппы придает хитозану свойства полиэлектролита, одним: из которых является характерный для таких растворов эффект полиэлектролитного набухания..Этот эффект является следствием увеличения эффективного: объема и асимметрии? макромолекул в:, растворе в результате отталкивания одноименных зарядов; возникающих при протонировании аминогрупп [20].
Необходимо отметить, что хитозан» является биосовместимым, биодеградируемым и низкотоксичным полимером. Для человека ED5o хитозана; составляет около 16 г на.Г кг, веса [21]LПрисутствие свободных аминогрупп в составе полимера значительно улучшает его растворимость в водных растворах, что расширяет диапазон применения хитозана по сравнению с хитином.
Поскольку хитин и особенно хитозан в зависимости от метода его получения не являются монодисперсными, еще одна первостепенно важная, характеристика - индекс полидисперсности, позволяющей охарактеризовать разброс по молекулярной массе в.: каждом исследуемом образце. Однако не, менее важными являются такие характеристики хитозана как, например;. содержание ионов металлов и белка; которые варьируют в зависимости-от источника выделения и способа получения [21]. Хитозан, являясь уникальным природным полимером, позволяет производить различного рода модификации своей структуры. В первую» очередь это касается получения образцов полиаминосахарида различной молекулярной массы и степени дезацетилирования, т.к. изменяя данные характеристики можно получать полисахарид с кардинально отличающимися: свойствами [6]. В настоящее время для расщепления; р-гликозидной связи полимерной, цепи хитозана используются физико-химические и ферментативные методы гидролиза:
Разрушение: Р-(Г-4)-гликозидной связи в- молекуле хитозана; можно проводить под действием, кислот и сильных, окислителей. Как правило . для: этой; цели используются такие кислоты как соляная, серная, азотистая; а также перекись, водорода [22]: Однако, недостатками химического гидролиза являются: частичное дезацетилирование исходного- биополимера, использование агрессивных реагентов, что в свою очередь приводит к определенным трудностям в; сфере защиты окружающее среды, повышенным требованиям к обеспечению, безопасных условий труда- и необходимости; применять дорогостоящее: специализированное оборудование: Кроме: того, особенностью,химического гидролизаявляется протекание побочных реакций, приводящих к разрушению или? модификации структурного звена хитозана
Альтернативным способом получения хитозана.различной молекулярной массы.является ферментативный;гидролиз. В ютличие от химического способа, ферментативный метод деполимеризации протекает в более мягких условиях и, как правило, позволяет избежать нежелательной модификации, хитозана. В основном для ферментативного гидролиза хитозана используют набор хитинолитических ферментов, поскольку большинство, микробных хитиназ помимо коллоидного хитина, успешно гидролизуют также и хитозан содержащий 10% и более N-ацетильных групп. Одними; из самых эффективных источников внеклеточных ферментов с 13, полимердеградирующими свойствами являются хитиназные комплексы, продуцируемые бактериями родов Streptomyces и Bacillus. Оптимальными условиями для проведения гидролиза хитозана комплексом хитинолитических ферментов являются диапазон рН от 4,5 до 5,5, температура от 30 до 55С, время от 0,5 до 3 часов и фермент-субстратном соотношении 4-6 единиц активности фермента/г хитозана в зависимости от продуцента [2].
Несомненный интерес в области исследований ферментативного гидролиза хитозана представляет возможность разрыва р-гликозидных связей полисахарида под действием ферментов, не обладающих специфичностью к данному субстрату. Это касается как ферментов, способных гидролизовать соединения с гликозидной связью (амилазы, Р-гликаназы, гликозидазы), так и протеиназ [23]:
В настоящее время наряду с хитиназами активно используются более доступные неспецифические к хитозану гидролитические ферменты: р-глюкозидазы (КФ 3.3), липаза зародышей пшеницы (КФ 3.1.1.3), лизоцим(КФ 3.2.1.17), папаин (КФ-3.4.4.10), целлюлазы (КФ 3.2.1.91), гемицеллюлазы, р-1,3-глюканазы (экзо КФ. 3.2.1.58 и эндо КФ. 3.2.1.6 и КФ 3.2.1.39), проназа (КФ 3.4.24.31) [24].
Несмотря на это, механизм гидролиза гликозидных связей хитозана при -действии неспецифических ферментов до сих пор не ясен и требует дальнейшего изучения.
