Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 10
1.1. Биоматериалы 10
1.1.1. Биоматериалы 10
1.1.2. Общие требования, предъявляемые к биоматериалам 11
1.2. Биоматериалы в лечении спаек 14
1.2.1. Проблема спайкообразования 14
1.2.2. Барьерные материалы и специальные требования, предъявляемые к биоматериалам для предотвращения спайкообразования 17
1.3. Полисахариды пектин и хитозан как основа биоматериалов 22
1.3.1. Структура, физико-химические и биологические свойства пектина и хитозана 22
1.3.2. Биоматериалы на основе хитозана и пектина 26
2. Материалы и методы 35
2.1 Материалы 35
2.2 Получение образцов полисахаридов
2.2.1 Выделение пектина из растительного материала 36
2.2.2 Очистка хитозана переосаждением 36
2.2.3 Химическая деполимеризация хитозана 37
2.2.4 Реацетилирование хитозана 37
2.2.5 Дополнительное дезацетилирование хитозана 37
2.3 Определение физико-химических характеристик полисахаридов 38
2.3.1 Определение физико-химических характеристик пектина 38
2.3.2 Определение физико-химических характеристик хитозана
2.3.2.1 Определение молекулярной массы хитозана методом ВЭЖХ 39
2.3.2.2 Определение молекулярной массы хитозана вискозиметрическим методом 39
2.3.2.3 Определение степени дезацетилирования образцов хитозана 40
2.3.2.4 Определение динамической вязкости образцов хитозана 40
2.4 Получение криогелей на основе пектина и хитозана 40
2.5 Исследование структуры и состава криогелей
2.5.1 ИК-спектроскопия 41
2.5.2 Элементный анализ 41
2.5.3 Исследование морфологии поверхности и внутренней структуры криогелей методом сканирующей электронной микроскопии 41
2.6 Исследование физико-химических свойств криогелей 42
2.6.1 Способность к набуханию криогелей 42
2.6.2 Адгезия криогелей к внутренней поверхности брюшной стенки крыс 42
2.6.3 Определение прочности криогелей 42
2.6.4 Определение модуля упругости криогелей 43
2.6.5 Деградация криогелей in vitro 43
2.7 Исследование биосовместимости криогелей 44
2.7.1 Адсорбция белков сыворотки крови 44
2.7.2 Активация системы комплемента криогелями 44
2.7.3 Адгезия макрофагов к поверхности криогелей 45
2.7.4 Цитотоксичность криогелей
2.7.4.1 Цитотоксичность в отношении фибробластов 45
2.7.4.2 Цитотоксичность в отношении эритроцитов 46
2.8 Исследование противоспаечной активности криогелей 47
2.8.1 Оценка противоспаечной активности криогелей in vivo 47
2.8.2 Гистологический анализ 48
2.8.3 Деградация криогелей in vivo 48
2.9 Статистический анализ 49
3. Результаты и обсуждение 50
3.1. Характеристики полисахаридов, используемых в работе 50
3.2. Получение криогелей на основе пектина и хитозана 53
3.3. Исследование структуры и состава криогелей
3.3.1. ИК-спектроскопия 56
3.3.2. Элементный анализ 57
3.3.3. Морфология поверхности криогелей 58
3.3.4. Внутренняя структура криогелей 59
3.4. Исследование физико-химических свойств криогелей 60
3.4.1. Способность к набуханию криогелей 60
3.4.2. Адгезия криогелей к внутренней поверхности брюшной стенки крыс 62
3.4.3. Прочность криогелей 63
3.4.4. Модуль упругости криогелей 64
3.4.5. Деградация криогелей in vitro
3.4.5.1. Изменения в морфологии криогелей в ходе деградации 66
3.4.5.2. Изменение прочности криогелей при деградации in vitro 68
3.5. Исследование биосовместимости криогелей 69
3.5.1. Адсорбция белков сыворотки крови 69
3.5.2. Активация системы комплемента криогелями 70
3.5.3. Адгезия макрофагов к поверхности криогелей 71
3.5.4. Цитотоксичность криогелей
3.5.4.1. Цитотоксичность в отношении фибробластов 73
3.5.4.2. Цитотоксичность в отношении эритроцитов 74
3.6. Исследование противоспаечной активности криогелей 75
3.6.1. Оценка противоспаечной активности криогелей 75
3.6.2. Гистологический анализ 78
3.6.3. Деградация криогелей in vivo 81
3.6.3.1. Изменение прочности криогелей при деградации in vivo 84
Заключение 86
Выводы 88
Список публикаций по теме диссертации 89
Список используемых сокращений 91
Список литературы 93
- Биоматериалы в лечении спаек
- Очистка хитозана переосаждением
- Оценка противоспаечной активности криогелей in vivo
- Исследование биосовместимости криогелей
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Одной из актуальных задач современной биотехнологии и медицины
является создание новых биоматериалов для различных областей применения, в
том числе для предотвращения спайкообразования после хирургических
вмешательств. По данным Международного общества изучения спаек проблема
послеоперационного спайкообразования является самым частым осложнением
хирургических вмешательств на органах брюшной полости. Спаечный процесс
может вызвать бесплодие или внематочную беременность у женщин, тазовые
боли, кишечную непроходимость и пр. [Мазитова, 2007; Bolnick, Bolnick,
Diamond, 2015; Trew, 2006]. Внутрибрюшные спайки являются причиной
повторных операций, увеличения продолжительности наркоза,
неудовлетворительных результатов лечения и низкого качества жизни. Болезнь поражает преимущественно пациентов молодого, трудоспособного возраста, что приводит к социальным проблемам. Консервативное лечение спаечной болезни малоэффективно, а надежные средства профилактики, по мнению многих авторов, отсутствуют [Diamond, El-Mowafi, 1998; Wiseman, Gottlick-Iarkowski, Kamp, 2001].
