Содержание к диссертации
Введение
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
1.1 Характеристика IgA-протеаз 13
1.1.1 Открытие IgA-протеаз 13
1.1.2 Секреторный иммунитет. Структура сывороточного и секреторного IgA 15
1.1.3 Структура генов IgA-протеаз и экспрессия их продуктов в грамотрицательных бактериях 18
1.1.4 Методы обнаружения IgA-протеаз и определение активности 19
1.1.5 Очистка IgA 1 -протеаз и IgA 1 19
1.1.6 Гидролиз IgAl и специфичность IgA-протеаз 21
1.1.7 IgAl-протеазы как фактор вирулентности 23
1.2 Проблема вакцинации против менингита и менингококковая IgAl-протеаза 25
1.3 Факторы патогенности и вирулентности N.meningitidis 32
1.4 Питательные среды для культивирования менингококков 34
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 36
2.1 Микроорганизмы, задействованные в работе и методики по работе с ними 36
2.1.1 Проверка биохимических, морфологических и серологических свойств N. meningitidis 37
2.1.2 Определение чувствительности штаммов N.meningitidis к антибактериальным препаратам 37
2.1.3 Подбор питательной среды для штаммов N. meningitidis 3 8
2.1.4 Подготовка посевного материала 40
2.1.5 Глубинное культивирование штаммов N. meningitidis 41
2.2 Определение ферментативной активности IgAl-
протеазы 42
2.2.1 Выделение иммунохимически чистых IgAl и IgA2 42
2.2.2 Иммунизация животных 43
2.2.3 Выделение IgG из кроличьей антисыворотки 44
2.2.4 Получение конъюгата антител к IgA с пероксидазой хрена 45
2.2.5 Определение разведения конъюгата 46
2.2.6 Качественный метод определения ферментативной активности IgAl-протеазы методом ИФА 48
2.2.7 Количественный метод определения ферментативной активности IgAl-протеазы 49
2.3 Выделение и очистка IgA-протеазы 51
2.3.1 Предварительная обработка культуральной жидкости и концентрирование 51
2.3.2 Очистка на высокопористом силохроме 51
2.3.3 Очистка на фенилсефарозе 52
2.3.4 Гель-фильтрация 52
2.4 Свойства IgAl-протеазы 53
2.4.1 Определение изоэлектрической точки IgAl-протеазы 53
2.4.2 Определение констант ингибирования IgAl-протеазы 5
3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 54
3 Культивирование N. meningitidis 55
3.1 Проверка морфологических, биохимических и серологических свойств штаммов N. meningitidis 55
3.2 Определение чувствительности штаммов N. meningitidis к антибактериальным препаратам 57
3.3 Подбор плотной питательной среды для штаммов N. meningitidis 58
3.4 Подбор жидкой питательной среды для штаммов N. meningitidis 60
3.5 Выбор штамма N. meningitidis для культивирования 63
3.6 Подготовка посевного материала 65
3.7 Глубинное культивирование штаммов N. meningitidis 66
4 Определение ферментативной активности IgAl- 68
протеазы
4.1 Качественный метод определения ферментативной активности IgA 1 -протеазы 6 8
4.2 Количественный метод определения ферментативной активности IgAl-протеазы 72
5 Выделение и очистка IgAl-протеазы 75
5.1 Предварительная обработка культуральной жидкости 75
5.2 Очистка на высокопористом силохроме 76
5.3 Гидрофобная хроматография на фенилсефарозе 79
5.4 Гель-фильтрация на сефарозе CL-6B 81
5.5 Схема очистки и данные по выходу фермента 83
6 Свойства IgAl-протеазы 85
6.1 Определение молекулярной массы IgAl - протеазы 85
Определение изоэлектрической точки IgAl - протеазы 86
Определение констант ингибирования для IgAl - протеазы 87
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 88
ВЫВОДЫ 90
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 91
ЛИТЕРАТУРА 92
- Открытие IgA-протеаз
- Подбор питательной среды для штаммов N. meningitidis
- Проверка морфологических, биохимических и серологических свойств штаммов N. meningitidis
Введение к работе
Актуальность проблемы
В течение нескольких последних лет активно изучаются IgAl-протеазы - ферменты, секретируемые некоторыми патогенными микроорганизмами и расщепляющие в IgAl (подкласс IgA человека), единственную пептидную связь Pro - X в шарнирной области[1 - 3].