Физические методы гидролиза подразумевают использование разных видов излучения, ультразвука и термической обработки. При термообработке полимера происходит разрыв гликозидных связей за счет кислотного гидролиза и окислительно-восстановительных реакций с образованием радикалов. При температуре около 200С происходит разложение хитозана [25].
Деполимеризацию хитозана под действием гамма-лучей проводят либо в твердом состоянии, либо в растворенном виде. Механизм действия гамма лучей на полимер представляет собой свободнорадикаьный процесс с разрушением гликозидной связи [26].
Помимо описанных подходов физического воздействия, с целью гидролиза хитозана используют также обработку ультразвуком, механическую деструкцию, фоторазрушение и другие подходы [27-29].
Наличие реакционноспособных функциональных групп хитина и хитозана обеспечивает возможность разнообразных химических модификаций, позволяющих усиливать присущие им свойства или придавать новые в соответствии с предъявляемыми требованиями. Получение различных производных существенно расширяет спектр применения данных биополимеров в фундаментальных исследованиях, а также в сфере коммерческого производства [2, 21, 30].
В настоящее время в литературе описано большое количество работ, посвященных получению и исследованию свойств производных хитина и хитозана. Данный литературный обзор не включает в себя рассмотрение различных производных хитина и хитозана, поэтому ограничимся лишь перечислением некоторых из них: N/O-карбоксилированные, ацилированные, сульфатированные, сукцинилированные, фосфорилированные производные; основания Шиффа; также следует отметить возможность получения сополимеров хитина и хитозана, осуществления поперечных сшивок и получения полимерных сеток [2].
Биоинкапсулирование и нанобиокомпозиты на основе хитозана
Каррагинан относится к линейными сульфатным полисахаридам, который получают из красных морских водорослей. Все каррагинаны — высокомолекулярные полисахариды, составленные из повторений субъединиц галактозы и 3,6-ангидрогалактозы (3,6-AG), как сульфированных, так- и несульфированных. Субъединицы соединены чередующимися альфа 1-3 и бета 1-4 гликозидными связями. В зависимости от степени", полимеризации» и количества сульфогрупп препараты каррагинанов классифицируются на 3 группы: каппа - сильные, твердые гели (одна сульфатная, группа на две молекулы галактозы), йота - мягкие гели (две сульфатные группы на две молекулы галактозы), лямбда - формируют гели в смеси с белками, а не водой; используются для утолщения молочных продуктов (три сульфатные группы на две молекулы галактозы).
Полиионная природа хитозана и каррагинана позволяет их использовать для получения- полиэлектролитных комплексов (ПЭК). Как известно, при смешивании двух противоположно1, заряженных полиэлектролитов в зависимости от условий могут образовываться ПЭК различного размера от водорастворимых агрегатов до микрочастиц (гелей, пленок). В работе [90] были исследованы возможность получения и условия формирования растворимых комплексов хитозана и каррагинана в зависимости от структурных особенностей компонентов. Показано, что в области низких концентраций полиионов наблюдалось образование растворимых комплексов каррагинан/хитозан. Значения рН среды растворения полисахаридов (5,0-7,2) и тип выбранного буфера не оказывали существенного влияния на процесс формирования комплексов. При увеличении концентрации полисахаридов размер частиц зависел от соотношения полисахаридов. Полученные комплексы оставались стабильными в течение 24 часов. При получении комплексов, в- нестехиометрических соотношениях полимеров возможно неполное связывание исходных компонентов: Анализ количества сульфатных групп в каррагинане, связанных с одной-аминогруппой хитозана, показывает, что каждая SO42" группа каррагинана не установленного строения связывается! с аминогруппой хитозана. Для каппа-каррагинана это значение было близко к стехиометрическому соотношению, тогда как в случае лямбда-каррагинана. с хитозаном реагирует только каждая вторая- из анионных групп. Вероятно; конформация лямбда-каррагинана в растворе затрудняет доступность анионных групп для связывания с хитозаном. Таким образом установлено, что характер комплексообразования зависел от структуры каррагинана, что также подтверждалось в работе [91].
Как и в случае с хитозан-альгинтными гранулами, гранулы хитозан-каррагинана также могут быть использованы для-доставки-. БАВ в кишечник. Однако по сравнению с вышеназванными гранулами, высвобождение целевого продукта из хитозан-каррагинанового комплекса происходит медленнее, кроме того, присутствие различных компонентов в среде желудка может мешать высвобождению БАВ из гранул хитозан-каррагинан 86].