В последние годы активно разрабатываются и внедряются в клиническую
практику различные барьерные противоспаечные материалы. Использование для
предотвращения спаечной болезни барьерных материалов оказывает влияние на
патогенез спайкообразования. Данные биоматериалы действуют как физические
барьеры – разобщают раневые поверхности на время, необходимое для
регенерации повреждений брюшины, препятствуют их склеиванию фибрином и
спайкообразованию. Идеальный барьерный материал должен быть эффективным,
биосовместимым, полностью биоразлагаемым без необходимости удаления, а
также закрепляться на поврежденных поверхностях без дополнительной
фиксации и оставаться активным в присутствии экссудата [Cheung и др., 2009].
Наиболее полно требованиям, предъявляемым к барьерным материалам,
соответствуют биоматериалы на основе природных полисахаридов.
Полисахариды широко используются для создания биоматериалов благодаря их биосовместимости, биоразлагаемости, низкой токсичности и целому ряду биологических свойств [Lih и др., 2015].
Среди природных полисахаридов выделяются пектин и хитозан как
наиболее перспективные полимеры для получения противоспаечных барьерных
материалов. Молекулы хитозана в растворе при рН менее 6,3-6,5 присутствуют в
катионной полиэлектролитной форме, что открывает возможность
взаимодействия с отрицательно заряженными молекулами пектина. Пектин с низкой степенью метилэтерифицирования способен к гелеобразованию в
присутствии двухвалентных ионов металлов, что позволяет получать материалы на его основе без использования токсичных сшивающих агентов. Для извлечения биоматериалов на основе пектина и хитозана нет необходимости в повторных операциях, так как они являются биодеградируемыми, а также не требуется дополнительная фиксация к тканям, благодаря биоадгезивным свойствам полимеров [Mati-Baouche и др., 2014; Sriamornsak, Wattanakorn, Takeuchi, 2010]. Еще одним преимуществом пектина и хитозана является то, что они обладают биологическими свойствами (антиоксидантная, антимикробная, гемостатическая активность), которые способствуют снижению спайкообразования [Ahmed, Ahmad, Ikram, 2014; Huang и др., 2015; Popov и др., 2014; Xing и др., 2005].
Таким образом, противоспаечные барьерные материалы на основе пектина и хитозана наряду с механическим разделением поврежденных поверхностей, выполняют функцию биологически активного компонента, ингибирующего процесс спайкообразования. В связи с этим получение и исследование противоспаечных барьерных материалов на основе биополимеров пектина и хитозана является актуальной задачей.
Цель и задачи исследования
Целью диссертационной работы является получение материалов на основе пектина и хитозана, исследование их свойств, а также экспериментальное обоснование возможности использования для профилактики послеоперационного спаечного процесса в брюшной полости.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
-
Получить и охарактеризовать образцы пектина из различных источников и образцы хитозана, отличающиеся по степени дезацетилирования (СД) и молекулярной массе (ММ);
-
Разработать способ получения материалов на основе пектина и хитозана;
-
Исследовать влияние физико-химических характеристик и структурных особенностей используемых полисахаридов на свойства материалов;
-
Исследовать биосовместимость разработанных материалов in vitro;
-
Оценить противоспаечную эффективность материалов на основе пектина и хитозана in vivo.
Научная новизна работы
Разработан способ получения материалов на основе полисахаридов пектина и хитозана. Впервые получены и охарактеризованы криогели на основе пектина из различных источников и хитозана с разной СД и ММ. Показано влияние физико-химических характеристик и структурных особенностей используемых полисахаридов на свойства материалов. Исследована биосовместимость криогелей на основе пектина и хитозана, установлена зависимость
биосовместимости от состава криогелей. Впервые показано, что криогели на основе яблочного пектина с добавлением хитозана обладают противоспаечной эффективностью, которая зависит от характеристик используемого для получения материалов хитозана.