Менингококковая IgAl-протеаза представляет значимый научный интерес, являясь фактором вирулентности и наряду с ЛПС, считается ответственной за заболевание менингококковым менингитом [4 - 7]. Известно, что в защите организма человека от менингококковой инфекции основную роль играет система комплемента, а также IgA [8]. Для изучения значения IgA в иммунной защите от микроорганизмов (в частности N. meningitidis) при аллергических и аутоиммунных заболеваниях необходимы детальные исследования механизмов действия сывороточных и секреторных IgA, а также Fab- и Fc - фрагментов, на которые расщепляются сывороточный и секреторный IgAl при ферментативном действии IgAl-протеазы. Для решения этих задач необходим очищенный фермент [8, 9].
Кроме того, на основе действия IgAl-протеазы может быть предложен иммуноферментный метод, позволяющий выявлять больных, инфицированных менингококками, а также носителей, уже на ранних стадиях заболевания в больших массах населения, что в настоящее время при бактериологическом определении [10 - 12] не представляется возможным.
Наконец, если IgAl-протеаза действительно играет одну из основных ролей в развитии менингита, то возможно, что она нужна, естественно в ферментативно неактивном виде для получения эффективной антименингококковой вакцины (или в качестве компонента существующей полисахаридной вакцины) [15, 17, 18].
Получать IgAl-протеазу можно двумя способами: либо генно-инженерным, либо очисткой из культуральной жидкости N. meningitidis. К началу нашей работы были попытки
10 получения рекомбинантного фермента. Однако активность IgAl -протеаз, выделенных из телец включения Е. coli, составляла около 2 % от активности фермента, секретируемого клетками менингококка [15]. Вероятно, должны быть созданы другие конструкции, работающие под контролем сильных промоторов. Для секреции IgAl-протеазы - белка с молекулярной массой более 100 кДа- перспективны системы, позволяющие включать в состав плазмид гены крупных белков, например, бакуловирусная, хотя последняя используется чаще для получения эукариотных белков[17,18].
Выделение и очистка IgAl-протеазы из культуральной жидкости N. meningitidis биохимическим путем, несмотря на очевидные трудности работы с патогенной культурой, представляется более плодотворной. Так, холерный токсин очищали из культуральной жидкости Cholera vibriae для получения вакцины в биореакторе объемом до 1000 л [19]. Даже если впоследствии окажется, что получение генно-инженерного белка более перспективно, приемы и методы очистки, использованные в данной работе, можно будет применять для выделения рекомбинантного фермента. Кроме того, фермент, полученный этим путем, можно использовать для определения биохимических свойств и создания на его основе вакцины.
Цель работы. Выделение, очистка IgAl-протеазы, секретируемой клетками N.meningitidis, и изучение ее биохимических свойств.
Задачи исследования: отобрать штамм N. meningitidis с хорошей секрецией IgAl-протеазы; подобрать оптимальную питательную среду для глубинного культивирования N. meningitidis; - разработать схему очистки IgAl-протеазы из культуральной жидкости N. meningitidis; - разработать метод определения ферментативной активности IgAl-протеазы;
11 - изучить некоторые свойства IgAl-протеазы (определить изоэлекрическую точку, константы ингибирования активности фермента, молекулярную массу).
Научная новизна. Получена электрофоретически чистая менингококковая IgAl- протеаза, обладающая ферментативной активностью в отношении IgAl человека.