В работе [92] были получены рН-чувствительные гидрогелевые системы хитозана с карбоксиметилцеллюлозой (КМЦ) и к-каррагинаном. Гомогенность и набухаемость полученных гидрогелей зависела от весового соотношения каррагинан-КМЦ, а также от содержания солей в растворах полимеров. При низком содержании хитозана, каррагинана и солей наблюдали образование гетерогенных гелей, состоящих из гелевых систем с высокой и низкой степенью поперечных сшивок. С ростом содержания хитозана, каррагинана и солей плотность поперечных сшивок уменьшалась, и происходило образование гомогенных гелей: Степень набухания гелей хитозан-каррагинан достигала максимума;пртрй1-1-12. . Структурная1 организация; гелей; й их механические: т реологические: свойства?зависят как от содержания хитозана;В; комплексе, так: и? от природы каррагинановї [93]L А.-каррагинаш не оказывал значительного влияниям на; свойства получаемых комплексов с хитозаномв отличие от йота и каппа.форм. Их гели с хитозаном были термочувствительны;.. При; этом данное свойство гелей объяснялось конформационных термообратимым переходом спираль-клубок молекул каррагинанов,. который имел место при понижении температуры ивыражалсяв виде золь-гель,переходов;
Одним из перспективных . направлений использования комплексов» хитозан-каррагинан является!создание на их основе мультислойных покрытий; обладающих антиадгезионными свойствами. Адгезия микроорганизмов на различных поверхностях, в том числе на поверхностях имплантов и бйомедицинских устройств, является крайне нежелательным явлением и может приводить к различного; рода осложнениям. Одним из путей решения данной проблемы является создание покрытий; препятствующих закреплению клеток на обрабатываемой поверхности: Использование пленок на основе хитозана и каррагинана предстваляется перспективным благодаря биосовместимости; отсутствию цитотоксического эффекта и антимикробным; свойствам хитозана: Схема, построения мультислойных покрытий хитозан/каррагинан и зависимость толщины бислоя, сформированного парой поликатион-полианион, от рН при адсорбции полиэлектролитов приведена на рисунке 7 [94]; Видно; что увеличение рН при адсорбции хитозана способствует формированию слоя большей толщины, а снижение рН и увеличение степени протонирования свободных аминогрупп адсорбированного хитозана на стадии адсорбции каррагинана позволяет заметно увеличить рост толщины пленки по сравнению с мультислоями, полученными при постоянстве значений рН на каждом этапе адсорбции.
Определение степени дезацетилирования хитозана
Образцы меланинов были выделены из следующих грибов: трутовика плоского (Ganoderma appaliwn), трутовика настоящего {Fomes fomentarus), трутовика дубового ложного (Phellinus robustus), чаги (Jnonotus obliquus), экстракцией 0,5% раствором NH4OH в течение 2-х часов при температуре 60С и соотношении массы гриба к массе экстрагента 1 : 10 с последующим трехкратным переосаждением 1Н НС1 до рН 2,0. Далее осажденный меланин растворяли в 0,5% NH4OH и диализовали против воды до нейтрального значения рН раствора пигмента, после чего раствор высушивали, лиофильно [153].
Образцы хитозана растворяли в 2% уксусной кислоте с последующим доведением рН раствора до значения 6,0 с использованием 0,1 М NaOH. Образцы меланина растворяли в 0,1 М ацетатном буфере рН 6,0. Для получения хитозан-меланиновых комплексов 1% раствор хитозана добавляли к 1% раствору меланина, после чего смесь инкубировали в течение часа при комнатной; температуре при постоянном перемешивании. Далее полученную суспензию центрифугировали 15 минут при 12 тыс. об/мин. для отделения нерастворимого хитозан-меланинового комплекса. Полученный осадок лиофильно высушивался. Степень превращения оценивали по оптической плотности суперпатаита при X 465 нм, прямо пропорциональной количеству непрореагировавшего меланина в растворе.