Практическая значимость работы
На основе полисахаридов растительного и морского происхождения создан хирургический барьерный материал, ингибирующий спайкообразование в брюшной полости, представляющий собой лиофильно высушенный криогель, в котором массовое соотношение пектина и хитозана составляет 3:1. Показано, что наложение криогеля на основе яблочного пектина и хитозана на поврежденные поверхности брюшной стенки и слепой кишки экспериментальных животных достоверно снижает образование спаек по сравнению с контролем. Полученный криогель может найти применение в медицине как барьерный материал для профилактики спаечной болезни брюшной полости.
Положения, выносимые на защиту:
-
Разработан способ получения материалов на основе пектина и хитозана;
-
Показано, что включение хитозана с высокой СД в состав материалов увеличивает их механическую прочность и время деградации in vitro, а также усиливает адгезию материалов к внутренней поверхности брюшной стенки экспериментальных животных.
-
Установлено, что криогели на основе яблочного пектина и хитозана обладают высокой биосовместимостью.
-
Криогели на основе яблочного пектина и хитозана имеют низкую иммуногенность: в слабой степени адсорбируют белки сыворотки крови, не активируют систему комплемента, вызывают низкую адгезию макрофагов к поверхности.
-
Криогели на основе яблочного пектина и хитозана ингибируют образование спаек в брюшной полости, индуцированных повреждением серозной оболочки слепой кишки и прилежащего участка брюшной стенки крыс:
а) СД и ММ хитозана, входящего в состав материалов, оказывает
влияние на противоспаечную активность;
б) противоспаечный эффект обеспечивается за счет небольшого времени
деградации криогелей на основе яблочного пектина.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены автором в виде устных и стендовых сообщений на молодёжной научной школе “Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии” (Москва, Россия, 2014); «22st annual international conference on composites/nano engineering» (Сент-Джулианс, Мальта, 2014); VII московском международном конгрессе
«Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2015); XIII Международной Конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана" (Уфа, Россия, 2016).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК РФ.
Личный вклад автора в проведение исследования
Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором и совместно с сотрудниками лаборатории инженерии биополимеров Института биоинженерии ФИЦ биотехнологии РАН, а также совместно с сотрудниками отдела молекулярной иммунологии и биотехнологии Института Физиологии Коми научного центра УрО РАН. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей.
Объем и структура диссертации
Материалы диссертации изложены на 118 страницах машинописного текста и включают 28 рисунков и 5 таблиц. Диссертация содержит разделы: Введение, Литературный обзор, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы и Список литературы, включающий 250 наименований.
Автор выражает благодарность научному руководителю к.х.н. Д. В. Куреку и заведующему лабораторией инженерии биополимеров д.х.н., профессору В. П. Варламову за предоставленную возможность проведения исследований, заведующему отделом молекулярной иммунологии и биотехнологии, д.б.н., доценту С. В. Попову за неоценимую помощь в планировании и выполнении диссертационного исследования, к.б.н. П.А. Маркову, Г.Ю. Поповой и всем сотрудникам отдела молекулярной иммунологии и биотехнологии Института физиологии Коми научного центра УрО РАН за ценные консультации и всестороннюю помощь и поддержку, к.х.н. А.А. Злобину, к.т.н. Е.А. Мартинсон за предоставление некоторых образцов полисахаридов, к.м.н., доценту К.В. Шумихину за гистологическое исследование образцов тканей, к.б.н. Р.А. Ракитову, Е.А. Дурневу за изучение структуры криогелей методом СЭМ, к.х.н. Лопатину С.А. за определение молекулярно-массовых характеристик хитозана методом ВЭЖХ, к.х.н. А.В. Ильиной за ценные советы и помощь в работе, к.х.н. А.А. Зубаревой, к.б.н. Т.С. Лялиной и аспирантам лаборатории инженерии биополимеров Б.Ц. Шагдаровой, Л.М. Хантимировой за поддержку и оказанное внимание.
Биоматериалы в лечении спаек
Спайки – это соединительно-тканные матрицы, состоящие из коллагена и фибрина. Само слово «спайка» подразумевает сращение, объединение двух поверхностей или их частей. Спаечный процесс может вызвать бесплодие или внематочную беременность у женщин, тазовые боли, кишечную непроходимость и т.д. [1–3]. Внутрибрюшные спайки являются причиной повторных операций, увеличения продолжительности наркоза, неудовлетворительных результатов лечения и низкого качества жизни. Спайки увеличивают частоту ранних послеоперационных осложнений до 50 % [49]. Частота образования спаек после первого хирургического вмешательства может варьировать от 10,4 % до 67 %, после повторных полостных операций частота составляет от 90 % до 100 % случаев [50]. В связи с этим, профилактика образования спаек является актуальной проблемой.