Охарактеризованы некоторые физико-химические и биохимические свойства (молекулярная масса, pi, К(). Разработан метод очистки белков на высокопористом силохроме (кремнеземный сорбент). Разработан метод ИФА для определения ферментативной активности IgAl-протеазы.
Практическая значимость. Разработана питательная среда на основе гидролизата Хоттингера для глубинного культивирования N. meningitidis, обеспечивающая максимальный рост биомассы и максимальный выход IgAl-протеазы.
Высоко чувствительный метод ИФА для определения ферментативной активности позволяет качественно и количественно определять активность IgAl-протеазы (подана заявка на патент - Л.В. Козлов, СВ. Романов, В.Л. Дьяков, В.И. Суровцев, М.Г. Теймуразов MKH7G 01 N33/53).
Предложенный метод выделения и очистки IgAl-протеазы может быть использован для выделения и очистки IgAl-протеаз, секретируемых другими микроорганизмами. Очистка на силохроме может быть использована для широкого ряда белков, особенно на первой стадии, и в условиях большого объема культуральной жидкости.
IgAl-протеаза может быть применена для создания иммуноферментного метода для выявления больных и носителей менингококков, а также решения вопроса о ее использовании в антименингококковой вакцине и изучения ее роли в патогенезе заболевания.
12 Положения, выносимые на защиту.
Глубинное культивирование N. meningitidis на питательной среде на основе гидролизата Хоттингера способствует максимальному выходу биомассы и секреции IgAl-протеазы.
Разработанный метод ИФА является оптимальным для определения активности IgAl-протеазы.
Выход электрофоретически чистой IgAl-протеазы достигается проведением ее очистки на высокопористом силохроме с последующей гидрофобной хроматографией и гель-фильтрацией.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на XVII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, февраль 2005), межлабораторном научном семинаре ГНЦПМ (Оболенск, май 2005). По результатам работы готовится к публикации статья -В.И. Суровцев, М.Г. Теймуразов, Л.В. Козлов, Ю.И. Хатюшин, Т.В. Федоров, В.Л. Дьяков, М.С. Христин. Получение менингококковой IgAl-протеазы. Журнал «Биотехнология» 2006, 3, с. 37-41.
Публикации:
Всего опубликовано семь научных работ, по результатам диссертации опубликовано три научные работы.
В.В. Гусев, Э.А. Светоч, Н.К. Глазков, М.Г. Теймуразов, СИ. Павлов/ Мониторинг бактериальных инфекций в промышленном свиноводстве.// Ветеринария, 2004, №2, с. 7-8.
М.Г. Теймуразов, В.И. Суровцев, Т.В. Федоров, Ю.И. Хатюшин. Питательная среда для культивирования менингококков с целью выделения и очистки IgAl-протеазы. -материалы XVII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, февраль 2005).
13 3. М.Г. Теймуразов, В.И. Суровцев, Т.В. Федоров, В.М. Борзенков. Выделение и очистка менинго кокковой IgAl-протеазы. - материалы XVII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, февраль 2005).
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на
107 страницах. Текст содержит 12 таблиц и 20 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, четырех глав с изложением результатов собственных, заключения, выводов. Библиографический указатель содержит
40 отечественных и 110 иностранных работ.
Открытие IgA-протеаз
Известно, что из пяти классов иммуноглобулинов человека (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE) секреторные иммуноглобулины класса А (подклассы IgAl и IgA2) наиболее устойчивы к протеолизу [20, 21]. Эта устойчивость является биологически целесообразным свойством, поскольку секреторный IgA предназначен для функционирования во внешних секретах, где велико содержание протеаз. Однако в семидесятые годы было показано, что некоторые бактерии продуцируют ферменты, расщепляющие IgAl (секреторный и сывороточный) на классические Fab- и Fc-фрагменты, что обычно приводит к исчезновению протективных свойств.
