Введение к работе
Актуальность темы. Основные направления современной биотехнологии предусматривают разработку сорбционных материалов и дальнейшее их применение в направлениях получения энзимоаналитических тест-систем, применяемых в областях медицины, сельского хозяйства и пищевой промышленности, а также конструирование высокоэффективных препаратов иммобилизованных ферментов, отличающихся термостабильностью, длительным сохранением активности.
Среди различных методов синтеза носителей для иммобилизации ферментов перспективно направление по технологии получения композиционных органскрэмнеземных сорбентов, основанное на химической сборке структурных единиц и методе формирования пористой структуры кремнеземных матриц в присутствии полимера и высокоселектиЕных лигандов (БрыкалоЕ, 1993). Данные носители отличаются стандартностью состава, исключают неспецифическую сорбцию, подверженность микробиологической атаке.
Для решения многих проблем в биохимии и биотехнологии проводятся исследования по определению активности энзимов в объектах растительного происхождения, что обусловленно влиянием ферментов на качество сельскохозяйственной продукции. Существующие методики определения активности знзимое, в частности уреазы, в биологических объектах имеют ряд недостатков (длительность экспозиции при инкубации, .низкие пределы чувствительности, трудоемкость операций) . Все это приводит к необходимости проведения научных исследований по разработке эффективных, высокоспецифичных методов, отличающихся простотой к воспроизводимостью, обеспечивающих получение достоверных данных при ферментативном анализе в различных биологических объектах.
В области медицины существует проблема разработки и применения эффективных диагностических тест-систем для обнаружения хели-кобактерной инфекции, отличающихся высоким уровнем специфичности, достоверности и доступности для* применения в малых специализированных лабораториях по гастроэнтерологии.
Цель работы. Разработка биотехнологии иммобилизованных фер1 ментов и твердофазных диагностико-аналитических тест-систем на основе композиционных органокремнеземных сорбентов и исследование их свойств.
Задачи:
получение композиционных органокремнеземных матриц с оптимальным составом и структурными характеристиками, легко поддающихся модифицированию и активированию для иммобилизации ферментов, ковалентного связывания лигандов диагностических тест-систем;
разработка методов иммобилизации ферментов (пепсина, липазы) с максимумом сохранения активности и стабильности;
исследование влияния параметров (рН, температура, кратность использования) на активность иммобилизованных ферментов;
разработка методов ковалентной иммобилизации индикатора шенолового красного на тьердом носителе с сохранением его свойств;
конструирование диагностических тест-систем для экспресс диагностики хеликобактер пилори (Y.pylori);
конструирование аналитических тест-систем для определения активности уреазы в биологических объектах.
Настоящие исследования по иммобилизации пепсина и липазы перспективны для разработки других твердофазных энзимных препаратов.
Научная новизна. Впервые на основе разработанных композиционных органокремнеземных носителей создана биотехнология иммобилизованных ферментов - липазы и пепсина, включающая адсорбцию и ковалектное связывание фермента с носителями, полученными методом формирования пористой структуры на осноеє двуокиси кремния (аэросила A-3S0), оксида железа (III) и органических компонентов синтеза полисахаридного полимера декстрана, а также т -аминопропшіт-риэтоксисилана, поверхность которых была активирована методами окисления, диазотирования и бензохиноноЕЫм методом. Данные методы позволили получить иммобилизованные препараты с сохранением активности липазы е пределах 88-99 %, а пепсина - до 100 Z.
Иммобилизованные препараты липазы по сравнению с растворимым Ферментом более чем на 35 'I термостабильнее, имеют оптимум активности при значении рН 7,9-8,3. Возможности направленной регуляции смещения рН оптимума активности иммобилизованной липазы и достижение максимального уровня энзимной активности определяются оптимизацией выбора матриц, их кислотно-основными свойствами, а также методом иммобилизации.
На основе композиционных органокремнеземных матриц получен
ТЕердофазный индикационный сорбент методом ковалентного связывания с носителем фенолового красного.
Сконструированы диагностические тест-системы для экспресс-диагностики хеликобактер пилори i.l-L pylori). Данные тест-системы характеризуются достоверностью и объективностью диагностики, возможностью многократного использования при соответствующих подготовительных операциях, имеют высокий уровень специфичности по уреазнои реакции, а также исключают дорогостоящее оборудование и могут быть использованы не только в крупных диагностических центрах, но и е лабораториях эндоскопии и гастроэнтерологии ЛЮбОГО УРОЕНЯ.
Для определения уреазнои активности в биогумусе, соевом молоке, почвах и других объектах Епервые разработана аналитическая тест-система на основе твердофазного индикатора, который при ферментативной реакции изменяет окраску с желтой в малиновую при значениях рН 7,4-9,2. Данная тест-система характеризуется низким пределом обнаружения активности уреазы (не менее 1СГб моль/л, а также простотой этапов проведения анализа и возможностью многоратного использования ферментспецифичного электрода.
Практическая значимость. На основе новых биотехнологических композиционных органокремнеземных сорбентов получены иммобилизованные препараты ферментов липазы и пепсина. Иммобилизованные препараты липазы были апробированы на кафедре технологии молока и молочных продуктов в лаборатории биохимии и биотехнологии Ставропольского технического университета. Данные препараты показали высокую эффективность при использовании в технологии получения лечебных продуктов для детского питания, что подтверждено заключением.
Сконструированные диагностические тест-системы прошли клинические испытания при диагностике Н. pylori больных язвенной болезнью в Ставропольском краевом диагностическом центре и детской городской клинической больнице им.Г.К.Филиппского. Результаты апробации с рекомендациями к внедрению в производство новых ТЕЄРДО-фазных тест-систем представлены в актах испытаний.
Для определения уреазнои активности в различных биологических объектах (соевое молоко, биогумус) сконструирована аналитическая тест-систе&а на основе твердофазного индикатора.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены: на науч-
- б -
ных конференциях Ставропольской государственной сельскохозяйственной академии в 1995, 1996, 1997 годах; на I конференции Северо-Кавказского региона по биотехнологии (Ставрополь, 1995 г.); на Всероссийской конференции по современным достижениям биотехнологии (Ставрополь, 1996 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 2 глав обзора литературы, ^ глав "собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 102 работы отечественных и 50 работ зарубежных авторов. Работа изложена на 151 странице машинописи, иллюстрирована 13 таблицами и 14 рисунками и 4 приложениями.