Причины спайкообразования многочисленны. Их подразделяют на несколько групп:
1) механический фактор – травма брюшины при рассечении, захвате хирургическими инструментами, промокании и протирании сухими марлевыми салфетками;
2) физический фактор – высушивание брюшины воздухом, воздействие высокой температуры во время операции при использовании плазменного скальпеля, электроножа, горячих растворов, лазерного излучения;
3) инфекционный фактор – инфекция в брюшной полости может быть эндогенного (воспаление органов брюшной полости с развитием местного и общего воспаления брюшины) и экзогенного (при ранении, прободении, вскрытии полого органа брюшной полости) происхождения;
4) имплантационный фактор – асептическое воспаление брюшины в результате попадания инородного материала (тампонов, дренажных трубок, не рассасывающегося или длительно рассасывающегося шовного материала, кусочков марли, талька с перчаток) в брюшную полость или кровоизлияний и гематом брюшины в результате использования не атравматических игл;
5) химический фактор – асептическое воспаление брюшины из-за использования во время операции веществ, вызывающих химический ожог (спирт, концентрированные растворы антибиотиков, фурацилина и др.).
При выполнении хирургических операций все перечисленные выше факторы в отдельности или в совокупности могут вызвать развитие воспалительного процесса, приводящего к образованию спаек в брюшной полости, поэтому оперативное вмешательство стоит на первом месте среди непосредственных причин спайкообразования [51–53].
Патофизиологический механизм спайкообразования в настоящее время до конца не изучен, но доказан общий центральный путь, в котором важную роль играет перитонеальный фибринолиз. Обычно образование спаек происходит вследствие воздействия на брюшину как локальный ответ, вовлекающий перитонеальную поверхность, мезотелиальные клетки, базальную мембрану, субэндотелиальную соединительную ткань. Воздействие на брюшину приводит к каскаду реакций, которые могут вызвать восстановление брюшины при сбалансированности процессов заживления или образование спаек при нарушении.
Перитонеальная поверхность представляет собой серозную мембрану, которая выстлана мезотелиальными клетками. Клетки слабо связаны с базальной мембраной, под которой лежит экстрацеллюлярный матрикс. Экстрацеллюлярный матрикс содержит множество компонентов, необходимых для заживления, в том числе коллаген, фибронектин, гликопротеины, фибробласты, макрофаги [54,55].
В ответ на повреждение развивается воспалительная реакция, которая характеризуется повышенной проницаемостью сосудов, увеличением количества воспалительных клеток в месте повреждения, высвобождением медиаторов воспаления этими клетками и увеличением оборота белков экстрацеллюлярного матрикса. Активация тучных клеток стромы высвобождает гистамин и кинины, которые повышают проницаемость сосудов, что приводит к экссудации жидкости с высоким содержанием белка, который образует временную матрицу, содержащую фибрин, гистамин, моноциты, клетки плазмы, полиморфноядерные клетки, макрофаги, мезотелиальные клетки [54,56]. Эта жидкость коагулирует в течение 3 ч, образует волокнистые тяжи между поврежденными поверхностями и сохраняет их контакт [56].
Локальное повреждение сосудов приводит к нарушению монослоя клеток эндотелия и высвобождению фактора фон Виллебранда, а также тканевого фактора, которые присутствуют в стенках сосудов. Фактор фон Виллебранда связывается с тромбоцитами и поддерживает взаимодействие между ними, что приводит к их слипанию и образованию тромба. Прикрепленные тромбоциты подвергаются активации и выделяют вещества, которые способствуют дальнейшему образованию тромбина [57]. Тромбин вызывает образование фибрина из фибриногена внутри сосудов, но при экссудации этот процесс происходит внутрибрюшинно. Образование отложений фибрина на травмированной области создает матрицу для миграции воспалительных клеток и последующего восстановления слоя мезотелия или образования спаек. Лейкоциты мигрируют в место повреждения. Нейтрофилы запускают каскад цитокинов. Экспериментально доказано, что многие из цитокинов, обнаруженных в перитонеальной жидкости после травмы, играют важную роль в последующем образовании спаек [58–60].
Другие клеточные популяции также играют определенную роль в воспалительной фазе восстановления. Перитонеальные макрофаги вызывают иммунные реакции, лежащие в основе образования спаек. Макрофаги появляются на поврежденных участках в течение 24 ч, адгезируются на месте повреждения, и сохраняются даже после полного восстановления мезотелиального слоя [61]. В ответ на повреждение, макрофаги повышают фагоцитарную, секреторную активность; они также привлекают новые мезотелиальные клетки и фибробласты [54]. Макрофаги высвобождают хемокин (С-С мотив) лиганд 1 (CCL1) и его рецептор хемокин (С-С мотив) рецептор 8 (CCR8) в ответ на повреждение. Экспериментально установлено, что уменьшение взаимодействия CCL1-CCR8 снижает перитонеальную миграцию макрофагов и спайкообразование [62].