Первой была исследована протеаза S. sanguis, которая, как и многие другие, оказалась специфичной лишь к IgAl [22, 23]. К настоящему времени такие ферменты обнаружены как у грамотрицательных (род Neisseria и др.), так и у грамположительных (род Streptococcus и др.) патогенных бактерий. Все они расщепляют шарнирный участок IgAl с образованием Fab- и Fc- фрагментов.
Кроме «классических» IgAl-протеаз, описаны и другие, атакующие IgAl с дальнейшей деградацией Fab- и с сохранением Fc-фрагмента; с полной деградацией IgAl или обоих подклассов IgAl и IgA2, а также с расщеплением IgAl и IgA2m(l) - аллеля с образованием Fab- и Fc-фрагментов [23,24].
Подбор питательной среды для штаммов N. meningitidis
Для приготовления разведений использовали основной раствор антибактериального препарата. Навеску бензилпенициллина растворяли 0,07 М фосфатном буфере (рН 6,8 - 7,0) с таким расчетом, чтобы в 1 мл раствора содержалось 1 мг препарата. Основной раствор тетрациклина готовили на 0,01 М соляной кислоте также из расчета 1 мг антибиотика в 1 мл. Для приготовления основных растворов неомицина, гентамицина, полимиксина М, фуразолидона, энрофлоксацина («Вик», Россия; «Invesa», Испания; «Baier», Германия) использовали дистиллированную воду. Стрептомицин растворяли до концентрации 1 мг/мл в 0,05 М фосфатном буфере (рН 6,0 - 6,2). Левомицетин предварительно растворяли до концентрации 10 мг/мл в 96% этиловом спирте, а затем доводили до 1 мг/мл в 0,05 М фосфатном буфере (рН 6,0 - 6,2). Соответствующее количество (0,1 - 4,0 мл) основного раствора антибиотика вносили в маркированные стерильные чашки Петри, затем заливали 25 мл расплавленного и охлажденного СДА и тщательно перемешивали. Таким же образом готовили контрольную чашку с СДА без антибактериального препарата. После застывания агара чашки Петри подсушивали в термостате 1 - 2 ч. Чашки Петри, включая контрольную, засевали культурами нейссерий и инкубировали при 37 С в течение 20 - 24 ч. Минимальную концентрацию препарата, дающую полную видимую задержку роста или единичные колонии, принимали за МПК препарата. Она определяла степень чувствительности испытуемой культуры к антибактериальному препарату. В том случае, если отмечали рост на поверхности агара во всех чашках спектра разведения препарата, штамм считали устойчивым к соответствующему препарату. Отсутствие роста при всех разведениях препарата, кроме контрольного, означало, что исследуемые концентрации препарата превышали МПК.
Проверка морфологических, биохимических и серологических свойств штаммов N. meningitidis
Нами проведены исследования по определению чувствительности штаммов N. meningitidis к антибактериальным препаратам, с целью применения наиболее эффективных для инактивации выращенных культур. Это необходимое условие для обеспечения безопасности работ по выделению и очистки IgAl-протеазы, т.к. работы проводились с большими объемами культуральной жидкости N. meningitidis, которая относится к третьей группе микроорганизмов.
Из приведенных данных видно, что культуры нейссерий наиболее чувствительны к препаратам группы пенициллина, аминогликозидам и фторхинолонам. Различия по чувствительности к антибиотикам среди исследуемых штаммов были незначительными. Следует отметить, что штамм Niamey (серогруппа А) и штамм С 0638 (серогруппа С) более других устойчивы к левомецитину, полимиксину и тетрациклину. Исходя из этих данных, мы инактивировали выращенные культуры карбенициллином, как наиболее эффективным препаратом, причем в отдельных опытах было установлено, что он не ингибирует IgAl-протеазу. При выращивании культуры А-208 в биореакторе использовали дозу карбенициллина, приводящую гарантированно к гибели клеток в течение одного часа.