Механические смеси хитозана и меланина были получены методом совместного перетирания в ступке лиофильновысушенных образцов полимеров в том же соотношении, что и в полученных хитозан-меланиновых комплексах. Термогравиеметрический анализ образцов хитозан-меланиновых комплексов, исходных биополимеров и их механических смесей проводили на приборе "ТА - 4000 Mettler Toledo", снабженном модулем ТГ-50. Измерения выполняли в интервале температур 25 - 600 С в атмосфере воздуха при скорости нагрева 5 С/мин. Математическую обработку результатов осуществляли с помощью встроенного программного обеспечения «Star».
Изучение образцов хитозан-меланиновых комплексов, исходных биополимеров и их механических смесей с помощью метода электронного парамагнитного резонанса проводили на спектрометре «Varian Е-112». Измерение парамагнитных характеристик осуществляли, используя-лиофильновысушенные препараты. Содержание парамагнитных центров (ПМЦ) определяли методом сравнения с аттестованным образцом угольного порошка с известным содержанием центров. Для расчета g-факторов использовали в качестве эталона Мп2+ в порошке MgO [154] .
Свежеприготовленный 6% раствор хитозана М„ 21 кДа, СД 86% в 6% уксусной кислоте помещался в медицинский шприц V=100 см3 с иглой диаметром отверстия 240 мкм, который закреплялся с помощью лапки штатива над цилиндром, высотой L=25 см, содержащим 20 мл 0,5% раствора меланина в 12,5% растворе NH4OH. При увеличении давлении в шприце в воздушной прослойке между иглой и щелочным раствором меланина происходило формирование капли раствора хитозана. При попадании капли хитозана в раствор меланина происходило формирование нерастворимой гранулы. Последующее выдерживание гранул в течение часа при постоянном перемешивании раствора меланина приводило к формированию гранулированного хитозан-меланинового комплекса. Для удаления из структуры гранул не связавшегося меланина производилась трехкратная промывка гранул дистиллированной водой.
В качестве исходного сырья для получения хитин-меланинового комплекса (ХМК) использовали пчел, погибших в период зимовки (подмор пчел). Объект исследования получали, из насекомых семейства медоносных пчел (Apis mellifera) среднерусской породы.
На стадии предподготовки пчелиный подмор1 высушивали при 50С до постоянной массы и измельчали на сухом измельчителе до размера частиц 0:1-1 мм. Водную экстракцию проводили при 95 С на водяной бане при постоянном перемешивании в течение 1 часа и соотношении подмор/экстрагент 1:10 (по массе). Нерастворимый хитин-меланин-белковый комплекс отделяли фильтрованием и высушивали при комнатной температуре в течение 8 часов.
На стадии депротёинирования комплекс обрабатывали l%,NaOH при 95С и при постоянном перемешивании в течение 1 часа и соотношении-комплекс/экстрагент 1:10 (по массе). Нерастворимую часть отделяли фильтрованием и высушивали при 50С под вакуумом. Обработку нерастворимого комплекса биополимеров 6% НС1 проводили при 50С в течение 1 часа при постоянном перемешивании и соотношении комплекс/кислота 1:10 (по массе). Избыток кислоты удаляли многократной. промывкой осадка дистиллированной водой до нейтральных значений рН. После фильтрования осадок трижды промывали 96% горячим этиловым спиртом (60С) и высушивали при 50С под вакуумом. Осветление комплекса осуществляли обработкой раствором Н202 и смесью Н202 и HCI
Исследование процесса комплексообразования хитозана и меланина
Основными компонентами сухого вещества молочной сыворотки являются: лактоза, белки, жир, а также минеральная составляющая. Известно, что в определенных пределах соотношение компонентов, рН и другие характеристики молочной сыворотки могут варьировать. Также не исключено наличие белок-белковых агрегатов и других межмолекулярных взаимодействий. Все это может непосредственно влиять на эффективность селективного извлечения главного аллергена из состава молочной сыворотки.
Ранее было показано, что с ростом молекулярной массы полисахарида происходит увеличение размеров частиц комплекса хитозан - Р-ЛГ. Поэтому в дальнейшей работе, для облегчения разделения суспензии был использован хитозан М„ 500 кДа, СД 86%.