Тучные клетки дегранулируются на участках восстановления, высвобождая фактор роста эндотелия сосудов и другие ангиогенные и вазоактивные молекулы, которые играют определенную роль в спайкообразовании [63]. Стабилизация тучных клеток для предотвращения дегрануляции уменьшает образование спаек на модели истирания слепой кишки экспериментальных животных [64].
Эозинофилы также присутствуют в областях образования спаек. Хотя их роль не ясна, наличие эозинофилов связано с меньшей пролиферацией фибробластов, возможно, за счет их антигистаминной активности.
Фибринолиз – разрушение фибрина – имеет большое значение для восстановления повреждений без образования спаек. Нормальный фибринолиз тормозит развитие спаек в течение 72 ч. Если волокнистые тяжи сохраняются в течение периода перитонеального восстановления (обычно 3-5 дней), то фибробласты мигрируют в фибринозную массу. Фибробласты, расположенные во внеклеточном матриксе, а также коллаген и фибронектин образуют каркас для слоя мезотелиальных клеток, что приводит к реэпителизации и образованию спаек [65].
Очистка хитозана переосаждением
Кровь здоровых доноров отбирали в вакуумные пробирки, содержащие антикоагулянт. Выдерживали в течение 2 ч при комнатной температуре, центрифугировали 600 g, 15 мин, 4 С. Отбирали сыворотку и разбавляли ее в 10 раз 0,9 % NaCl. Криогели помещали в 96-луночный планшет, предварительно добавляли по 100 мкл 0,9 % NaCl на лунку, выдерживали 3 мин и отбирали остатки раствора перед анализом. Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл сыворотки и инкубировали их в течение 2-х часов при 37 С без перемешивания. Криогели извлекали и оставшуюся фракцию белков измеряли методом Лоури с использованием бычьего сывороточного альбумина (БСА) в качестве стандарта [226]. Процент адсорбированных белков вычисляли количественно по разнице между общим содержанием белков в плазме и количеством белков, оставшихся не связанным с криогелем после инкубации.
Кровь здоровых доноров отбирали в вакуумные пробирки без антикоагулянта, выдерживали 2 ч при комнатной температуре, центрифугировали 600 g, 15 мин, 4 С. Простерилизованные УФ-излучением криогели помещали в 96-луночный планшет, выдерживали в течение 3 мин в 100 мкл 0,9 % NaCl. После удаления раствора NaCl к образцам добавляли по 100 мкл сыворотки крови и инкубировали при 37 С в течение 2 ч без перемешивания. Положительный контроль - 10 мкл зимозана из раствора концентрацией 1000 мкг/мл, отрицательный контроль – 10 мкл стерильного ФБР. Останавливали реакцию раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты до конечной концентрации в лунке 20 мМ [227]. Фрагмент C3a количественно определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с инструкцией от производителя («Hycult biotech», Нидерланды).
В 96-луночный планшет помещали образцы криогелей, простерилизованные УФ-излучением. Добавляли по 200 мкл среды DMEM (содержащей 10 % ФБС и 10 мкг/мл гентамицина), выдерживали 3 мин и отбирали остатки среды. Затем в лунки добавляли суспензию макрофагов линии J774 объемом 200 мкл из расчета 15 103 кл./лунку. Инкубировали в стандартных условиях 24 ч. Затем неадгезировавшиеся клетки отмывали ресуспендированием клеточной суспензии. Извлекали криогели, фиксировали клетки на криогеле 2,5 % глутаровым диальдегидом в течение 30 мин [226], окрашивали родамином и 4 ,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) («PanReac AppliChem», Германия). Затем подсчитывали количество клеток на каждом криогеле визуально с помощью флуоресцентного микроскопа Альтами ЛЮМ1 (ЗАО «ЛОИП», Россия).
Для оценки цитотоксичности криогелей использовали МТТ-тест на клетках мышиных фибробластов NIH-3T3. Клетки высевали на 96-луночные планшеты в количестве 4 103 на 100 мкл МЕМ (содержащей 10 % ФБС и 10 мкг/мл гентамицина), инкубировали при 37 C в атмосфере 5 % СО2. Через сутки, в лунки с иммобилизованными фибробластами помещали фрагменты криогелей размером 5 5 мм. Предварительно криогели стерилизовали УФ-облучением в течение 2 ч и выдерживали в 100 мкл МЕМ в течение 12 ч. Криогели инкубировали с клетками в течение 3 суток. Питательную среду меняли каждые сутки. Через каждые 24 ч часть образцов извлекали и оценивали метаболическую активность клеток. Оценку метаболической активности фибробластов проводили согласно методике [228,229], а именно: к культуре клеток в 100 мкл среды МЕМ на лунку добавили 10 мкл МТТ (5 мг/мл в ФБР) и инкубировали при 37 С в течение 4 ч. Затем добавляли 100 мкл раствора додецилсульфата натрия (SDS) (10 % SDS в 0,01 М НСl) и выдерживали в течение 8 ч в стандартных для выращивания культур условиях. Поглощение измеряли при 570 нм с использованием микропланшетного ридера Power wave 200 («Bioek instruments», США).
Для оценки цитотоксичности криогелей в отношении эритроцитов использовали тест на гемолиз. Кровь здоровых доноров отбирали в вакуумные пробирки, содержащие антикоагулянт. Выдерживали в течение 2 ч при комнатной температуре. Центрифугировали 350 g, 15 мин, 4 С. Затем эритроциты извлекали, промывали 4 раза и разбавляли в 10 раз 0,9 % NaCl. Криогели помещали в 96-луночный планшет, выдерживали в течение 3 мин в 100 мкл 0,9 % NaCl. После удаления раствора NaCl в каждую лунку добавляли по 200 мкл суспензии эритроцитов и инкубировали их в течение 1 ч при 37 С без перемешивания. Затем планшет центрифугировали (100 g, 5 мин), из лунок отбирали по 100 мкл супернатанта и измеряли оптическую плотность при 540 нм с использованием микропланшетного ридера Power wave 200 («Bioek instruments», США). В качестве положительного контроля в кровь добавляли дистиллированную воду (20 мкл), в качестве отрицательного контроля - 0,9 % NaCl (20 мкл). Уровень гемолиза высчитывали в соответствии с уравнением (7) [230]:
Уровень гемолиза = 0D - х 100 %, (7) где ODo6p. - оптическая плотность измеряемого образца; ODomp,KOHmp. - оптическая плотность отрицательного контроля; ODnojlOMaKOHmp. - оптическая плотность положительного контроля.
Эффективность разработанных криогелей оценивали в условиях развития спаечного процесса у лабораторных животных. Спаечную болезнь моделировали у крыс-самок линии Wistar, весом 180-200 г.
Вдоль срединной линии передней стенки брюшной полости делали разрез длиной приблизительно 3 см. Слепую кишку извлекали, и участок поверхности площадью 1 1 см растирали до получения точечных кровотечений. Участок мышечного слоя размером 1 1 см на прилежащей к слепой кишке боковой стенке брюшной полости растирали до получения точечных кровотечений, используя стерильный абразивный материал. Поврежденная слепая кишка была помещена обратно в брюшную полость вблизи поврежденной стенки брюшной полости. Опытным животным между поврежденными поверхностями прокладывали смоченный в стерильном физиологическом растворе в течение 3 мин криогель размером 1,5 1,5 см. Контрольная группа крыс не получала обработки раневых поверхностей перед закрытием брюшной полости. После завершения процедуры, брюшная полость была закрыта швами с шелковой нитью 3-0, а кожа была закрыта швами с шелковой нитью 4-0.
Через 7 суток после операции животных подвергали эвтаназии с использованием метода цервикальной дислокации. Брюшную полость вскрывали U-образный разрезом и проводили слепую оценку степени тяжести спаек по шкале спайкообразования [196]. Фотоизображения, соответствующие баллам шкалы оценки спайкообразования, полученные в ходе работы, представлены на рисунке 3.
Оценка противоспаечной активности криогелей in vivo
Содержание азота в образцах хитозана и полученных пектин-хитозановых криогелях определяли с использованием элементного анализа. В таблице 3 представлены результаты оценки состава пектин-хитозановых криогелей. Массовый процент хитозана в криогеле рассчитывали по содержанию азота в образце. Полученные значения от 3,50 до 15,03 % для криогелей на основе ПЯ и от 9,44 до 17,64 % для криогелей на основе ПБ указывают на различия в конечном составе образцов криогелей. Содержание хитозана в криогелях на основе ПБ выше, чем в образцах на основе ПЯ, несмотря на одинаковое начальное массовое соотношение полисахаридов (пектин/хитозан – 3:1). Этот результат может объясняться различной плотностью ионизированных групп в пектинах. ПБ (СМ 9 %) имеет большее количество свободных карбоксильных групп, чем ПЯ (СМ 36 %), поэтому процентное содержание хитозана в криогелях на основе ПБ больше. Однако оно не достигает 25 %, что показывает неполное включение хитозана в композицию криогеля. Процентное содержание хитозана в криогеле также зависит от характеристик самого хитозана: наибольшее содержание наблюдается при использовании образца с низкой ММ и высокой СД. Сила электростатического связывания пектина и хитозана увеличивается с увеличением количества свободных аминогрупп, а с уменьшением размера увеличивается возможность проникновения молекул хитозана в структуру пектинового криогеля, благодаря чему Хит25/98 присутствует в образцах криогеля в большем количестве. Таблица 3 – Результаты элементного анализа и оценки состава криогелей на основе пектина и хитозана
Проявление биологической активности материалов может быть связано не только с составом и активностью используемых полимеров, но и с их макромолекулярной организацией. Методы микроскопии позволяют исследовать морфологию поверхности, а также микро- и макроструктуру биоматериалов. Морфология поверхности криогелей на основе пектина и хитозана была изучена с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Результаты исследования представлены на рисунке 8. Показано, что включение хитозана в состав криогеля изменяет морфологию его поверхности. В частности, на поверхности криогеля ПЯ-Хит25/98 наблюдаются протяженные гребнеобразные выступы, отсутствующие на поверхности криогеля ПЯ. Напротив, криогель ПЯ-Хит200/95, имеет более гладкую поверхность, чем криогель ПЯ. Криогели из ПБ в целом имеют более шероховатую поверхность, характеризующуюся наличием складок и выступов.