Добавление полисахарида в частично деминерализованную молочную сыворотку приводило к образованию нерастворимых агрегатов. Однако полного извлечения р-ЛГ из состава молочной сыворотки добиться не удалось во всем диапазоне выбранных концентраций (рис. 31 А)
Электрофореграмма (А) сыворотки молока после обработки хитозаном Mv 500 кДа. СД 86% в разной концентрации и (Б) белков, связанных хитозаном соответственно. В данном случае максимальное извлечение (і-лактоглобулина из состава молочной сыворотки наблюдалось при концентрации хитозана 1,2 мг/мл (5:8 хитозан/белок, в/в), что существенно превышает значения, определенные для выделения Р-ЛГ из раствора КСБ (1:8, в/в). Селективность процесса при этом также нарушалась (рис. 31 Б). Эти затруднения могут быть обусловлены высоким содержанием солей в составе исходной сыворотки (содержание золы 7,3% против 2,1 % в составе КСБ), что выдвигает дополнительные требования к процессу деминерализации сырья.
На основании проведенных исследований разработана технологическая схема переработки молочной сыворотки с использованием хитозана (рис. 32), предусматривающая получение двух функционально важных продуктов: молочной сыворотки со сниженными аллергенными свойствами (CM-ГА) и Р-лактоглобулина в индивидуальном виде, который может в дальнейшем использоваться в пищевой промышленности в качестве пенообразователя, эмульгатора и др. Данная технология не требует больших временных и энергетических затрат, а также применения специализированного оборудования.
Первая стадия переработки заключается в удаление жира и казеиновой пыли из молочной сыворотки, поскольку данные компоненты могут повлиять на дальнейший процесс очистки и снизить выход целевого продукта. Далее полученное сырье подвергается пастеризации для инактивации нежелательной микрофлоры.
Принципиальным этапом переработки является деминерализация молочной сыворотки. Высокое содержание солей (8-12 % в пересчете на сухой остаток) в данном виде молочного сырья частично или полностью препятствует образованию нерастворимого белково-полисахаридного комплекса и делает процесс выделения Р-лактоглобулина невозможным. Наиболее полное удаление солей (посредством электродиализа) будет способствовать достижению максимальных выходов очищенного протеина. Диапазон рН подсырной молочной сыворотки составляет от 5,9 до 6,6, а кислой 4,3-4,6. Для увеличения выхода может потребоваться доведение рН сыворотки до 6,0 — 6,2 (с помощью молочной кислоты или натрия гидрокарбоната), что также является важным условием эффективного связывания белка полисахаридом.
Также для выделения р-лактоглобулина возможно использовать КСБ или сухую деминерализованную сыворотку, после растворения в водной среде при рН 6,0-6,2. Применение данных видов сырья значительно снижает стоимость транспортировки и хранения сырья, что экономически целесообразно при производстве, территориально отдаленном от места получения сыворотки.
Суть следующих этапов процесса заключается во внесении хитозана в молочное сырье, проведения реакции комплексообразования (на стадии смешения) и отделения осадка. В частности, в предварительно подготовленную молочную сыворотку или раствор КСБ вносится расчетное количество 1% раствора хитозана. Реакцию проводят при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 30 минут. Далее осадок, представляющий собой комплекс хитозана и В-лактоглобулина, отделяют путем фильтрования.
Следует учитывать, что в процессе формирования комплекса может происходить механический захват белков, не принимающих непосредственное участие в процессе комплексообразования. С целью очистки комплекса хитозан-р-лактоглобулин от нежелательных примесей, проводят трехкратную промывку осадка раствором с рН 6,0 и низкой ионной силой. При этом промывные воды могут содержать,от 5 до 15% белков (от исходного), таких как а-лактальбумин, БСА и др.. В этой связи целесообразно использовать промывные воды для растворения КСБ, либо сухой деминерализованной сыворотки во избежание потерь данных белков.
Для отделения В-лактоглобулина от полисахарида ранее полученный осадок, ресуспендируют в 0,3 М карбонатном буфере рН 9,0 и инкубируют при перемешивании в течение 15 минут. В результате белок переходит в раствор, а хитозан остается в нерастворимом виде. Разделение данных соединений производят методом фильтрования.
На заключительных этапах очищенный препарат р-лактоглобулина подвергается деминерализации посредством электродиализа, высушивается на распылительной сушке, упаковывается и отправляется на хранение.
Следует отметить, что хитозан может быть вновь использован в технологическом цикле. После отделения белка полисахарид ресуспендируют воде с целью удаления ионов буфера и подвергают центрифугированию. Операцию повторяют трижды, после чего хитозан направляется для приготовления новой реакционной смеси.