Исследовано влияние структурных особенностей и характеристик полисахаридов на следующие физико-химические свойства криогелей: способность к набуханию, адгезию к внутренней поверхности брюшной стенки крыс, механическую прочность, модуль упругости, деградацию in vitro.
Напрямую с внутренней структурой связана способность к набуханию. Способность к набуханию является важным свойством материалов, применяемых в биомедицине, так как влияет на взаимодействие клеток с материалами. Результаты оценки способности к набуханию in vitro представлены на рисунке 10. Установлено, что пектин-хитозановые криогели на основе ПЯ набухают в ФБР в большей степени, чем криогели на основе ПБ. Хитозан не влияет на способность криогелей к набуханию в ФБР, которая составляет 11,5-13,7 и 5,6-9,9 г/г для криогелей на основе ПЯ и ПБ соответственно. Высокая способность к набуханию криогелей на основе ПЯ объясняется более пористым внутренним строением данных криогелей по сравнению с криогелями из ПБ.
Рисунок 10 – Способность к набуханию криогелей на основе ПЯ и ПБ in vitro. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (n = 3)
Способность к набуханию in vivo оценивалась гравиметрически после инкубации пектин-хитозановых криогелей в брюшной полости крыс в течение 1 ч Данные представлены на рисунке 11. Полученные криогели способны поглощать большое количество воды: 12,3 г/г сухого криогеля на основе ПЯ и 17,1 г/г криогеля из ПБ соответственно. Обнаружено, что в наибольшей степени при инкубации в брюшной полости крыс набухают гомогенный криогель из ПБ и ПБ-Хит230/38 (17,1 ± 1,6 и 14,2 ± 2,0 г/г соответственно). Внесение хитозана не оказывает влияния на способность к набуханию in vivo. Криогели на основе ПБ набухают in vivo в течение 1 ч в большей степени, чем криогели на основе ПЯ. Более высокая способность к набуханию криогелей на основе ПБ in vivo, возможно, связана с большим увеличением его пористости под действием ферментов и клеток, содержащихся в перитонеальной полости. 18 16
Результаты измерений силы адгезии криогелей к внутренней поверхности брюшной стенки лабораторных крыс представлены на рисунке 12. Обнаружено, что сила адгезии криогелей на основе ПЯ выше, что может быть связано с высокой способностью к набуханию. Согласно дегидратационной теории адгезии, когда материал с высокой способностью к набуханию приводится в контакт с поверхностью тканей, наблюдается диффузия жидкости в материал, что способствует его первичному закреплению [247]. Показано, что сила адгезии криогелей к биологическим тканям увеличивается при внесении хитозана с высокой ММ и СД. Включение в состав пектиновых криогелей хитозана Хит150/98 увеличивает силу адгезии криогелей к внутренней поверхности брюшной стенки на 68 и 87 % для ПЯ и ПБ соответственно. Хитозан Хит200/95 увеличивает силу адгезии криогелей на основе ПЯ на 27 %, криогелей из ПБ – на 37 %.
Исследование биосовместимости криогелей
На рисунке 25 А представлено интактное животное, срезы тканей брюшной стенки и слепой кишки с неизмененной серозной оболочкой представлены на рисунке 25 Д и 25 И соответственно. В группе опытных животных, где в качестве барьерного материала применялся криогель ПЯ-Хит230/38 (рисунок 25 Б, Е, К) наблюдалось образование волокнистой соединительной ткани, в которой присутствуют гигантские клетки инородных тел. На рисунке 25 Е зона повреждения брюшной стенки представлена формирующейся грануляционной тканью с лимфоплазмоцитарной, макрофагальной инфильтрацией. Сверху виден мышечный слой, снизу – грануляционная ткань, в которой присутствуют срезы капилляров, фибробласты. Зона повреждения слепой кишки (рисунок 25 К) также представлена расширенным слоем грануляционной ткани, в котором присутствуют остатки криогеля, капилляры, волокна коллагена, а также обнаруживаются гигантские клетки инородных тел (рисунок 24 Б).
При использовании криогеля ПБ-Хит230/38 образуется фиброзная капсула (рисунок 25 В). Срез такой капсулы представлен на рисунке 25 Ж. Слева снизу фиброзная капсула, сверху – остатки криогеля с гомогенным эозинофильным содержимым. Стенки капсулы представлены молодой грануляционной тканью с наличием вытянутых клеток фибробластов, эозинофилов, макрофагов. Кроме того, присутствуют плотные, выровненные коллагеновые волокна, а также зрелые сосуды (рисунок 24 А). На рисунке 25 Л представлено содержимое капсулы в виде остатков криогеля и эозинофилов. На рисунке 25 Г контрольное животное, между поврежденными поверхностями брюшной стенки и слепой кишки которого не был проложен криогель, в результате чего образовалась утолщенная спайка с плоским прикреплением. Срез такой спайки показан на рисунке 25 З: снизу зона стенки слепой кишки, спаянная с брюшной стенкой справа вверху. Между ними грануляционная ткань с продуктивным воспалением. Грануляционная ткань более детально представлена на рисунке 25 М.
Результаты гистологического исследования тканей через 7 суток после имплантации криогелей показали, что при использовании криогеля ПЯ-Хит230/38 волокна коллагена более рыхлые, присутствуют гигантские клетки инородных тел и остатки криогеля, включенные в состав грануляционной ткани, что свидетельствует об активном разрушении криогелей на основе ПЯ. При использовании криогелей на основе ПБ, на 7 сутки гигантские клетки инородных тел не обнаруживаются, не разрушенный криогель изолирован от внутренней среды брюшной полости в фиброзную капсулу, содержащую плотные волокна коллагена и новообразованные сосуды. Криогели на основе ПЯ способны разрушаться под действием макрофагов и гигантских клеток инородных тел, в результате чего фиброзная капсула не образуется. Дефекты слепой кишки и брюшной стенки, обработанной криогелями на основе яблочного пектина и хитозана, полностью восстанавливались на 7 день после операции, что, по-видимому, связано с положительным влиянием хитозана на восстановление мезотелиальных клеток, описанным в литературе [176]. Таким образом, возможный механизм предотвращения спайкообразования криогелями из ПЯ может заключаться в сочетании барьерной функции и биоактивности полисахаридов.
Для определения времени полной биодеградации пектин-хитозановых криогелей образцы помещались в брюшную полость лабораторных крыс на 1, 4, 24 и 168 ч. В ходе определения времени биодеградации было выявлено, что через 4 ч нахождения в брюшной полости все криогели на основе ПЯ теряют форму и разрушаются при извлечении из брюшной полости. Полная биодеградация криогелей наступает через 24 ч инкубации (рисунок 26)
Фотоизображения экспериментов на животных по исследованию биодеградации криогелей на основе ПЯ через 1 ч, 4 ч и 24 ч При использовании криогелей на основе ПБ разрушения криогеля не происходит, он присутствует в брюшной полости и через 1, 4 ч. Через 168 ч в брюшной полости образуется фиброзная капсула, в которую заключен криогель (рисунок 27). ч ч
Фотоизображения экспериментов на животных по исследованию биодеградации криогелей на основе ПБ через 1, 4 и 168 ч Способность ингибировать спаечный процесс, вероятно, связана со временем биодеградации криогелей. Криогели на основе ПЯ ингибируют образование спаек в брюшной полости крыс, тогда как криогели на основе ПБ подобным эффектом не обладают. При этом время деградации криогелей из ПЯ составляет 24 ч. В результате быстрого разрушения структуры криогеля из ПЯ происходит высвобождение его компонентов, которые равномерно покрывают поврежденные поверхности, тем самым, физически отделяя их друг от друга и предотвращая образование спаек в брюшной полости. В отличие от них, биодеградация криогелей из ПБ протекает медленно, и через 168 ч криогель присутствует в брюшной полости, заключенный в фиброзную капсулу.
При вычислении изменения прочности криогелей в ходе деградации in vivo за 100 % принимали прочность материалов до инкубации в брюшной полости крыс. Результаты, полученные в ходе работы, представлены на рисунке 28. Через 1 ч нахождения в брюшной полости крыс прочность криогеля из ПЯ снижается и составляет 44 % от начальной. Прочность криогелей на основе ПЯ, содержащих хитозан, также снижается, при этом она составляет 14,5-20,5 % от начальной. Наиболее устойчивым к деградации in vivo среди криогелей на основе ПБ является криогель, содержащий высокомолекулярный хитозан с высокой СД Хит200/95. Его прочность снижается только до 65 % от начального значения. Прочность остальных образцов криогелей на основе ПБ составляет 38-49 % от начальной. Полученные результаты подтверждают, что свойства пектин-хитозанового криогеля зависит от характеристик и особенностей строения, как пектина, так и хитозана, входящих в его состав.